Name: Micro-Mécanique de caractérisation du tissu pulmonaire par microscopie à force atomique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Découvrez la microindentation par microscopie à force atomique pour caractériser la rigidité du tissu pulmonaire. Cette technique offre une résolution spatiale inégalée pour étudier les variations locales de rigidité entre tissus normaux et fibrotiques.

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Nous remercions A. Tager et B. Shea pour leur collaboration continue, et de fournir le tissu pulmonaire utilisés à des fins de démonstration ici. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde HL-092961. Ce travail a été exécuté en partie au Centre de systèmes de taille nanométrique (SNC), un membre du Réseau National Nanotechnology Infrastructure, qui est soutenu par la National Science Foundation en récompense NSF ECS-0335765. SNC est une partie de la Faculté des arts et des sciences à l&#39;Université Harvard.

1. Préparation bande de tissu pulmonaire <ol><li> Le tissu pulmonaire est très compatible et difficile à couper en lanières pour la caractérisation de l'AFM. Pour stabiliser la structure transitoire pour la coupe des poumons, gonfler les poumons de souris isolées par voie intratrachéale avec le poids corporel de 50 ml / kg de 2% peu de gel d'agarose points (préparé dans du PBS) chauffé à 37 ° C. Nouez la trachée et les poumons gonflés refroidir le dans un bain de PBS à 4 ° C pendant 60 minutes. L'agarose gel et se raidissent dans les espaces aériens pour doucement stabiliser la structure du poumon au cours de cet intervalle 5. Des concentrations plus élevées d'agarose, soit 3-4%, peut être utilisé pour améliorer encore la stabilisation de tissu pour la coupe. </li><li> Coupez le tissu agarose stabilisé la souris poumon avec un rasoir ou une lame de bistouri en bandes de 5 x 5 mm de longueur et de largeur et 400 um d'épaisseur, puis lavez les bandes dans un bain de PBS préchauffé à 37 ° C à l'aide de 100 ml récipient en verre sur une paillasse plaque d'agitation chauffé pendant 5 minutes pour enlever les résidus d'agarose. Pour exclure grandes voies aériennes et les navires, couper des bandes de régions sous-pleurales éloignée de la tige principale bronches. Si les voies respiratoires et les gros vaisseaux sont à imager, couper des bandes de tissu pulmonaire plus proximal au tronc principal bronches. </li></ol> 2. Microindentation AFM et d'imagerie par fluorescence <ol><li> Afin d'isoler les zones d'intérêt pour microindentation AFM, les tissus peuvent être visualisées par microscopie à contraste de phase, ou immunocolorés et visualisé par microscopie à fluorescence. Pour immunomarquage, de bloquer des bandes de tissu avec 5% de sérum provenant de la source de l'anticorps désiré secondaire (dans du PBS) pendant 2 heures sans fixation ou de perméabilisation à la température ambiante. </li><li> Incuber la bande de tissu avec l'anticorps primaire appropriés (p. ex lapin anti-collagène de type I pour visualiser collagène interstitiel (1:250 dilution), de lapin anti-laminine (1:250 dilution) pour visualiser la membrane basale) dans un puits d'une plaque de 12 puits sur une bascule en agitant doucement pendant 1 heure, laver l'échantillon 3 fois pendant 5 minutes chacun avec PBS, suivi par un anticorps secondaire approprié conjugué à marqueur fluorescent (par exemple, Alexa Fluor 546 chèvre anti-lapin anticorps secondaire (1:250 dilution)) pour une heure à température ambiante. </li><li> Laver abondamment bandes de tissus avec du PBS et de stocker dans du PBS à 4 ° C </li><li> Immédiatement avant la caractérisation AFM, fixez la bande de tissu à un poly-L-lysine 15 mm lamelle en soulevant la lamelle de dessous le tissu flottant, en veillant à la bande de tissu répartit uniformément sur la surface de la lamelle, si nécessaire, un sandwich la bande avec un chiffon propre secondes, non couchés lamelle et appliquer une légère pression pour aider à la fixation des tissus de la lamelle de poly-L-lysine. </li><li> Calibrer le système AFM suivant l'instruction de la manufacture immédiatement avant chaque tour d'expériences microindentation. Déterminer deux paramètres essentiels: 1) le ressort cantilever constante en utilisant la méthode des fluctuations thermiques dans l'air 6, et 2) la sensibilité déflection du cantilever, qui est un paramètre utilisé à l'échelle du signal de sortie photodiode à la distance réelle déflection du cantilever, Ad. Calibrer la sensibilité de déviation par l'obtention d'une norme courbe force-déplacement en PBS sur une lame de verre propre, puis calculer la pente de la courbe force-déplacement (Fig. 1b). Dans la mesure courbe force-déplacement, la pointe de l'AFM est prolongé vers et rétractée de la surface de l'échantillon à un seul endroit (sans tramage dans des directions XY), avec la déviation du cantilever, Ad, suivie en fonction du déplacement pointe, Az . </li></ol> Nous vous recommandons d'utiliser un cantilever triangulaire de nitrure de silicium avec un 5-um de diamètre borosilicate pointe sphérique (NovaScan). En utilisant des sondes AFM avec une constante de rappel de 0,06 N / m, nous avons caractérisé mécaniquement les matériaux mous avec des modules de cisaillement s'étend de 100 à 50 000 Pa. <ol start="6"><li> Essuyez la surface inférieure de la lamelle échantillon avec du papier de soie, l'attacher à une lame de verre standard avec graisse à vide, monter la lame de verre sur la scène de l'échantillon AFM, et couvrent les tissus avec 500 ul de PBS (température ambiante). </li><li> Régler le microscope pour oculaire visualisation d'aligner la pointe AFM dans le centre du champ de vue en ajustant le stade de l'échantillon de microscope. Choisissez un domaine d'intérêt sur les tissus en se déplaçant au stade de l'échantillon AFM, puis passer à la caméra CCD pour enregistrer l'image visualisation contraste de phase et / ou des images de fluorescence des tissus, comme souhaité. </li><li> Effectuer le fonctionnement standard d'engagement AFM en déplaçant la pointe AFM lentement vers le bas jusqu'à ce qu'il soit en contact avec l'échantillon. </li><li> Caractérisation précise microindentation AFM d'échantillons mous nécessite des profondeurs petite empreinte d'éviter de grandes souches locales qui invalident le modèle de Hertz utilisée pour le module de calcul élastique. Pour éviter de grandes déformations, effectuez l'indentation dans le mode de déclenchement en définissant la déflexion maximale cantilever (point de déclenchement) à 500 nm. Cette limite de flèche limiteront lavigueur indentation maximale à moins de 30 nN (F ressort cantilever = déplacement constants *, ou F max = 0,06 nN / nm * 500 nm = 30 nN). </li></ol> La vitesse d'indentation doit être choisie pour être suffisamment lente pour explorer les propriétés viscoélastiques plutôt élastique de l'échantillon douce 7. Une gamme de vitesse de 2-20 um par seconde est approprié pour les tissus pulmonaires. <ol start="10"><li> Pour une mesure unique d'un domaine d'intérêt, de déplacer la sonde AFM à l'emplacement d'intérêt et d'effectuer une mise en retrait de recueillir une norme Courbe force-déplacement (la sonde se déplace uniquement dans le sens Z, sans XY à balayage). </li><li> Pour la cartographie automatisée d'une région d'intérêt, passez à la Force-mode Carte, sélectionnez le format de numérisation et de points d'échantillonnage dans la zone sélectionnée. En Force-mode Carte, les rasters pointe AFM sur la surface de l'échantillon entre les mouvements d'indentation, et recueille chaque courbes force-déplacement à chaque point dans une grille échantillon défini. Points d'échantillonnage Plus offrira une meilleure résolution spatiale, mais d'allonger le temps requis pour la cartographie. Nous avons trouvé qu'il pratique à utiliser une grille de 16 x 16 échantillons pour mapper un 80 x 80-um espace à une vitesse d'indentation de 20 um par seconde, ce qui peut être complété en ~ 10 minutes. </li></ol> 3. AFM Extraction de données <ol><li> Pour calculer le module d'Young, l'ajustement de la courbe force-déplacement au modèle d'indentation sphérique Hertz à l'aide des moindres carrés non-linéaires raccord courbe 8 (Fig.1 A, C): <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="Équation 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="L'équation 1"> où F = k c * Δ d, est la force de plier le cantilever, k c est le ressort cantilever constante, R est rayon de la pointe sphère, δ = Δ z - Δ d est l'indentation et υ est le ratio de l'échantillon de Poisson (υ = 0,4 pour 9 tissu pulmonaire). </li><li> Pour évaluer la qualité de l'ajustement, calculer la valeur SSR, ou la somme des carrés de la différence entre les données et les valeurs d'ajustement, pendant le montage courbe non linéaire. Éliminer les mesures peu fiables ou non interprétables en éliminant des données de «mauvais» des courbes avec des valeurs SSR grande. </li><li> Si désiré, de convertir le module d'élasticité (E) pour le module de cisaillement (G), en utilisant la relation E = 2 x (1 + υ) x G. Pour visualiser la répartition spatiale de la raideur recueillies dans Force-mode Carte, tracer les données dans le module contours des cartes (par exemple en 16 x grille de 16 échantillons couvrant une 80 x 80 um région). </li><li> Pour traiter une grande quantité de données courbe de force, un algorithme personnalisé peut être écrit pour ajuster automatiquement courbes force-déplacement, extrait de modules, et / ou elastographs parcelle en utilisant les mêmes procédures et les paramètres comme indiqué en 3.2 et 3.3 (par exemple Matlab). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> La figure 1 (A) Schéma d'microindentation AFM d'un échantillon douce sur un substrat rigide à l'aide d'une sonde sphérique (Reproduit avec la permission de Dimitriadis E., et al. Biophys 2002 J 8). (B) représentant la courbe force-déplacement recueillies auprès d'un lame de verre propre dans du PBS pour déterminer la sensibilité déflection du cantilever. (C) représentant courbes force-déplacement recueillies auprès mous (bleu) et rigide (rouge) des échantillons montrant les paramètres correspondants de (A). 4. Les résultats représentatifs: La figure 2A montre une bande de parenchyme pulmonaire ci-joint sur le poly-L-lysine lamelle enduit PBS avec une sonde AFM en place directement au-dessus région d'intérêt et de prêts pour la cartographie microindentation. Figure 2B montre que dans le tissu bien coupées et colorées, la microarchitecture du parenchyme pulmonaire alvéolaire est bien préservé, comme observé par immunofluorescence pour la laminine composante de la membrane basale sans fixation ou de perméabilisation. La figure 2 montre coloration CD immunofluorescence pour le collagène I dans les poumons frais non fixés récoltés à partir des souris préalablement traitées avec du PBS (figure 2C), ou traités avec la bléomycine (Fig. 2D) pour induire une fibrose 10. La figure 3A montre l'échantillon force-déplacement obtenue à partir des parcelles microindentation AFM. Avec la même force appliquée, l'AFM pointe génère une empreinte importante sur une région douce (ligne bleue), résultant en un temps relativement «plat» la courbe force-déplacement par rapport à une petite empreinte et un "raides" force-déplacement pour une courbe raide région ( ligne rouge). Afin d'obtenir des courbes de force de nettoyer, après chaque retrait de la pointe de l'AFM a besoin d'être rentré complètement de la surface de l'échantillon et libre de contact avant le retrait prochain. Cet état de contact libre correspond à la région plate de la courbe de la figure 3A, où la pointe se traduit, sans déflection du cantilever. La figure 3B montre une courbe typique de faux, sans une région plate qui se produit lorsque la pointe n'est pas complètement rentré de la surface de l'échantillon (par exemple, l'échantillon douce unettaches à la pointe) qui rend impossible de déterminer le point de contact. Si la pointe est complètement pris au piège dans l'échantillon doux, la courbe peut regarder comme le montre la figure 3C, sans fléchissement évident, mais petit bruit. La figure 4 montre les données de cisaillement module extrait de courbes force-déplacement dans l'espace affiché sous forme de cartes de rigidité (elastographs), où les échelles de couleurs avec module de cisaillement. Elastographs démontrent des différences frappantes dans la gamme et la distribution du module de cisaillement des tissus dans des conditions normales (figure 4A) et fibrotique (figure 4B) du parenchyme pulmonaire, et de grandes variations spatiales de module de cisaillement, en particulier au sein de l'échantillon pulmonaires fibreuses. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 (A). Micrographie par contraste de phase montrant une sonde AFM sur une bande de souris parenchyme pulmonaire. La barre d'échelle, 50 um. (B) immunocoloration de la laminine dans le tissu pulmonaire normal de souris montrant la microarchitecture du parenchyme pulmonaire alvéolaire normale. Boîte blanche indique typiquement 80 par 80μm zone cartographie élasticité. Barre d'échelle: 20 um. (C et D) du collagène I Immunocoloration dans une solution saline (C) et la bléomycine (D) poumons de souris traitées parenchyme. Barres d'échelle, 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> La figure 3 (A). Représentant interprétables courbes force-déplacement recueillies auprès de solution saline (bleu) et la bléomycine-traitée (en rouge) de souris parenchyme pulmonaire, respectivement. Les lignes noires sont le meilleur ajustement résultant du modèle sphérique et Hertz sont étiquetés avec leurs correspondantes calculées modules d'Young. (B, C) représentant de l'ONU-interprétables courbes force-déplacement. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Elastographs Représentant recueillies auprès de solution saline (A) et la bléomycine-traitée (B) la souris parenchyme pulmonaire. Les barres de couleur indiquent module de cisaillement en kilopascals. Les étiquettes des axes indiquent échelle spatiale en micromètres. Barre d'échelle: 20 um

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Caractérisation mécanique du tissu pulmonaire à l&#39;aide microindentation AFM offre une résolution spatiale sans précédent (fig. 4), offrant une perspective unique sur les variations de la rigidité du tissu micro. Comme exemple de son utilité, antérieure à macro-échelle des mesures dans des conditions normales et fibrotiques bandes tissu pulmonaire indique une approximative 2-3-fois plus élastance de fibrose 11,12. En revanche, microindentation AFM révèle que la rigidification des tissus est très localisée, avec certaines régions présentant jusqu&#39;à ~ augmente de 30 fois dans le module de cisaillement au-dessus de la médiane observée dans le tissu pulmonaire normale 10. Comme matrice de rigidité est maintenant connue pour influencer la fonction critique de cellules, ces mesures locales de fournir des paramètres précieux pour améliorer la biofidélité de l&#39;étude de culture cellulaire de cellules du poumon. Plusieurs questions pratiques se posent avec l&#39;utilisation de fines lanières de tissu pulmonaire. Les surfaces des bandes ne sont pas parfaitement plat, comme le profil des tissus suit l&#39;architecture des alvéoles sous-jacentes. Le système ajuste automatiquement la position AFM pointe dans la direction Z lors de l&#39;indentation lorsque la variation de hauteur de l&#39;échantillon de surface est inférieure à 15 um-pour aider à surmonter ce défi. Les mesures sont réalisées à température ambiante, et non pas 37 ° C, donc les écarts dans les propriétés mécaniques causés par cette variation de température ne peut pas être évaluée, bien qu&#39;ils seraient devrait être mineur. L&#39;influence de l&#39;architecture sous-jacente sur paroi alvéolaire observée propriétés mécaniques est difficile de déterminer avec la configuration actuelle microscopie optique. Par exemple, il serait souhaitable de déterminer si les parois alvéolaires présentent une anisotropie des propriétés mécaniques différentes et où en retrait dans des directions alignées ou transversale au plan du mur. Toutefois, les spécimens actuels sont épais et le système d&#39;imagerie n&#39;a pas les capacités 3D, il n&#39;est donc pas possible de déterminer l&#39;orientation du mur locales alvéolaires à chaque point de contact. Enfin, l&#39;influence des constituants cellulaires sur les propriétés mécaniques mesurées reste à élucider. Dans les méthodes décrites ici, aucun effort n&#39;est fait pour éliminer spécifiquement les constituants cellulaires des tissus. Cependant, les cellules présentes à la surface disponible pour l&#39;indentation sont peu susceptibles d&#39;être viable compte tenu du temps écoulé depuis la récolte des tissus et la nécessité de couper le tissu pour avoir accès à des alvéoles. Des expériences spécifiques pour enlever les cellules, ou repeupler les matrices de cellules viables, et d&#39;évaluer les changements résultant de la rigidité des tissus semble justifiée. Parce frais tissu non fixé est nécessaire pour ces mesures, le temps écoulé depuis la récolte des tissus à la mesure doit être minimisé et les échantillons doivent être conservés à 4 ° C pour éviter les changements de propriétés mécaniques. Une attention particulière devrait être accordée lorsque des bandes de tissu sont transférés entre les conteneurs pendant le lavage ou la coloration de sorte que la distorsion minimale ou le dommage est généré. Pour l&#39;application AFM en liquide, une étape cruciale consiste à couper le tissu le plus plat possible et d&#39;immobiliser l&#39;échantillon sur la lamelle de soutien. S&#39;il est disponible, une machine automatisée de sectionnement comme un vibratome ou trancheuse tissus peuvent être utilisés pour couper des tranches d&#39;épaisseur très uniforme. Il est important d&#39;attacher les bandes de tissu juste avant les mesures AFM et de minimiser le temps écoulé pour les mesures AFM que l&#39;échantillon sera éventuellement détacher les lamelles. Une observation utile est que les grandes bandes semblent attacher plus stable pour couvrir les glissades et rester en place pendant des durées plus longues dans le PBS que les petites bandes. Microindentation AFM peut caractériser les échantillons couvrant une large gamme de 100 Pa à 50 kPa (module de cisaillement) en utilisant un standard de 0,06 N / m en porte à faux avec une pointe de 5 pm de diamètre sphérique. Cette gamme peut être étendue en utilisant des sondes avec des constantes de ressort différentes; sondes AFM avec des conseils en verre sphérique allant de 0,6 à 12 um de diamètre et constantes du printemps allant de 0,01 à 0,58 N / m sont disponibles commercialement (par exemple NovaScan) et couramment utilisé 3. Avec une pointe de 5 um sphérique, la surface de contact théorique entre la pointe et de tissus est environ 5-9 um 2 pour 400-700 nm indentation (figure 1A). Conseils plus ou moins grande peut être utilisée pour fournir des échelles plus petites ou plus grandes de la résolution spatiale. Conseils pyramidal ont également été utilisés dans microindentation AFM 13-16, offrant des zones de contact plus petite et donc d&#39;augmenter la résolution spatiale de la cartographie, mais pose des données est plus complexe pour ce géométrie de la pointe. Plusieurs limites de cette méthode doit être noté. Le poumon a traditionnellement été caractérisé mécanique non invasive, par exemple en utilisant l&#39;analyse pression-volume 17 ou punch-indentation des poumons entière 19,20. Les méthodes invasives telles que celle décrite ici de modifier l&#39;architecture du poumon chez les façons importantes par la perte de l&#39;int air-liquideerface qui existe normalement dans les poumons remplis d&#39;air et la perte de pré-contrainte qui maintient l&#39;inflation pulmonaire partielle à la relaxation des muscles respiratoires. Ces limitations sont communes à toutes les mesures effectuées dans les bandes du tissu pulmonaire 18. Notamment, cependant, la rigidité médiane mesurée dans le parenchyme du tissu pulmonaire normal (module de cisaillement ~ 0.5kPa) ne diffère pas sensiblement de ces estimations basées sur le poinçon-indentation des poumons intacts à des volumes de repos 19,20. Alors que le tissu pulmonaire est connu pour présenter non linéaire raidissement avec une déformation croissante, il n&#39;est pas possible de tester de façon rigoureuse si cette propriété persiste jusqu&#39;à l&#39;échelle micro-avec les méthodes employées ici. Le modèle de Hertz suppose l&#39;homogénéité de l&#39;échantillon. Cependant, la plupart des matériaux biologiques, y compris du parenchyme pulmonaire, sont plus hétérogènes à diminuer les échelles spatiales. Hétérogénéité de l&#39;échantillon peut entraîner des artefacts comme la variation du module d&#39;Young en fonction de la profondeur d&#39;indentation, c&#39;est à dire en fonction de la couche ou un composant qui se déforme. L&#39;hétérogénéité dans le plan xy peut être limitée en choisissant soigneusement la taille appropriée pointe sphérique en fonction de la microstructure du biomatériau tel que proposé par Dimitriadis EK et al. 8 Il est beaucoup plus difficile à prévoir ou à corriger les erreurs du modèle de Hertz grâce au matériau hétérogénéité dans la direction z. Azeloglu et al. a récemment proposé un modèle hybride de calcul afin de caractériser les propriétés élastiques du substrat hétérogène, avec des inclusions discrètes intégrées 21. Leur nouvelle technique offre un potentiel moyen de calculer les propriétés d&#39;inclusion de matériaux hétérogènes surmonter les limites de l&#39;analyse hertziennes. Le modèle de Hertz suppose aussi absolue comportement élastique, tandis que les matériaux biologiques affichent généralement des comportements viscoélastiques dépendant du temps. Une caractérisation complète viscoélastiques du tissu peut être obtenu en faisant varier les vitesses d&#39;indentation utilisé. Surtout, antérieure à macro-échelle essais mécaniques du tissu pulmonaire normal et fibrotique démontre la dépendance de fréquence faible des propriétés mécaniques du tissu pulmonaire, et la préservation des différences entre les propriétés des tissus normaux et fibrotiques mécaniques sur toutes les fréquences testées 11. Ces résultats suggèrent fortement que la mesure des propriétés mécaniques en utilisant une vitesse d&#39;indentation simple avec l&#39;AFM capte un aspect essentiel de l&#39;évolution des propriétés mécaniques des tissus qui accompagnent la fibrose. Le coefficient de Poisson de 0,4 pour les tissus pulmonaires utilisés dans ce travail est d&#39;une mesure macroscopique 9. Malheureusement, le coefficient de Poisson au micro-échelle et des changements dans la condition la maladie ne sont pas disponibles dans la littérature. Comme alternatives à E, E / (1-υ 2) ou (1-υ 2) / πE (notée k constante élastique) 22 peut être calculée à partir de microindentation AFM et signalé lorsque le coefficient de Poisson est inconnue. Pour la plupart des biomatériaux coefficient de Poisson est dans la gamme de 0,4 à 0,5 en raison de leur forte teneur en eau. Dans la gamme de 0,3 à 0,5, le facteur 1 / (1-υ 2) ne varie que de 1,10 à 1,33, tels que les variations raisonnables dans le coefficient de Poisson d&#39;exercer que des effets modestes sur le module rapporté. L&#39;augmentation du module de cisaillement que nous rapportons à un parent tissu fibreux au tissu normal est de plusieurs fois l&#39;ampleur, ce qui implique que les erreurs associées à des variations dans le coefficient de Poisson sont mineures par rapport à l&#39;évolution des propriétés mécaniques observées. L&#39;algorithme réelle et le code qui peut être utilisé pour l&#39;analyse de la force-déplacement des données est soumise à la condition d&#39;application spécifique et des caractéristiques suivantes des diverses populations des courbes force-déplacement. Si une analyse plus sophistiquée est d&#39;un intérêt, on peut consulter les travaux de Lin et coll. 23. Les auteurs ont compilé une série de stratégies synergiques dans un algorithme qui permet de surmonter bon nombre des complications qui ont déjà entravé les efforts déployés pour automatiser le montage de modèles de données Hertz indentation. Plusieurs autres secteurs sont disponibles pour le développement ultérieur et l&#39;exploitation de cette méthode. Dans les cas où l&#39;on s&#39;intéresse à la visualisation des parois alvéolaires, sans marquage de l&#39;anticorps, à la fois élastine et de collagène peut être visualisé à partir de leur signal d&#39;autofluorescence dans le spectre vert. D&#39;autre part, une meilleure image, en utilisant soit des coupes de tissus plus fins, les techniques d&#39;imagerie 3D, ou les deux, pourrait améliorer la capacité à corréler avec les sous-tendent l&#39;architecture du tissu des propriétés mécaniques. Bien que les méthodes actuelles permettent la coloration et la visualisation des composants de la matrice extracellulaire comme le collagène et la laminine, des efforts supplémentaires pourraient être destinées à coloration marqueurs de surface cellulaire pour identifier les populations spécifiques de cellules et de caractériser les micro-environnements mécaniques dans le voisinage de ces populations. Alternatively, tissus pourraient être récoltés à partir des souris exprimant marqués par fluorescence lignée cellulaire des marqueurs ou des protéines spécifiques de poursuivre le même objectif. Enfin, la méthode détaillée apparaît ici bien adaptée à la caractérisation d&#39;autres caractéristiques anatomiques dans les poumons, comme les navires qui remodelage dans l&#39;hypertension, et les voies respiratoires, qui remodelage dans l&#39;asthme. Basé sur son état de développement actuel et le potentiel d&#39;améliorer encore, microindentation AFM semble prête à donner des aperçus précieux sur les changements dans la rigidité des tissus qui accompagnent la progression de la maladie dans le poumon, et sera sans aucun doute de la valeur pour caractériser les changements spatiaux et temporels dans la la rigidité d&#39;une variété d&#39;autres tissus mous.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> AFM pointe </td><td> NovaScan </td><td> PT.GS </td><td> 5 microns borosilicaté billes, 0,06 N / m </td></tr><tr><td> Poly-L-Lysine lamelles </td><td> VWR </td><td> 354085 </td><td> BD BioCoat 12 mm de diamètre en verre n ° 1 </td></tr><tr><td> Agarose, basse température de gélification </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Lapin anti-collagène I (Rb pAb) antibody </td><td> Abcam </td><td> ab34710-100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 chèvres anticorps anti-lapin </td><td> Invitrogen </td><td> A11010 </td><td></td></tr><tr><td> Lapin anti-laminine </td><td> Sigma </td><td> L9393 </td><td></td></tr></tbody></table>

micro-mécanique de caractérisation du tissu pulmonaire par microscopie à force atomique

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrice de rigidité influence fortement la croissance, la différenciation et la fonction des cellules adhérentes 1-3. A l&#39;échelle macro de la rigidité des tissus et des organes dans le corps humain durée de plusieurs ordres de magnitude 4. On connaît beaucoup moins sur la façon dont la raideur varie spatialement dans les tissus, et ce que la portée et l&#39;échelle spatiale des variations de rigidité sont dans les processus de la maladie qui en résultent dans le remodelage tissulaire. Afin de mieux comprendre comment les changements dans matrice de rigidité de contribuer à la physiologie cellulaire de la santé et la maladie, les mesures de la rigidité des tissus obtenus à une échelle spatiale pertinente pour les cellules résidentes sont nécessaires. Cela est particulièrement vrai pour le poumon, un tissu très compatible et élastique dans laquelle remodelage de la matrice est une caractéristique importante de maladies comme l&#39;asthme, l&#39;emphysème, l&#39;hypertension et fibrose. Pour caractériser l&#39;environnement local mécanique du parenchyme pulmonaire à une échelle spatiale pertinente pour les cellules résidentes, nous avons développé des méthodes pour mesurer directement les propriétés élastiques locales du tissu pulmonaire murin frais en utilisant la microscopie à force atomique (AFM) microindentation. Avec un choix approprié de l&#39;AFM pénétrateur, cantilever, et la profondeur d&#39;indentation, ces méthodes permettent de mesurer des locaux module de cisaillement des tissus en parallèle avec contraste de phase et d&#39;imagerie de fluorescence de la région d&#39;intérêt. L&#39;échantillonnage systématique des bandes de tissus fournit des cartes des propriétés mécaniques des tissus locaux qui révèlent des variations spatiales dans le module de cisaillement. Les corrélations entre les propriétés mécaniques et sous-jacentes des caractéristiques anatomiques et pathologiques illustrent la façon dont la raideur varie avec dépôt de matrice de la fibrose. Ces méthodes peuvent être étendues à d&#39;autres tissus mous et des processus de la maladie de révéler comment les propriétés mécaniques des tissus locaux varient à travers l&#39;espace et de progression de la maladie.

La rigidité de la matrice extracellulaire influence fortement les comportements multiples de cellules adhérentes. Matrice de rigidité varie spatialement à travers un tissu, et subit des modifications dans les diverses maladies. Ici, nous développons des méthodes pour caractériser les variations spatiales de la rigidité dans le tissu pulmonaire normal de la souris et fibrotiques utilisant la microscopie à force atomique microindentation.

Micro-Mécanique de caractérisation du tissu pulmonaire par microscopie à force atomique

La rigidité de la matrice influence fortement la croissance, la différenciation et la fonction des cellules adhérentes1-3. À l'échelle macroscopique, la rigidité des tissus et des organes...

L'objectif général de l'expérience suivante est de caractériser l'environnement mécanique local du parenchyme pulmonaire à une échelle spatiale pertinente pour les cellules résidentes, en mesurant directement les propriétés élastiques locales de tissu pulmonaire frais par micro-indention à l'aide d'un microscope à force atomique (AFM). Cette approche consiste à découper le tissu pulmonaire de souris gonflé à l'agarose à l'aide d'un rasoir ou d'une lame de scalpel, afin de préparer des bandes de parenchyme pulmonaire mesurant cinq millimètres de longueur sur cinq millimètres de largeur, et d'une épaisseur de 400 micromètres. Ensuite, les bandes de tissu pulmonaire non fixées et non perméabilisées sont soumises à une immunomarquage, permettant d'identifier les zones d'intérêt pour la micro-indention AFM.Ensuite, une micro-indenteuse en mode force (FM) est effectuée sur des bandes de tissu dans du PBS à température ambiante. Afin de mesurer directement les propriétés élastiques locales du tissu pulmonaire frais, des résultats sont obtenus. Ceux-ci montrent des différences marquées dans l’étendue et la distribution de la rigidité tissulaire dans le parenchyme pulmonaire normal et fibrotique, ainsi que de grandes variations spatiales de la rigidité, en particulier au sein de l’échantillon pulmonaire fibrotique.Basé sur des cartes de rigidité extraites à partir de courbes de déplacement forcé obtenues à l'aide d'une micro-indenteuse FM. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'étirement de bandes de tissu, est qu'elle offre une résolution spatiale sans précédent, fournissant ainsi une perspective unique sur les variations à l'échelle microscopique de la rigidité tissulaire. Cette mesure peut aider à répondre à des questions essentielles, telles que la manière dont la rigidité varie spatialement au sein du tissu, ainsi que l'ampleur et l'échelle spatiale des modifications de rigidité dans la maladie.Les processus qui entraînent la remodélisation tissulaire : pour préparer des bandes de tissu pulmonaire, commencez par stabiliser la structure du poumon afin de permettre la découpe, en insufflant dans des poumons de souris isolés 50 millilitres par kilogramme de poids corporel d'agarose à 2 % à bas point de gélification, préparée dans du PBS. Ligaturez la trachée et refroidissez les poumons insufflés dans un bain de PBS à quatre degrés Celsius pendant 60 minutes. L'agarose gélifiera et se rigidifiera dans les espaces aériens, stabilisant ainsi délicatement la structure pulmonaire. Pendant cet intervalle, à l’aide d’un rasoir ou d’un scalpel, découpez le tissu pulmonaire de souris stabilisé par l’agarose en bandes d’environ cinq millimètres de longueur et de largeur, et de 400 micromètres d’épaisseur.Ensuite, lavez les bandes dans du PBS à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes pour éliminer les résidus d'aros, afin d'exclure les grosses voies aériennes et les vaisseaux. Coupez des bandes dans les régions sous-pleurales éloignées des bronches principales si les voies aériennes et les gros vaisseaux doivent être observés ; pour imager des zones d'intérêt plus proches des bronches principales, coupez des bandes dans le tissu pulmonaire plus proche des bronches principales afin d'isoler les régions d'intérêt pour une micro-indenteation AFM. Visualisez le tissu par microscopie de contraste de phase ou par immunomarquage, et observez par microscopie de fluorescence.Voir la partie écrite de ce protocole pour la procédure. Juste avant une caractérisation par FM, fixer les bandes de tissu sur des lamelles de 15 millimètres revêtues de poly-L-lysine en soulevant la lamelle depuis le bas du tissu flottant, en veillant à ce que la bande de tissu s'étale uniformément sur la surface de la lamelle. Si nécessaire, placer la bande entre une deuxième lamelle propre non revêtue et appliquer une légère pression pour faciliter l'attachement du tissu à la lamelle revêtue de poly-L-lysine.Étalonner le système A FM en suivant les instructions du fabricant immédiatement avant chaque série d'expériences de micro-indention. Pour cela, déterminer deux paramètres critiques : la constante de raideur du levier à l'aide de la méthode des fluctuations thermiques dans l'air, et la sensibilité de déflexion du levier, qui est un paramètre utilisé pour convertir le signal de sortie du photodétecteur en la distance réelle de déflexion du levier.Étalonnez la sensibilité de déflexion en obtenant une courbe standard de force-déplacement dans du PBS sur une lame de verre propre. Calculez ensuite la pente de la courbe force-déplacement dans la mesure de la courbe force-déplacement. La pointe A FM est approchée puis retirée de la surface de l'échantillon en un seul point, la déflexion du levier delta D étant surveillée en fonction du déplacement de la pointe delta Z. Il est recommandé d'utiliser un levier en nitrure de silicium de forme triangulaire, muni d'une pointe sphérique en silicate de bore de cinq micromètres de diamètre, avec des sondes A FM ayant une constante de ressort de 0,06 newton par mètre.Nous avons caractérisé mécaniquement des matériaux mous dont le module de cisaillement s'étend de 100 à 50 000 pascals. Essuyez la surface inférieure de la lame de couverture avec du papier absorbant, puis fixez-la à une lame de verre standard à l'aide de graisse à vide. Montez la lame de verre sur le porte-échantillon de la MFA et recouvrez le tissu de 500 microlitres de PBS à température ambiante.Ensuite, placez la tête de balayage AFM au-dessus de l'échantillon. Réglez le plateau de microscope pour positionner l'échantillon de manière à observer par les oculaires et à aligner la pointe AFM au centre du champ de vision. Déplacez le plateau de l'échantillon AFM pour sélectionner une zone d'intérêt sur le tissu.Ensuite, passez à la visualisation par caméra CCD pour enregistrer l’image de contraste de phase et/ou des images de fluorescence du tissu selon les besoins. Déplacez lentement la pointe AFM vers le bas jusqu’à ce qu’elle entre en contact précis avec l’échantillon. La caractérisation par micro-indentation AFM d’échantillons mous exige de faibles profondeurs d’indentation afin d’éviter de grandes déformations locales, ce qui invaliderait le modèle de Hertz utilisé pour le calcul du module d’élasticité. Pour éviter de grandes déformations, effectuez l’indentation en mode déclenchement en réglant la déflexion maximale du levier à 500 nanomètres.La limite de déflexion maintiendra la force d'indentation maximale en dessous de 30 nanonewtons. La vitesse d'indentation doit être choisie suffisamment lente pour explorer les propriétés élastiques plutôt que viscoélastiques de l'échantillon mou. Sélectionnez une plage de vitesse de deux à 20 micromètres par seconde pour un tissu pulmonaire, pour une mesure unique provenant d'une zone d'intérêt.Déplacez la sonde A FM jusqu'à l'emplacement d'intérêt et effectuez une indentation unique afin d'acquérir une courbe force-déplacement standard. La sonde ne se déplacera que dans la direction Z. Pour cartographier automatiquement une région d'intérêt, passez en mode cartographie de force, sélectionnez la taille du balayage et les points d'échantillonnage dans la zone choisie.La pointe de microscopie à force atomique (AFM) se déplace en balayant la surface de l'échantillon entre les indentations et enregistre des courbes individuelles de force-déplacement à chaque point d'une grille d'échantillonnage prédéfinie. Nous avons trouvé pratique d'utiliser une grille d'échantillonnage de 16 sur 16 points pour cartographier une zone de 80 micromètres sur 80 micromètres, à une vitesse d'indentation de 20 micromètres par seconde, ce qui peut être accompli en environ 10 minutes. Pour calculer le module de Young, ajuster la courbe force-déplacement au modèle d'indentation sphérique de Hertz à l'aide d'une méthode d'ajustement non linéaire aux moindres carrés, comme indiqué ici, où F égale K indice C fois delta D, la force nécessaire pour fléchir le levier. K sub C est la constante de raideur du levier. R est le rayon de la pointe sphérique, delta égale delta Z moins delta D est l'indentation, et ν est le coefficient de Poisson de l'échantillon, qui vaut 0,4 pour le tissu pulmonaire. Pour évaluer la qualité de l'ajustement, calculez la valeur SSR, ou somme des carrés des différences entre les données et les valeurs ajustées lors de l'ajustement non linéaire de la courbe.Éliminez les mesures peu fiables ou ininterprétables en rejetant les données provenant de mauvaises courbes présentant de grandes valeurs de SSR. Si désiré, convertissez le module d'élasticité ou E en module de cisaillement G, en utilisant la relation E égale deux fois la somme de un plus nu fois G. Pour visualiser les motifs spatiaux de rigidité recueillis en mode de cartographie des forces, tracez les données de module et des cartes de contour, par exemple, sur une grille de 16 par 16 couvrant une zone de 80 micromètres par 80 micromètres.Pour traiter une grande quantité de données de courbes de force, un algorithme personnalisé peut être conçu pour ajuster automatiquement les courbes force-déplacement, extraire des modules et/ou tracer des cartes de contours ou des greffons ELA. En utilisant les mêmes procédures et paramètres décrits précédemment, cette figure montre qu'Im a correctement découpé et coloré le tissu. La microstructure alvéolaire du parenchyme pulmonaire est bien préservée, comme observé par coloration immunofluorescente du composant de la membrane basale, la laminine, sans fixation ni perméabilisation.Ces panneaux montrent une coloration immunofluorescente du collagène, réalisée sur des poumons frais non fixés prélevés chez des souris préalablement traitées au PBS ou à la bléomycine pour induire une fibrose. Des courbes représentatives de force-déplacement obtenues par micro-indention AFM sont présentées ici avec la même force appliquée. La pointe AFM produit une grande indentation dans une région molle, conduisant à une courbe force-déplacement relativement plate, illustrée en bleu, par rapport à une faible indentation et une courbe force-déplacement plus pentue dans une région plus rigide, illustrée en rouge.Pour obtenir des courbes de force nettes après chaque indentation, il est nécessaire que la pointe de la MFA se retire complètement de la surface de l'échantillon et soit libérée du contact avant l'indentation suivante. Cet état sans contact correspond à la région plate de la courbe, où la pointe se déplace sans déflexion du levier. Cette figure montre une courbe typique erronée, dépourvue de région plate, qui se produit lorsque la pointe ne se retire pas complètement de la surface de l'échantillon, par exemple lorsque l'échantillon mou adhère à la pointe, rendant impossible la détermination du point de contact si la pointe est totalement piégée dans l'échantillon mou.La courbe peut présenter cet aspect sans déflexion nette, mais avec un faible bruit. Cette figure montre la rigidité. Les données extraites des courbes de déplacement forcé sont affichées spatialement sous forme de cartes de rigidité appelées greffes ELAs, où l'échelle de couleurs correspond à la rigidité. Les greffes ELAs révèlent des différences marquées dans l'amplitude et la répartition de la rigidité tissulaire dans le parenchyme pulmonaire normal et fibrotique, ainsi que de grandes variations spatiales de rigidité, en particulier dans l'échantillon pulmonaire fibrotique.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment caractériser l'environnement mécanique local du parenchyme pulmonaire en mesurant directement les propriétés élastiques locales de tissu pulmonaire frais à l'aide de la microscopie à force atomique.

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