Name: Fabrication de micro-tissus en utilisant des modules de gel de collagène cellules contenant (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Découvrez la fabrication de micro-tissus modulaires en collagène pour l'ingénierie tissulaire. Cette méthode utilise des gels cellulaires et des cellules endothéliales pour étudier les interactions cellulaires in vitro et in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Le financement a été fourni par le National Institutes of Health (EB 001 013), en sciences naturelles et en génie du Canada et les Instituts canadiens de recherche en santé. Nous remercions le Dr AP McGuigan pour son expertise et son aide dans l&#39;élaboration de modules.

1) Préparation des tubes <ol><li> Couper 2 à 3 m de longueur de tuyaux en polyéthylène (0,76 mm ID x 1,22 mm de diamètre extérieur). </li><li> Enfilez une aiguille 20 G1 à une extrémité du tube. </li><li> Enrouler le tube et le placer dans une auto-joint convertisseurs poche (7 1 / 2 "x 13"). Les deux extrémités de la tubulure doit être placé à la fin descellé du sac et scellés en place avec du ruban stérilisation au gaz. </li><li> Sceller le sac et le gaz stériliser. </li></ol> 2) Neutralisation de collagène Note: 1 ml de collagène remplit environ 2 m de tuyaux en polyéthylène. <ol><li> Placer la quantité nécessaire de collagène nécessaire à la longueur désirée du tube dans un tube de 15 ml conique et de garder sur la glace. </li><li> Ajouter 128 ul de 10x α-MEM par ml de collagène dans le tube et mélanger en pipetant plusieurs reprises la solution. Note: (1) La solution doit virer au jaune comme le α-MEM est mélangé dans le collagène acidifiés et (2) essayer de minimiser les bulles lors du mélange. </li><li> Neutraliser le collagène en ajoutant 0,8 M bicarbonate de sodium jusqu'à ce que le collagène a un pH de 7,4. Pour une estimation générale du bicarbonate de sodium ajouter du pH jusqu'à ce que la solution de collagène jaune vire au rose pâle. Nota: Il faut généralement de 30 à 60 pi pour chaque ml de collagène. </li><li> Gardez collagène neutralisé sur la glace jusqu'au moment de l'utiliser comme le collagène neutralisée sera un gel s'il n'est pas conservé à 4 ° C. </li></ol> 3) Intégrer des cellules (en option) Remarque: En fonction du type cellulaire, les cellules peuvent être intégrées à une concentration comprise entre 1 million de cellules par mL à 20 millions de cellules par ml. Utilisez le support requis pour les cellules que vous souhaitez intégrer. <ol><li> Retirez le support à partir des cellules et laver avec 5 ml de PBS. </li><li> Retirer du PBS et ajouter 3 ml de trypsine-EDTA. </li><li> Incuber les cellules dans de la trypsine-EDTA pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Resuspendre les cellules dans les médias ml 7. </li><li> Compter les cellules. </li><li> Transférer le nombre requis de cellules pour l'intégration à un tube de 15 ml conique. </li><li> Pellet les cellules à 300 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer les médias hors du culot cellulaire. </li><li> Resuspendre les cellules dans le collagène neutralisé et de garder sur la glace. </li></ol> 4) Gélification du collagène <ol><li> Dans une enceinte de sécurité biologique couper l'extrémité scellée du sac contenant les tuyaux en polyéthylène. </li><li> Attacher une seringue de 3 ml à l'aiguille 20G dans l'une des extrémités du tube en utilisant une pince à épiler stérilisée. Gardez le tuyau dans le sac. </li><li> Insérez l'autre extrémité du tuyau dans le collagène neutralisé jusqu'à la pointe est au fond du tube conique en utilisant une pince à épiler stérilisée. Garder le tube conique sur la glace. </li><li> Tirez le collagène dans les tuyaux en polyéthylène en rétractant le piston de la seringue lentement. Remarque: Si le collagène est tiré dans le tube à bulles rapidement puis se forme dans le collagène. </li><li> Après avoir tiré le collagène par le tube, retirez l'aiguille 20G sur de tubes et de mettre les deux extrémités dans le sac. Tape le sac fermé. </li><li> Incuber le sac à 37 ° C pendant 60 min. Si le collagène contient des cellules, puis retournez le sac sur toutes les 15 min. afin que les cellules ne sont pas réglées sur un côté du module. </li></ol> 5) Découpe de tubes contenant du collagène gélifié <ol><li> Têtes autoclave et la lame pour le dispositif de coupe et le bac à tenir tube. </li><li> Assemblez le dispositif de coupe. </li><li> Placer dans un tube de plateau stérile en face du dispositif de coupe et de charger le tube dans le dispositif de coupe. </li><li> Mettre en place un tube conique de 50 ml contenant 25 ml de médias à la sortie du dispositif de coupe pour recueillir les modules de coupe. Remarque: Utilisez les médias contenant FBS même pour le collagène seule modules comme les modules ne se séparent pas de la tubulure sans FBS dans les médias. Si les modules contiennent des cellules utiliser le support requis pour les cellules embarquées. S'il n'ya pas de cellules intégrées dans les modules utilisent les médias pour les cellules endothéliales. </li><li> Réglez le dispositif de coupe pour couper 2 mm de longueur de tube et couper le tuyau. </li><li> Incuber coupé modules à 37 ° C pendant 60 min dans le tube conique de 50 ml. </li></ol> 6) Suppression des modules du collagène à partir de tubes <ol><li> Vortex du tube conique de 50 ml contenant des modules dans le tube pendant 10 sec. Note: Soyez doux lorsque la séparation avec les modules intégrés à haute densité cellulaire pour éviter les bris. </li><li> Laissez les modules se déposent au fond du tube. Cela prend environ 5 min. </li><li> En utilisant une large bouche pipette de 10 ml sérologique transférer les modules installés dans un tube de 15 ml conique. </li><li> Répétez les étapes 6.1 à 6.3 fois. </li><li> Passez à l'étape 7 à des modules de revêtement avec des cellules endothéliales ou des modules de transfert à une plaque de culture tissulaire non traitée. </li></ol> 7) Revêtement des modules avec des cellules endothéliales <ol><li> Settle modules dans le fond d'un tube 15 ml conique avec 5 mL de médias pour ee intégré cellules. </li><li> Retirez le support à partir des cellules endothéliales et les laver avec 5 ml de PBS. </li><li> Retirer du PBS et ajouter 3 ml de trypsine-EDTA. </li><li> Incuber les cellules dans de la trypsine-EDTA pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Resuspendre les cellules dans les médias ml 7. </li><li> Compter les cellules. Besoin 5x10 6 cellules endothéliales par ml de modules emballé au fond du tube conique. </li><li> Pellet les cellules à 300 xg pendant 5 min et remettre en suspension dans 5 ml de cellules endothéliales des médias. </li><li> Ajouter les 5 ml du support contenant les cellules endothéliales des modules. Note: Ceci donne un ratio de 50:50 de la deux types de média que nous avons trouvé à travailler pour la survie et la fonction des deux types de cellules. Test de l'utilisation d'un moyen de co-culture formulés pour assurer le bon entretien des phénotypes des cellules deux types avant de l'utiliser. </li><li> Incuber les modules avec les cellules endothéliales à la fois statique et dynamique. </li><li> Pour statiques modules mélange d'incubation avec des cellules endothéliales par inversion et placer le tube en position verticale à 37 ° C pendant 15 min. Répéter. </li><li> Dynamiquement semences les cellules endothéliales en secouant délicatement le tube à 37 ° C pendant 60 min. </li><li> Répétez incubation statique à deux reprises. </li><li> Placez les modules dans une plaque de culture de tissus non traités et incuber une nuit à 37 ° C. </li><li> Le lieu le lendemain des modules dans une plaque de culture non de nouveaux tissus traités par du milieu frais (mélange 50:50 si vous utilisez le système de co-culture) pour enlever les seules cellules endothéliales. </li><li> Incuber les modules qui sont revêtus de cellules endothéliales jusqu'à ce qu'ils couvrent 100% de la surface des modules. Cela prend habituellement environ 7 jours. </li></ol> 8) Les résultats représentatifs: Les modules cylindriques se penchera la première fois qu'ils sont retirés du tube. Si les modules contiennent des cellules intégrées et / ou sont revêtues de cellules endothéliales, ils peuvent contracter jusqu'à 50% en volume et de développer une forme ovale (figure 1). Les modules seront également devenue plus dense et plus opaque lorsqu'il est vu par microscopie optique (figure 1). Aussi, quand les cellules endothéliales sont confluentes sur la surface des modules il ya une formation de jonctions serrées qui peuvent être vus par immunofluorescence de la VE-cadhérine (Figure 2). L'analyse de transfert de masse a montré que les modules sont capables de supporter de fortes densités cellulaires (8x10 7 cellules / cm 3) sans développer un noyau nécrotique due à transporter l'oxygène insuffisante, ce qui est souvent problématique dans les grandes tissus (par exemple des modules de grand diamètre, D = 1,4 mm) (figure 3). <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Module de fabrication et de contraction. Module de contraction s'est produite pendant les trois jours suivants HUVEC-C (ligne de cellules endothéliales) ensemencement des résultats de diamètre nettement plus petit module de et de la longueur (p &lt;0,001) (A). Embarqué cellules HepG2 ont été uniformément réparties dans les modules au moment de la fabrication et conservé une viabilité élevée (B). [Live cellules vertes; les cellules mortes rouge] [adapté de Corstorphine 2010] <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: VE-cadhérine en immunofluorescence des jonctions cellulaires serrées CE 10 jours après RAEC où enduit sur ​​la surface d'un module. Barre d'échelle = 50 microns. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3: coloration trichrome de Masson de modules typiques (0,76 mm de diamètre initial) et des modules de grande taille (1,4 mm de diamètre initial) démontrent l'effet des restrictions de diffusion d'oxygène. Sept jours après la fabrication, un grand nombre de cellules mortes avaient formé dans le noyau des modules de grande taille (panneau en bas à droite), ne laissant qu'une mince bordure (~ 200μm d'épaisseur) de cellules viables. Inversement, les petits modules conservé une distribution uniforme et élevé de cellules vivantes. [Modules intégrés aux cellules HepG2 et recouvert de cellules endothéliales.] [Tiré de Corstorphine 2010] <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4: (A) HMEC-1 ensemencées sur poloxamine - Modules de collagène. Après une journée de l'ensemencement des modules poloxamine-collagène conservent leur forme cylindrique et il est limité propriétés de fixation cellulaire par rapport à des modules de collagène seulement. Barre d'échelle = 200 pm. (B) image par microscopie lumineuse d'un module de collagène contenant PLGA basée sur des microsphères biodégradables. Barre d'échelle = 500 pm. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5: Exemples d'essais in vitro. Dosage de l'angiogenèse (A): capillaire comme des formations sur le module ensemencées avec des cellules endothéliales peuvent être facilement détectés et quantifiés après 5 jours d'incubation avec des cellules souches adipeuses. (B) des images de microscopie confocale d'un dosage de vivants / morts sur les modules où le scontenant des cellules vivantes est vert et pour les cellules mortes est rouge. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig6.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Figure 6: Les modules intégrés de collagène contenant les cellules souches mésenchymateuses et une couche de surface des cellules endothéliales. Les modules ont été exposés à un stress de cisaillement (~ 0,64 dyn / cm 2) pendant 7 jours dans une chambre microfluidique et commencent à montrer de fusion à des points de contact. Les cellules endothéliales sont colorées avec le vWF (marron) et mésenchymateuses noyaux de cellules souches apparaissent en bleu (H &amp; E). Barre d'échelle = 100 microns. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig7.jpg" alt="Figure 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 7"> Figure 7: des centaines de modules de collagène contenant des cellules souches adipeuses (ASC) et recouvert de cellules endothéliales microvasculaires humaines (HMEC) sont implantés sous la peau de souris pour étudier ASC / HMEC interaction in vivo pour les applications de la régénération de graisse.

<ol><li>Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+vessel+tissue+engineering+driven+by+endothelialized+modules%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules.</a> , (2010).</li>
<li>Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+factor+and+diffusion+limitations+in+collagen+gel+modules+containing+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2010).</li>
<li>Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+endothelialized+modular+constructs+implanted+in+an+omental+pouch+in+nude+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats.</a> Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).</li>
<li>Leung, B. M., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+tissue+engineering+construct+containing+smooth+muscle+cells+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells.</a> Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+cell-containing+gel+modules+to+assemble+modular+tissue-engineered+constructs+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected].</a> Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+organoid+engineered+by+modular+assembly+enables+blood+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+tissue+engineering%3A+fabrication+of+a+gelatin-based+construct%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct.</a> J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+sub-mm-sized+modules+containing+encapsulated+cells+for+modular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering.</a> Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+criteria+for+a+modular+tissue-engineered+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Design criteria for a modular tissue-engineered construct.</a> Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thrombogenicity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cell+seeded+collagen+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules.</a> Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).</li>
<li>Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen%2Fpoloxamine+hydrogels%3A+cytocompatibility+of+embedded+HepG2+cells+and+surface-attached+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells.</a> Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).</li>
</ol>

Nous avons fabriqué plusieurs tissus différents de micro-utilisant les modules intégrés aux différents types de cellules 1-11. Nous avons réussi à intégré les cardiomyocytes primaires, les îlots, les cellules souches adipeuses et les cellules stromales mésenchymateuses ainsi que plusieurs lignées cellulaires, y compris HepG2, NIH 3T3 et clone 9 cellules du foie. Nous avons recouvert les modules avec plusieurs types de cellules endothéliales aortiques de rat dont les cellules endothéliales, les cellules humain...

<table><tbody><tr><td>Tuyau Intramedic PE60</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>Un tuyau de diamètre différent peut être utilisé pour modifier le diamètre des modules</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Collagène Purcol acidifié, 3 mg/mL</td><td>Cedarlane Labs</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 20G</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td>Le diamètre de l'aiguille doit être similaire à celui du tuyau</td></tr><tr><td>Seringue de 3 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 15 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 50 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Poches autocellulantes Convertors 7 1/2&amp;#8221; x 13&amp;#8221;</td><td>Cardinal Health</td><td>92713</td><td></td></tr><tr><td>Pipette serologique de 10 ml à embout large</td><td>BD Biosciences</td><td>357504</td><td></td></tr><tr><td>Pipette serologique de 10 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Pipette serologique de 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>357543</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication de micro-tissus en utilisant des modules de gel de collagène cellules contenant

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

Ce protocole décrit la fabrication d&#39;un type de micro-tissus appelés modules. L&#39;approche module génère uniforme, les tissus extensibles et vascularisé. Les modules peuvent être faites de collagène ainsi que d&#39;autres matériaux gélifiable ou réticulables. Ils sont environ 2 mm de longueur et 0,7 mm de diamètre à la fabrication, mais diminuer en taille avec des cellules ou lorsque les modules sont recouverts avec des cellules endothéliales. Les modules individuellement sont suffisamment petits pour que les cellules sont intégrées dans la limite de diffusion de l&#39;oxygène et autres nutriments, mais les modules peuvent être emballés ensemble pour former de grands tissus qui sont perfusable. Ces tissus sont de conception modulaire, car différents types de cellules peuvent être intégrés dans ou enduit sur les modules avant qu&#39;ils ne soient emballés ensemble pour former des tissus complexes. Il ya trois étapes principales pour rendre les modules: (1) la neutralisation du collagène et d&#39;incorporation des cellules en elle, (2) gélification du collagène dans le tube et couper les modules et (3) revêtement des modules avec des cellules endothéliales.

Création de micro-tissus en utilisant des gels de collagène cylindriques, appelés modules, qui contiennent des cellules embarqués et dont la surface est recouverte de cellules endothéliales.

Fabrication de micro-tissus en utilisant des modules de gel de collagène cellules contenant

Ce protocole décrit la fabrication d'un type de micro-tissus appelés modules. L'approche par modules génère des structures uniformes, évolutives et vascularisées...

L'objectif général de cette procédure est de produire des micro-tissus modulaires pouvant être utilisés pour des expériences d'ingénierie tissulaire. Cela est réalisé en aspirant d'abord la solution de collagène dans un tube en polyéthylène à l'aide d'une seringue, puis en gélatinisant le collagène. La deuxième étape consiste à couper le tube en polyéthylène en segments de deux millimètres pour former les modules de micro-tissus.La troisième étape de la procédure consiste à séparer les modules du tube, puis, enfin, à recouvrir les modules de cellules endothéliales. En définitive, les micro-tissus obtenus peuvent être utilisés pour des tests cellulaires in vitro afin d'étudier l'interaction entre cellules au moyen d'une chambre microfluidique. De plus, les micro-tissus peuvent être implantés pour générer des tissus permettant d'étudier l'interaction et le remodelage des micro-tissus in vivo.Bonjour, je m'appelle Brendan Long du laboratoire Sepan à l'Université de Toronto. L'un des principaux obstacles à la création de substituts tissulaires tridimensionnels de grande taille est l'absence d'une vascularisation rapide après l'implantation. Dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment créer des tissus modulaires recouverts de cellules endothéliales afin de surmonter cette limitation.La démonstration de la procédure sera effectuée par Deem Chamberlain, chercheur postdoctoral du laboratoire Septin. La quantité de collagène à neutraliser dépendra de la longueur du tube en polyéthylène. Dans cette démonstration, nous utiliserons un tube en polyéthylène de deux mètres de long, avec un diamètre intérieur de 0,76 millimètre et un diamètre extérieur de 1,22 millimètre.Pour préparer le tube, introduisez une aiguille de calibre 20 dans une extrémité du tube, puis placez le tube dans une poche auto-réparable de convertisseur pour stérilisation gazeuse. Puisqu'un millilitre de collagène remplit environ deux mètres de tube en polyéthylène, nous allons neutraliser un millilitre de collagène. Placez le collagène dans un tube conique de 15 millilitres et maintenez le tube sur de la glace.Ajouter 128 microlitres de 10 x alpha MEM par millilitre de collagène dans le tube et mélanger en pipetant répétitivement la solution. En prenant soin de minimiser la formation de bulles, la solution doit devenir jaune lorsque l'alpha MEM est mélangé au collagène acidifié. Ensuite, neutraliser le collagène en ajoutant du bicarbonate de sodium 0,8 molaire. Pour une estimation générale du pH, ajouter du bicarbonate de sodium jusqu'à ce que la solution de collagène jaune devienne d'une couleur rose pâle.Il faut généralement entre 30 et 60 microlitres par millilitre de collagène pour obtenir un pH de 7,4. Pour éviter que le collagène neutralisé ne gélifie, conservez-le sur de la glace jusqu'à son utilisation. Pour commencer la procédure de gélification du collagène, prenez le sachet contenant les tubes en polyéthylène stérilisés et placez-le dans une cabine de sécurité biologique, puis coupez l'extrémité scellée du sachet tout en maintenant les tubes à l'intérieur du sachet.Utilisez des pinces stérilisées pour fixer une seringue de trois millilitres à l'aiguille de calibre 20 qui a été précédemment insérée à une extrémité du tube. Insérez l'autre extrémité du tube dans le collagène neutralisé jusqu'à ce que la pointe soit au fond du tube conique, maintenu sur de la glace. Vous devez effectuer cette étape suivante lentement, sinon vous introduisez des bulles d'air dans le collagène.Retirer lentement le piston de la seringue pour aspirer le collagène dans le tube en polyéthylène. Une fois que le collagène a été aspiré à travers le tube, retirer l'aiguille de calibre 20 et replacer les deux extrémités du tube dans le sachet. Après avoir fermé le sachet avec du ruban adhésif, incuber à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes.Un dispositif de coupe préassemblé sera utilisé pour couper le tube. Pour commencer cette procédure, placez le tube dans un plateau stérile devant le dispositif de coupe et insérez le tube dans le dispositif de coupe à la sortie de celui-ci. Préparez un tube conique de 50 millilitres contenant 25 millilitres de milieu pour cellules endothéliales. Pour récupérer les modules découpés, réglez le dispositif de coupe afin de produire des segments de tube de deux millimètres de longueur, puis effectuez la coupe du tube.Incuber les modules découpés dans un tube conique de 50 millilitres à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Pour retirer les modules de collagène du tube, faire tourbillonner le tube conique de 50 litres contenant les modules à vitesse moyenne. Laisser le module se déposer au fond du tube pendant 10 secondes, ce qui prend environ cinq minutes.Un culot lâche de modules se formera au fond du tube, tandis que les tubules formeront une couche en surface du milieu. Une fois les modules décantés, utilisez une pipette serologique de 10 millilitres à embout large pour les transférer dans un tube conique de 15 millilitres. Vortexez le tube conique de 15 millilitres, puis laissez les modules se déposer encore deux fois.Les modules déposés provenant du deuxième et du troisième vortex sont également transférés dans l'éprouvette de 15 millilitres. Une fois que tous les modules ont été retirés du tube et regroupés, ajustez le volume de milieu dans l'éprouvette à cinq millilitres. Les modules sont désormais prêts à être enrobés de cellules endothéliales, ce qui sera montré ensuite pour préparer les cellules endothéliales à recouvrir les modules.Commencez par retirer le milieu des cellules et rincez avec du PBS. Après avoir retiré le PBS, ajoutez trois millilitres de trypsine EDTA et incubez cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, resuspendez les cellules dans sept millilitres de milieu et transférez-les dans un tube de 15 millilitres.Comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre ; vous aurez besoin de cinq fois 10 à la puissance 6 cellules endothéliales par millilitre de modules compactés au fond du tube conique. Faites tomber les cellules par centrifugation à 300 ×g pendant cinq minutes. Resuspendez le culot cellulaire dans cinq millilitres de milieu pour cellules endothéliales.Ajoutez maintenant cinq millilitres de milieu contenant des cellules endothéliales aux modules. Les modules sont incubés avec les cellules endothéliales, à la fois statiquement et dynamiquement : pour l'incubation statique, mélangez les modules avec les cellules endothéliales par retournement, puis placez le tube à l'aplomb à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après 15 minutes, retournez à nouveau le tube et incubez à 37 degrés Celsius pendant encore 15 minutes.Pour incuber dynamiquement les modules avec les cellules endothéliales, agiter doucement le tube de 15 millilitres à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Une fois l'incubation avec les cellules endothéliales terminée, transférer les modules dans une plaque non traitée pour culture tissulaire et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le jour suivant, placer les modules dans une nouvelle plaque non traitée pour culture tissulaire contenant un milieu frais afin d'éliminer les cellules endothéliales non attachées. Incuber les modules recouverts de cellules endothéliales à 37 degrés Celsius jusqu'à ce que les cellules recouvrent 100 % de la surface des modules.Cela prend généralement environ sept jours. Les modules auront une forme cylindrique lorsqu’ils seront retirés pour la première fois du tube. S’ils sont recouverts de cellules endothéliales, ils peuvent rétrécir jusqu’à 50 % en volume et prendre une forme ovale, tout en devenant plus denses et plus opaques lorsqu’observés au microscope optique.Dans ces images, le diamètre et la longueur des modules sont indiqués respectivement par d et l. Cette image suivante montre des cellules Hep G2 intégrées, uniformément réparties dans les modules au moment de leur fabrication. Les cellules ont conservé une viabilité élevée, indiquée par la couleur verte des cellules vivantes.Les cellules mortes apparaîtront en rouge lorsque les cellules endothéliales seront confluentes. À la surface des modules, une formation de jonctions serrées peut être observée par immunofluorescence. La coloration de la VE-cadhérine lors de l'analyse du transfert de masse a démontré que les modules sont capables de soutenir des densités cellulaires élevées sans développer de cœur nécrotique dû à un transport insuffisant d'oxygène, ce qui pose souvent problème dans les tissus plus volumineux.Dans cet exemple, la coloration par le trichrome de Masson de modules petits typiques montre que les modules ont conservé une distribution uniforme et élevée de cellules vivantes sept jours après leur fabrication. En revanche, un grand nombre de cellules mortes s'étaient formées au cœur des modules de grande taille, ne laissant qu'un mince pourtour de cellules viables. Des modules ont également été produits à l'aide d'un mélange de collagène et d'un polymère a ine ou contenant des microsphères libérant un médicament.Ici, lorsque les cellules h hm EC sont cultivées sur des modules de collagène contenant du palin, les modules conservent leur forme cylindrique et présentent des propriétés d'attachement cellulaire limitées par rapport aux modules de collagène seul. Une image au microscope optique d'un module de collagène contenant des microsphères biodégradables à base de PLGA est présentée ici. Plusieurs tests in vitro se sont révélés compatibles avec ces modules.Par exemple, dans un test d'angiogenèse, des formations semblables à des capillaires sur un module ensemencé avec des cellules endothéliales peuvent être facilement détectées et quantifiées après cinq jours d'incubation avec des cellules souches dérivées du tissu adipeux. Dans un autre exemple, des images de microscopie confocale d'un test vivant-mort sur des modules montrent les cellules vivantes colorées en vert et les cellules mortes colorées en rouge. Enfin, les modules ont également été utilisés dans des chambres microfluidiques et implantés chez des souris et des rats afin d'étudier l'interaction entre différents types cellulaires et la manière dont les microtissus sont remodelés par la réponse de l'hôte.Après la procédure, les modules peuvent être cultivés dans une boîte de Pétri ou d'autres récipients tels qu'un bioréacteur ou un dispositif microfluidique. Cette méthode peut également être adaptée pour créer différents tissus en utilisant diverses combinaisons de types cellulaires ou des tubes de diamètres différents. Merci d'avoir regardé.

fabrication-micro-tissues-using-modules-collagen-gel-containing

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Ici, nous démontrons la fabrication de base de collagène, le tissu des constructions contenant myoblastes squelettiques. Ces constructions en 3-D modifiés peuvent être utilisés pour remplacer ou réparer des...

Fabrication de constructions myogéniques de l&#39;ingénierie tissulaire

Une méthode est décrite pour la préparation d'une matrice tridimensionnelle composée de collagène de type I et de fibroblastes humains primaires. Ce gel organotypique constitue un substrat utile pour évaluer la migration cellulaire invasive, car il imite les caractéristiques fondamentales du stroma tissulaire et se prête à de nombreuses formes de microscopie.

Organotypiques de collagène I Dosage: Une plate-forme malléable pour évaluer le comportement des cellules dans un contexte 3-Dimensional

Ce système de modèle commence à partir d'un gel de fibrine myofibroblastes peuplée qui peut être utilisé pour étudier collagène endogène (ré) organisation en temps réel de façon non destructive. Le système de modèle est très accordable, comme il peut être utilisé avec des sources différentes de cellules, des additifs moyen, et peut être adapté facilement à des besoins spécifiques.

Ingénierie à base de fibrine constructions de tissu de myofibroblastes et application des contraintes et de déformation à Provoquer Organisation cellulaire et collagène (Re)

Dans ce travail, nous présentons une technique de fabrication rapide de tissus vasculaires vivants par culture directe de collagène, de cellules musculaires lisses et de cellules endothéliales. De plus, un nouveau protocole pour la caractérisation mécanique des tissus vasculaires modifiés est décrit.

Ingénierie 3D cellularisé collagène Gels pour la régénération tissulaire vasculaire

L'ingénierie tissulaire comprend souvent dans l'expansion in vitro dans le but de créer des autogreffes pour la régénération tissulaire. Dans cette étude, un procédé pour l'expansion des tissus, la régénération, la reconstruction et in vivo a été mis au point afin de réduire la transformation des cellules et des matières biologiques en dehors du corps.

Tissu haché en comprimé Collagen: Un Biotransplant contenant des cellules de réparation Reconstructive simple mise en scène

La création de microtissus fonctionnels dans les dispositifs microfluidiques nécessite la stabilisation des phénotypes cellulaires en adaptant les techniques traditionnelles de culture cellulaire aux dimensions spatiales limitées des microdispositifs. La modification du collagène permet le dépôt couche par couche d’assemblages de collagène ultraminces qui peuvent stabiliser les cellules primaires, telles que les hépatocytes, en tant que modèles de tissus microfluidiques.

Couche par couche dépôt de collagène dans les dispositifs microfluidiques pour Microbroyeur stabilisation

Le collagène est une composante essentielle de l'ECM, et fournit des indices essentiels pour plusieurs processus cellulaires allant de la migration vers la différenciation et la prolifération. Pourvu ici est un protocole pour l'intégration des cellules dans les hydrogels de collagène 3D, et une technique plus avancée pour générer des matrices de collagène randomisées ou alignées à l'aide de microcanaux PDMS.

Préparation de la 3D collagène Gels et microcanaux pour l&#39;étude des interactions 3D<em&gt; In Vivo</em

Ce manuscrit décrit une technique à base de lithographie douce pour concevoir des tableaux uniformes en trois dimensions (3D) tissus épithéliaux de géométrie définie entourées par la matrice extracellulaire. Cette méthode se prête à une grande variété de types de cellules et dans des contextes expérimentaux et permet un criblage à haut débit de répétitions identiques.

Ingénierie en trois dimensions des tissus épithéliaux incorporés au sein de la matrice extracellulaire

Ce protocole décrit la fabrication de microcryogels élastique macroporeux 3D en intégrant la microfabrication avec la technologie cryogelation. Lorsqu’il se charge avec des cellules, microtissues 3D sont générés, qui peut être facilement injecté in vivo pour faciliter la thérapie régénérative ou assemblés dans des tableaux pour in vitro le dépistage des drogues de haut débit.

Microtissues 3D pour thérapie régénérative Injectable et de dépistage des drogues de haut débit

Ce protocole démontre l’utilisation d’un canal microfluidique avec une géométrie changeante le long de la direction d’écoulement du fluide pour générer une déformation d’extension (étirement) afin d’aligner les fibres dans un hydrogel de collagène 3D (&lt;250 μm d’épaisseur). L’alignement résultant s’étend sur plusieurs millimètres et est influencé par la vitesse de déformation extensionnelle.

Hydrogels de collagène 3D Microtechnique avec alignement de fibres à longue portée

Le protocole suivant présente une méthode d’extrusion basée sur le cisaillement pour la fabrication d’hydrogels de collagène avec des fibrilles à motifs nanométriques, qui peut être appliquée à un large éventail d’applications d’ingénierie tissulaire.

Production de collagène à motifs nanofibrillaires pour l’ingénierie tissulaire

Découvrez la fabrication de micro-tissus modulaires en collagène pour l'ingénierie tissulaire. Cette méthode utilise des gels cellulaires et des cellules endothéliales pour étudier les interactions cellulaires in vitro et in vivo.

Fabrication de micro-tissus en utilisant des modules de gel de collagène cellules contenant

Explorer plus de vidéos