Fabrication de micro-tissus en utilisant des modules de gel de collagène cellules contenant

L'objectif général de cette procédure est de produire des micro-tissus modulaires pouvant être utilisés pour des expériences d'ingénierie tissulaire. Cela est réalisé en aspirant d'abord la solution de collagène dans un tube en polyéthylène à l'aide d'une seringue, puis en gélatinisant le collagène. La deuxième étape consiste à couper le tube en polyéthylène en segments de deux millimètres pour former les modules de micro-tissus.

La troisième étape de la procédure consiste à séparer les modules du tube, puis, enfin, à recouvrir les modules de cellules endothéliales. En définitive, les micro-tissus obtenus peuvent être utilisés pour des tests cellulaires in vitro afin d'étudier l'interaction entre cellules au moyen d'une chambre microfluidique. De plus, les micro-tissus peuvent être implantés pour générer des tissus permettant d'étudier l'interaction et le remodelage des micro-tissus in vivo.

Bonjour, je m'appelle Brendan Long du laboratoire Sepan à l'Université de Toronto. L'un des principaux obstacles à la création de substituts tissulaires tridimensionnels de grande taille est l'absence d'une vascularisation rapide après l'implantation. Dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment créer des tissus modulaires recouverts de cellules endothéliales afin de surmonter cette limitation.

La démonstration de la procédure sera effectuée par Deem Chamberlain, chercheur postdoctoral du laboratoire Septin. La quantité de collagène à neutraliser dépendra de la longueur du tube en polyéthylène. Dans cette démonstration, nous utiliserons un tube en polyéthylène de deux mètres de long, avec un diamètre intérieur de 0,76 millimètre et un diamètre extérieur de 1,22 millimètre.

Pour préparer le tube, introduisez une aiguille de calibre 20 dans une extrémité du tube, puis placez le tube dans une poche auto-réparable de convertisseur pour stérilisation gazeuse. Puisqu'un millilitre de collagène remplit environ deux mètres de tube en polyéthylène, nous allons neutraliser un millilitre de collagène. Placez le collagène dans un tube conique de 15 millilitres et maintenez le tube sur de la glace.

Ajouter 128 microlitres de 10 x alpha MEM par millilitre de collagène dans le tube et mélanger en pipetant répétitivement la solution. En prenant soin de minimiser la formation de bulles, la solution doit devenir jaune lorsque l'alpha MEM est mélangé au collagène acidifié. Ensuite, neutraliser le collagène en ajoutant du bicarbonate de sodium 0,8 molaire. Pour une estimation générale du pH, ajouter du bicarbonate de sodium jusqu'à ce que la solution de collagène jaune devienne d'une couleur rose pâle.

Il faut généralement entre 30 et 60 microlitres par millilitre de collagène pour obtenir un pH de 7,4. Pour éviter que le collagène neutralisé ne gélifie, conservez-le sur de la glace jusqu'à son utilisation. Pour commencer la procédure de gélification du collagène, prenez le sachet contenant les tubes en polyéthylène stérilisés et placez-le dans une cabine de sécurité biologique, puis coupez l'extrémité scellée du sachet tout en maintenant les tubes à l'intérieur du sachet.

Utilisez des pinces stérilisées pour fixer une seringue de trois millilitres à l'aiguille de calibre 20 qui a été précédemment insérée à une extrémité du tube. Insérez l'autre extrémité du tube dans le collagène neutralisé jusqu'à ce que la pointe soit au fond du tube conique, maintenu sur de la glace. Vous devez effectuer cette étape suivante lentement, sinon vous introduisez des bulles d'air dans le collagène.

Retirer lentement le piston de la seringue pour aspirer le collagène dans le tube en polyéthylène. Une fois que le collagène a été aspiré à travers le tube, retirer l'aiguille de calibre 20 et replacer les deux extrémités du tube dans le sachet. Après avoir fermé le sachet avec du ruban adhésif, incuber à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes.

Un dispositif de coupe préassemblé sera utilisé pour couper le tube. Pour commencer cette procédure, placez le tube dans un plateau stérile devant le dispositif de coupe et insérez le tube dans le dispositif de coupe à la sortie de celui-ci. Préparez un tube conique de 50 millilitres contenant 25 millilitres de milieu pour cellules endothéliales. Pour récupérer les modules découpés, réglez le dispositif de coupe afin de produire des segments de tube de deux millimètres de longueur, puis effectuez la coupe du tube.

Incuber les modules découpés dans un tube conique de 50 millilitres à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Pour retirer les modules de collagène du tube, faire tourbillonner le tube conique de 50 litres contenant les modules à vitesse moyenne. Laisser le module se déposer au fond du tube pendant 10 secondes, ce qui prend environ cinq minutes.

Un culot lâche de modules se formera au fond du tube, tandis que les tubules formeront une couche en surface du milieu. Une fois les modules décantés, utilisez une pipette serologique de 10 millilitres à embout large pour les transférer dans un tube conique de 15 millilitres. Vortexez le tube conique de 15 millilitres, puis laissez les modules se déposer encore deux fois.

Les modules déposés provenant du deuxième et du troisième vortex sont également transférés dans l'éprouvette de 15 millilitres. Une fois que tous les modules ont été retirés du tube et regroupés, ajustez le volume de milieu dans l'éprouvette à cinq millilitres. Les modules sont désormais prêts à être enrobés de cellules endothéliales, ce qui sera montré ensuite pour préparer les cellules endothéliales à recouvrir les modules.

Commencez par retirer le milieu des cellules et rincez avec du PBS. Après avoir retiré le PBS, ajoutez trois millilitres de trypsine EDTA et incubez cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, resuspendez les cellules dans sept millilitres de milieu et transférez-les dans un tube de 15 millilitres.

Comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre ; vous aurez besoin de cinq fois 10 à la puissance 6 cellules endothéliales par millilitre de modules compactés au fond du tube conique. Faites tomber les cellules par centrifugation à 300 ×g pendant cinq minutes. Resuspendez le culot cellulaire dans cinq millilitres de milieu pour cellules endothéliales.

Ajoutez maintenant cinq millilitres de milieu contenant des cellules endothéliales aux modules. Les modules sont incubés avec les cellules endothéliales, à la fois statiquement et dynamiquement : pour l'incubation statique, mélangez les modules avec les cellules endothéliales par retournement, puis placez le tube à l'aplomb à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après 15 minutes, retournez à nouveau le tube et incubez à 37 degrés Celsius pendant encore 15 minutes.

Pour incuber dynamiquement les modules avec les cellules endothéliales, agiter doucement le tube de 15 millilitres à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Une fois l'incubation avec les cellules endothéliales terminée, transférer les modules dans une plaque non traitée pour culture tissulaire et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le jour suivant, placer les modules dans une nouvelle plaque non traitée pour culture tissulaire contenant un milieu frais afin d'éliminer les cellules endothéliales non attachées. Incuber les modules recouverts de cellules endothéliales à 37 degrés Celsius jusqu'à ce que les cellules recouvrent 100 % de la surface des modules.

Cela prend généralement environ sept jours. Les modules auront une forme cylindrique lorsqu’ils seront retirés pour la première fois du tube. S’ils sont recouverts de cellules endothéliales, ils peuvent rétrécir jusqu’à 50 % en volume et prendre une forme ovale, tout en devenant plus denses et plus opaques lorsqu’observés au microscope optique.

Dans ces images, le diamètre et la longueur des modules sont indiqués respectivement par d et l. Cette image suivante montre des cellules Hep G2 intégrées, uniformément réparties dans les modules au moment de leur fabrication. Les cellules ont conservé une viabilité élevée, indiquée par la couleur verte des cellules vivantes.

Les cellules mortes apparaîtront en rouge lorsque les cellules endothéliales seront confluentes. À la surface des modules, une formation de jonctions serrées peut être observée par immunofluorescence. La coloration de la VE-cadhérine lors de l'analyse du transfert de masse a démontré que les modules sont capables de soutenir des densités cellulaires élevées sans développer de cœur nécrotique dû à un transport insuffisant d'oxygène, ce qui pose souvent problème dans les tissus plus volumineux.

Dans cet exemple, la coloration par le trichrome de Masson de modules petits typiques montre que les modules ont conservé une distribution uniforme et élevée de cellules vivantes sept jours après leur fabrication. En revanche, un grand nombre de cellules mortes s'étaient formées au cœur des modules de grande taille, ne laissant qu'un mince pourtour de cellules viables. Des modules ont également été produits à l'aide d'un mélange de collagène et d'un polymère a ine ou contenant des microsphères libérant un médicament.

Ici, lorsque les cellules h hm EC sont cultivées sur des modules de collagène contenant du palin, les modules conservent leur forme cylindrique et présentent des propriétés d'attachement cellulaire limitées par rapport aux modules de collagène seul. Une image au microscope optique d'un module de collagène contenant des microsphères biodégradables à base de PLGA est présentée ici. Plusieurs tests in vitro se sont révélés compatibles avec ces modules.

Par exemple, dans un test d'angiogenèse, des formations semblables à des capillaires sur un module ensemencé avec des cellules endothéliales peuvent être facilement détectées et quantifiées après cinq jours d'incubation avec des cellules souches dérivées du tissu adipeux. Dans un autre exemple, des images de microscopie confocale d'un test vivant-mort sur des modules montrent les cellules vivantes colorées en vert et les cellules mortes colorées en rouge. Enfin, les modules ont également été utilisés dans des chambres microfluidiques et implantés chez des souris et des rats afin d'étudier l'interaction entre différents types cellulaires et la manière dont les microtissus sont remodelés par la réponse de l'hôte.

Après la procédure, les modules peuvent être cultivés dans une boîte de Pétri ou d'autres récipients tels qu'un bioréacteur ou un dispositif microfluidique. Cette méthode peut également être adaptée pour créer différents tissus en utilisant diverses combinaisons de types cellulaires ou des tubes de diamètres différents. Merci d'avoir regardé.