Fabrication de micro-tissus en utilisant des modules de gel de collagène cellules contenant

L’objectif global de cette procédure est de produire des micro-tissus modulaires qui peuvent être utilisés pour des expériences d’ingénierie tissulaire. Pour ce faire, il suffit d’abord de tirer la solution de collagène dans un tube de polyéthylène, à l’aide d’une seringue, puis de gélifier le collagène. La deuxième étape consiste à couper le tube en polyéthylène en longueurs de deux millimètres pour former les modules de micro-tissus.

La troisième étape de la procédure consiste à séparer les modules de la tubulure, et enfin, les modules sont recouverts de cellules endothéliales. En fin de compte, les microtissus résultants peuvent être utilisés pour des essais cellulaires in vitro afin d’étudier l’interaction des cellules via une chambre microfluidique. De plus, les microtissus peuvent être implantés pour générer des tissus permettant d’étudier l’interaction et le remodelage des microtissus in vivo.

Bonjour, je m’appelle Brendan Long du laboratoire Sepan de l’Université de Toronto. L’un des principaux obstacles à la création d’un grand substitut de tissu 3D est l’absence de vascularisation rapide après l’implantation. Dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment créer des tissus modulaires recouverts de cellules endothéliales pour aider à surmonter cette limitation.

La démonstration de la procédure sera considérée comme Chamberlain, un boursier post-opératoire du laboratoire Septin. La quantité de collagène à neutraliser dépendra de la longueur du tube en polyéthylène. Dans cette démonstration, nous utiliserons un tube en polyéthylène de deux mètres avec un diamètre intérieur de 0,76 millimètre et un diamètre extérieur de 1,22 millimètre.

Pour préparer le tube, enfilez une aiguille de 20 G dans une extrémité du tube, puis placez le tube dans un sac auto-cicatrisant pour la stérilisation au gaz. Étant donné qu’un millilitre de collagène remplit environ deux mètres de tube en polyéthylène, nous neutraliserons un millilitre de collagène. Placez le collagène dans un tube conique de 15 millilitres et maintenez le tube sur de la glace.

Ajoutez 128 microlitres de 10 x alpha, MEM par millilitre de collagène dans le tube et mélangez en pipetant la solution à plusieurs reprises. En prenant soin de minimiser la formation de bulles, la solution doit jaunir lorsque l’alpha MEM est mélangé au collagène acidifié. Ensuite, neutralisez le collagène en ajoutant 0,8 molaire de bicarbonate de sodium Pour une estimation générale du pH, ajoutez du bicarbonate de sodium jusqu’à ce que la solution de collagène jaune prenne une couleur rose clair.

Il faut généralement 30 à 60 microlitres par millilitre de collagène pour atteindre un pH de 7,4. Pour éviter que le collagène neutralisé ne gélifie, conservez-le sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé. Pour commencer la procédure de gélification du collagène, apportez le sac contenant le tube en polyéthylène stérilisé dans une enceinte de sécurité biologique et coupez l’extrémité scellée du sac tout en gardant le tube dans le sac.

À l’aide d’une pince à épiler stérilisée, fixez une seringue de trois millilitres à l’aiguille de calibre 20 qui a été préalablement insérée à une extrémité du tube. Insérez l’autre extrémité du tube dans le collagène neutralisé jusqu’à ce que l’extrémité se trouve au bas du tube conique, qui est maintenu sur de la glace. Cette prochaine étape, vous devez le faire lentement, sinon vous introduisez des bulles d’air dans le collagène.

Rétractez lentement le piston de la seringue pour tirer le collagène dans le tube en polyéthylène. Lorsque le collagène a été tiré à travers le tube, tirez l’aiguille de calibre 20 et remettez les deux extrémités du tube dans le sac. Après avoir fermé le sac avec du ruban adhésif, incubé à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes.

Un dispositif de coupe préassemblé sera utilisé pour couper le tube. Pour commencer cette procédure, placez le tube dans un plateau stérile devant le dispositif de coupe et chargez le tube dans le dispositif de coupe à la sortie du dispositif de coupe, installez un tube conique de 50 millilitres contenant 25 millilitres de milieu de cellule endothéliale. Pour collecter les modules coupés, réglez le dispositif de coupe pour couper des longueurs de deux millimètres de tubes, puis coupez le tube.

Incuber les modules coupés dans le tube conique de 50 millilitres à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Pour retirer les modules de collagène du tube, vortex, le tube conique de 50 litres contenant les modules à vitesse moyenne. Pendant 10 secondes, laissez le module se déposer au fond du tube, ce qui prend environ cinq minutes.

Une pastille lâche de modules se formera au fond du tube tandis que le tube formera une couche sur le dessus du support. Une fois que les modules se sont déposés, utilisez une pipette sérologique à large bouche de 10 millilitres pour les transférer dans un tube conique de 15 millilitres. Vortex, le tube conique de 15 millilitres, puis laissez les modules se stabiliser deux fois de plus.

Les modules décantés des deuxième et troisième vortex sont également transférés dans le tube de 15 millilitres. Une fois que tous les modules ont été retirés du tube et regroupés, portez le volume de média dans le tube à cinq millilitres. Les modules sont maintenant prêts pour l’enrobage avec des cellules endothéliales, qui seront montrées ci-dessous pour préparer les cellules endothéliales à l’enrobage des modules.

Tout d’abord, retirez le support des cellules et lavez-le avec du PBS. Après avoir retiré le PBS, ajoutez trois millilitres de trypsine EDTA et incubez pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, réanimez, suspendez les cellules dans sept millilitres de milieu et transférez-les dans un tube de 15 millilitres.

Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, vous aurez besoin de cinq fois 10 à la sixième cellules endothéliales par millilitre de modules emballés au fond du tube conique. Granulez les cellules à 300 G pendant cinq minutes. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de milieu cellulaire endothélial.

Ajoutez maintenant cinq millilitres de milieu contenant des cellules endothéliales dans les modules. Les modules sont incubés avec les cellules endothéliales, à la fois statiquement et dynamiquement pour l’incubation statique, mélangés avec des cellules endothéliales par inversion, puis placés le tube à la verticale à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après 15 minutes, retournez à nouveau le tube et incubez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes supplémentaires.

Pour incuber les modules avec les cellules endothéliales de manière dynamique, balancez doucement le tube de 15 millilitres à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Une fois l’incubation avec les cellules endothéliales terminée, transférez les modules dans une plaque non traitée pour la culture tissulaire et incubez pendant la nuit à 37 degrés Celsius le lendemain, placez les modules dans une nouvelle plaque non traitée pour la culture tissulaire avec un milieu frais pour éliminer les cellules endothéliales non attachées. Incuber des modules recouverts de cellules endothéliales à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules couvrent 100 % de la surface des modules.

Cela prend généralement environ sept jours. Les modules auront l’air cylindriques lorsqu’ils seront retirés pour la première fois du tube. S’ils sont recouverts de cellules endothéliales, ils peuvent se contracter jusqu’à 50 % de volume et développer une forme ovale, ainsi que devenir plus denses et plus opaques lorsqu’ils sont observés en microscopie optique.

Sur ces images, le diamètre et la longueur des modules sont indiqués respectivement par d et l. L’image suivante montre deux cellules d’hépatite G intégrées uniformément réparties dans les modules au moment de la fabrication. Les cellules ont conservé une grande viabilité, comme l’indique la couleur verte des cellules vivantes.

Les cellules mortes seraient de couleur rouge lorsque les cellules endothéliales sont confluentes. À la surface des modules, il y a une formation de jonctions serrées, qui peuvent être observées par immunofluorescence. La coloration de l’analyse du transfert de masse de cadhérine VE a démontré que les modules sont capables de supporter des densités cellulaires élevées sans développer un noyau nécrotique en raison d’un transport inadéquat de l’oxygène, ce qui est souvent problématique dans les tissus plus grands.

Dans cet exemple, la coloration massive de petits modules typiques montre que les modules ont conservé une distribution uniforme et élevée de cellules vivantes sept jours après la fabrication. En revanche, un grand nombre de cellules mortes s’étaient formées au cœur des grands modules, ne laissant qu’un mince rebord de cellules viables. Des modules ont également été produits avec un mélange de collagène et d’un polymère ine ou contenant des microsphères éluant des médicaments.

Ici, lorsque les cellules sont assises sur des modules de collagène palin, les modules conservent leur forme cylindrique et les propriétés d’attachement cellulaire sont limitées par rapport aux modules de collagène seul. Une image au microscope optique d’un module de collagène contenant des microsphères biodégradables à base de PLGA est présentée ici. Plusieurs essais in vitro se sont révélés compatibles avec les modules.

Par exemple, dans un test d’angiogenèse, les formations capillaires sur un module assis avec des cellules endothéliales peuvent être facilement détectées et quantifiées après cinq jours d’incubation avec des cellules souches dérivées de l’adipeux. Dans un autre exemple, les images de microscopie confocale d’un test de mort vivante sur des modules montrent des cellules vivantes colorées en vert et des cellules mortes colorées en rouge. Enfin, des modules ont également été utilisés dans des chambres microfluidiques et implantés chez des souris et des rats pour étudier l’interaction entre différents types de cellules et comment les microtissus sont remodelés par la réponse de l’hôte.

À la suite de la procédure, les modules peuvent être cultivés dans une boîte de Pétri ou d’autres récipients tels qu’un bioréacteur ou un dispositif microfluidique. Cette méthode peut également être adaptée pour créer différents tissus en utilisant diverses combinaisons de types de cellules ou en utilisant des tubes de diamètre différent. Merci d’avoir regardé.