Micro-Mécanique de caractérisation du tissu pulmonaire par microscopie à force atomique

L'objectif général de l'expérience suivante est de caractériser l'environnement mécanique local du parenchyme pulmonaire à une échelle spatiale pertinente pour les cellules résidentes, en mesurant directement les propriétés élastiques locales de tissu pulmonaire frais par micro-indention à l'aide d'un microscope à force atomique (AFM). Cette approche consiste à découper le tissu pulmonaire de souris gonflé à l'agarose à l'aide d'un rasoir ou d'une lame de scalpel, afin de préparer des bandes de parenchyme pulmonaire mesurant cinq millimètres de longueur sur cinq millimètres de largeur, et d'une épaisseur de 400 micromètres. Ensuite, les bandes de tissu pulmonaire non fixées et non perméabilisées sont soumises à une immunomarquage, permettant d'identifier les zones d'intérêt pour la micro-indention AFM.

Ensuite, une micro-indenteuse en mode force (FM) est effectuée sur des bandes de tissu dans du PBS à température ambiante. Afin de mesurer directement les propriétés élastiques locales du tissu pulmonaire frais, des résultats sont obtenus. Ceux-ci montrent des différences marquées dans l’étendue et la distribution de la rigidité tissulaire dans le parenchyme pulmonaire normal et fibrotique, ainsi que de grandes variations spatiales de la rigidité, en particulier au sein de l’échantillon pulmonaire fibrotique.

Basé sur des cartes de rigidité extraites à partir de courbes de déplacement forcé obtenues à l'aide d'une micro-indenteuse FM. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'étirement de bandes de tissu, est qu'elle offre une résolution spatiale sans précédent, fournissant ainsi une perspective unique sur les variations à l'échelle microscopique de la rigidité tissulaire. Cette mesure peut aider à répondre à des questions essentielles, telles que la manière dont la rigidité varie spatialement au sein du tissu, ainsi que l'ampleur et l'échelle spatiale des modifications de rigidité dans la maladie.

Les processus qui entraînent la remodélisation tissulaire : pour préparer des bandes de tissu pulmonaire, commencez par stabiliser la structure du poumon afin de permettre la découpe, en insufflant dans des poumons de souris isolés 50 millilitres par kilogramme de poids corporel d'agarose à 2 % à bas point de gélification, préparée dans du PBS. Ligaturez la trachée et refroidissez les poumons insufflés dans un bain de PBS à quatre degrés Celsius pendant 60 minutes. L'agarose gélifiera et se rigidifiera dans les espaces aériens, stabilisant ainsi délicatement la structure pulmonaire. Pendant cet intervalle, à l’aide d’un rasoir ou d’un scalpel, découpez le tissu pulmonaire de souris stabilisé par l’agarose en bandes d’environ cinq millimètres de longueur et de largeur, et de 400 micromètres d’épaisseur.

Ensuite, lavez les bandes dans du PBS à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes pour éliminer les résidus d'aros, afin d'exclure les grosses voies aériennes et les vaisseaux. Coupez des bandes dans les régions sous-pleurales éloignées des bronches principales si les voies aériennes et les gros vaisseaux doivent être observés ; pour imager des zones d'intérêt plus proches des bronches principales, coupez des bandes dans le tissu pulmonaire plus proche des bronches principales afin d'isoler les régions d'intérêt pour une micro-indenteation AFM. Visualisez le tissu par microscopie de contraste de phase ou par immunomarquage, et observez par microscopie de fluorescence.

Voir la partie écrite de ce protocole pour la procédure. Juste avant une caractérisation par FM, fixer les bandes de tissu sur des lamelles de 15 millimètres revêtues de poly-L-lysine en soulevant la lamelle depuis le bas du tissu flottant, en veillant à ce que la bande de tissu s'étale uniformément sur la surface de la lamelle. Si nécessaire, placer la bande entre une deuxième lamelle propre non revêtue et appliquer une légère pression pour faciliter l'attachement du tissu à la lamelle revêtue de poly-L-lysine.

Étalonner le système A FM en suivant les instructions du fabricant immédiatement avant chaque série d'expériences de micro-indention. Pour cela, déterminer deux paramètres critiques : la constante de raideur du levier à l'aide de la méthode des fluctuations thermiques dans l'air, et la sensibilité de déflexion du levier, qui est un paramètre utilisé pour convertir le signal de sortie du photodétecteur en la distance réelle de déflexion du levier.

Étalonnez la sensibilité de déflexion en obtenant une courbe standard de force-déplacement dans du PBS sur une lame de verre propre. Calculez ensuite la pente de la courbe force-déplacement dans la mesure de la courbe force-déplacement. La pointe A FM est approchée puis retirée de la surface de l'échantillon en un seul point, la déflexion du levier delta D étant surveillée en fonction du déplacement de la pointe delta Z. Il est recommandé d'utiliser un levier en nitrure de silicium de forme triangulaire, muni d'une pointe sphérique en silicate de bore de cinq micromètres de diamètre, avec des sondes A FM ayant une constante de ressort de 0,06 newton par mètre.

Nous avons caractérisé mécaniquement des matériaux mous dont le module de cisaillement s'étend de 100 à 50 000 pascals. Essuyez la surface inférieure de la lame de couverture avec du papier absorbant, puis fixez-la à une lame de verre standard à l'aide de graisse à vide. Montez la lame de verre sur le porte-échantillon de la MFA et recouvrez le tissu de 500 microlitres de PBS à température ambiante.

Ensuite, placez la tête de balayage AFM au-dessus de l'échantillon. Réglez le plateau de microscope pour positionner l'échantillon de manière à observer par les oculaires et à aligner la pointe AFM au centre du champ de vision. Déplacez le plateau de l'échantillon AFM pour sélectionner une zone d'intérêt sur le tissu.

Ensuite, passez à la visualisation par caméra CCD pour enregistrer l’image de contraste de phase et/ou des images de fluorescence du tissu selon les besoins. Déplacez lentement la pointe AFM vers le bas jusqu’à ce qu’elle entre en contact précis avec l’échantillon. La caractérisation par micro-indentation AFM d’échantillons mous exige de faibles profondeurs d’indentation afin d’éviter de grandes déformations locales, ce qui invaliderait le modèle de Hertz utilisé pour le calcul du module d’élasticité. Pour éviter de grandes déformations, effectuez l’indentation en mode déclenchement en réglant la déflexion maximale du levier à 500 nanomètres.

La limite de déflexion maintiendra la force d'indentation maximale en dessous de 30 nanonewtons. La vitesse d'indentation doit être choisie suffisamment lente pour explorer les propriétés élastiques plutôt que viscoélastiques de l'échantillon mou. Sélectionnez une plage de vitesse de deux à 20 micromètres par seconde pour un tissu pulmonaire, pour une mesure unique provenant d'une zone d'intérêt.

Déplacez la sonde A FM jusqu'à l'emplacement d'intérêt et effectuez une indentation unique afin d'acquérir une courbe force-déplacement standard. La sonde ne se déplacera que dans la direction Z. Pour cartographier automatiquement une région d'intérêt, passez en mode cartographie de force, sélectionnez la taille du balayage et les points d'échantillonnage dans la zone choisie.

La pointe de microscopie à force atomique (AFM) se déplace en balayant la surface de l'échantillon entre les indentations et enregistre des courbes individuelles de force-déplacement à chaque point d'une grille d'échantillonnage prédéfinie. Nous avons trouvé pratique d'utiliser une grille d'échantillonnage de 16 sur 16 points pour cartographier une zone de 80 micromètres sur 80 micromètres, à une vitesse d'indentation de 20 micromètres par seconde, ce qui peut être accompli en environ 10 minutes. Pour calculer le module de Young, ajuster la courbe force-déplacement au modèle d'indentation sphérique de Hertz à l'aide d'une méthode d'ajustement non linéaire aux moindres carrés, comme indiqué ici, où F égale K indice C fois delta D, la force nécessaire pour fléchir le levier.

K sub C est la constante de raideur du levier. R est le rayon de la pointe sphérique, delta égale delta Z moins delta D est l'indentation, et ν est le coefficient de Poisson de l'échantillon, qui vaut 0,4 pour le tissu pulmonaire. Pour évaluer la qualité de l'ajustement, calculez la valeur SSR, ou somme des carrés des différences entre les données et les valeurs ajustées lors de l'ajustement non linéaire de la courbe.

Éliminez les mesures peu fiables ou ininterprétables en rejetant les données provenant de mauvaises courbes présentant de grandes valeurs de SSR. Si désiré, convertissez le module d'élasticité ou E en module de cisaillement G, en utilisant la relation E égale deux fois la somme de un plus nu fois G. Pour visualiser les motifs spatiaux de rigidité recueillis en mode de cartographie des forces, tracez les données de module et des cartes de contour, par exemple, sur une grille de 16 par 16 couvrant une zone de 80 micromètres par 80 micromètres.

Pour traiter une grande quantité de données de courbes de force, un algorithme personnalisé peut être conçu pour ajuster automatiquement les courbes force-déplacement, extraire des modules et/ou tracer des cartes de contours ou des greffons ELA. En utilisant les mêmes procédures et paramètres décrits précédemment, cette figure montre qu'Im a correctement découpé et coloré le tissu. La microstructure alvéolaire du parenchyme pulmonaire est bien préservée, comme observé par coloration immunofluorescente du composant de la membrane basale, la laminine, sans fixation ni perméabilisation.

Ces panneaux montrent une coloration immunofluorescente du collagène, réalisée sur des poumons frais non fixés prélevés chez des souris préalablement traitées au PBS ou à la bléomycine pour induire une fibrose. Des courbes représentatives de force-déplacement obtenues par micro-indention AFM sont présentées ici avec la même force appliquée. La pointe AFM produit une grande indentation dans une région molle, conduisant à une courbe force-déplacement relativement plate, illustrée en bleu, par rapport à une faible indentation et une courbe force-déplacement plus pentue dans une région plus rigide, illustrée en rouge.

Pour obtenir des courbes de force nettes après chaque indentation, il est nécessaire que la pointe de la MFA se retire complètement de la surface de l'échantillon et soit libérée du contact avant l'indentation suivante. Cet état sans contact correspond à la région plate de la courbe, où la pointe se déplace sans déflexion du levier. Cette figure montre une courbe typique erronée, dépourvue de région plate, qui se produit lorsque la pointe ne se retire pas complètement de la surface de l'échantillon, par exemple lorsque l'échantillon mou adhère à la pointe, rendant impossible la détermination du point de contact si la pointe est totalement piégée dans l'échantillon mou.

La courbe peut présenter cet aspect sans déflexion nette, mais avec un faible bruit. Cette figure montre la rigidité. Les données extraites des courbes de déplacement forcé sont affichées spatialement sous forme de cartes de rigidité appelées greffes ELAs, où l'échelle de couleurs correspond à la rigidité. Les greffes ELAs révèlent des différences marquées dans l'amplitude et la répartition de la rigidité tissulaire dans le parenchyme pulmonaire normal et fibrotique, ainsi que de grandes variations spatiales de rigidité, en particulier dans l'échantillon pulmonaire fibrotique.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment caractériser l'environnement mécanique local du parenchyme pulmonaire en mesurant directement les propriétés élastiques locales de tissu pulmonaire frais à l'aide de la microscopie à force atomique.