Micro-Mécanique de caractérisation du tissu pulmonaire par microscopie à force atomique

L’objectif général de l’expérience suivante est de caractériser l’environnement mécanique local du parenchyme pulmonaire à une échelle spatiale pertinente pour les cellules résidentes en mesurant directement les propriétés élastiques locales du tissu pulmonaire miroir frais à l’aide de la micro-indentation de microscopie à force atomique. Ceci est réalisé en coupant le tissu pulmonaire de souris gonflé à l’agarro avec une lame de rasoir ou de scalpel pour préparer des bandes de parenchyme pulmonaire de cinq millimètres sur cinq millimètres de longueur et de largeur, et de 400 micromètres d’épaisseur. Ensuite, les bandes de tissu pulmonaire non fixé sont l’immunocoloration, qui identifie les zones d’intérêt pour une micro-indentation FM.

Ensuite, une micro-indentation FM est effectuée sur des bandes de tissu dans du PBS à température ambiante. Afin de mesurer directement les propriétés élastiques locales du tissu pulmonaire frais, des résultats sont obtenus. Cela montre des différences frappantes dans l’étendue et la distribution de la rigidité tissulaire dans le parenchyme pulmonaire normal et fibreux et de grandes variations spatiales de la rigidité, en particulier dans l’échantillon de poumon fibrotique.

Basé sur des cartes de rigidité extraites de courbes de déplacement forcé obtenues à l’aide d’une micro-indentation FM. Le principal avantage de cette technique par rapport aux mesures existantes telles que l’étirement des bandes tissulaires est qu’elle offre une résolution spatiale sans précédent, offrant une perspective unique sur la variation à l’échelle microscopique de la rigidité des tissus. Cette mesure peut aider à répondre à des questions clés telles que la façon dont la rigidité varie spatialement dans le tissu et quelle est l’étendue et l’échelle spatiale des changements de rigidité dans la maladie.

Pour préparer des bandes de tissu pulmonaire, commencez par stabiliser la structure pulmonaire pour la coupe en gonflant des poumons de souris isolés. Par voie intratrachéale, avec 50 millilitres par kilogramme de poids corporel chaud, à faible teneur en gel, préparez dans le PBS, attachez la trachée et refroidissez les poumons gonflés dans un bain de PBS à quatre degrés Celsius pendant 60 minutes. L’aros va se gélifier et se raidir dans les espaces aériens pour stabiliser doucement la structure pulmonaire Au cours de cet intervalle, à l’aide d’un rasoir ou d’un scalpel, coupez le tissu pulmonaire stabilisé de la souris en bandes d’environ cinq par cinq millimètres de longueur et de largeur, et de 400 micromètres d’épaisseur.

Ensuite, lavez les bandelettes dans du PBS à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes pour éliminer les aros résiduels afin d’exclure les grandes voies respiratoires et les vaisseaux. Couper des bandelettes dans des régions sous-pleurales éloignées des bronches de la tige principale si l’on doit imager des voies respiratoires dans de gros vaisseaux, couper des bandes de tissu pulmonaire plus proximal aux bronches de la tige principale afin d’isoler les zones d’intérêt pour une micro-indentation FM. Visualisez le tissu par microscopie de contraste facial ou immunocoloration et visualisez par microscopie à fluorescence.

Veuillez consulter la partie écrite de ce protocole pour connaître la procédure. Immédiatement avant une caractérisation FM, fixez les bandes de tissu sur des lamelles de 15 millimètres enrobées de lysine poly L en soulevant la lamelle de dessous le tissu flottant, en vous assurant que la bande de tissu s’étale uniformément sur la surface de la lamelle. Si nécessaire, prenez la bande en sandwich avec une deuxième lamelle propre non enduite et appliquez une légère pression pour faciliter la fixation du tissu à la lamelle enduite de lysine poly L.

Étalonnez le système A FM en suivant les instructions du fabricant immédiatement avant chaque série d’expériences de micro-indentation. Pour cela, déterminez deux paramètres critiques. La constante de ressort en porte-à-faux à l’aide de la méthode de fluctuation thermique dans l’air et la sensibilité à la déflexion en porte-à-faux, qui est un paramètre utilisé pour mettre à l’échelle le signal de sortie de la photodiode à la distance de déviation réelle du cantilever.

Calibrez la sensibilité à la déflexion en obtenant une courbe de déplacement forcé standard en PBS sur une lame de verre propre. Calculez ensuite la pente de la courbe de déplacement forcé dans la mesure de la courbe de déplacement forcé. La pointe A FM est déployée et rétractée de la surface de l’échantillon à un seul endroit, la déviation du delta D en porte-à-faux étant surveillée en fonction du delta de déplacement de la pointe, Z.It est recommandé d’utiliser un triangle en nitrure de silicium en porte-à-faux avec une pointe sphérique en silicate de cinq micromètres de diamètre à l’aide d’une sonde FM avec une constante de ressort de 0,06 newton par mètre.

Nous avons caractérisé mécaniquement des matériaux souples avec une modulation pure couvrant 100 à 50 000 pascals. Essuyez la surface inférieure de la lamelle de couverture de l’échantillon avec du papier de soie, puis fixez-la à une lame de verre standard avec de la graisse sous vide. Montez la lame de verre sur la platine d’échantillonnage A FM et recouvrez le tissu avec 500 microlitres de PBS à température ambiante.

Placez ensuite une tête de balayage FM sur l’échantillon. Ajustez la platine de l’échantillon du microscope pour régler le microscope pour l’observation de l’oculaire afin d’aligner l’embout A FM au centre du champ de vision. Déplacez la platine d’échantillonnage A FM pour choisir une zone d’intérêt sur le tissu.

Passez ensuite à la visualisation par caméra CCD pour enregistrer une image en contraste de phase et/ou des images de fluorescence du tissu comme vous le souhaitez. Déplacez lentement l’embout A FM vers le bas jusqu’à ce qu’il soit en contact avec l’échantillon avec précision. Une caractérisation par micro-indentation FM d’échantillons mous nécessite de petites profondeurs d’indentation pour éviter les grandes déformations locales, ce qui invalide le modèle hertz utilisé pour le calcul du module d’élasticité pour éviter les grandes déformations, effectuer l’indentation en mode déclencheur en réglant la déviation maximale en porte-à-faux à 500 nanomètres.

Cette limite de déflexion limitera la force d’indentation maximale à moins de 30 nano newtons. La vitesse d’indentation doit être sélectionnée de manière à être suffisamment lente pour explorer les propriétés élastiques plutôt que viscoélastiques de l’échantillon mou. Sélectionnez une plage de vitesse de deux à 20 micromètres par seconde pour le tissu pulmonaire pour une seule mesure à partir d’une zone d’intérêt.

Déplacez la sonde FM A à l’endroit qui vous intéresse et effectuez une seule indentation pour collecter une courbe de déplacement de force standard. La sonde se déplacera uniquement dans la direction Z. Pour la cartographie automatique d’une région d’intérêt, passez en mode de cartographie forcée, sélectionnez la taille de balayage et les points d’échantillonnage dans la zone sélectionnée.

L’A FM oriente les RA sur la surface de l’échantillon entre les mouvements d’indentation et collecte les courbes de déplacement forcé individuelles en chaque point d’une grille d’échantillonnage indéfinie. Nous avons trouvé pratique d’utiliser une grille d’échantillons de 16 par 16 pour cartographier une zone de 80 micromètres par 80 micromètres à une vitesse d’indentation de 20 micromètres par seconde, ce qui peut être complété en 10 minutes environ. Pour calculer le module de Young, ajustez la courbe de déplacement de force au modèle d’indentation sphérique hertz à l’aide de la courbe non linéaire de Lee Square, ajustant comme illustré ici, où F est égal à K indice C fois delta, D est la force à plier le porte-à-faux.

K indice C est la constante du ressort en porte-à-faux. R est le rayon de l’extrémité de la sphère delta est égal à delta Z moins delta D est l’indentation, et nouveau est le rapport de Poisson des échantillons, qui est égal à 0,4 pour le tissu pulmonaire. Pour évaluer la qualité de l’ajustement, calculez la valeur SSR ou la somme des carrés de la différence entre les données et les valeurs d’ajustement lors de l’ajustement de la courbe non linéaire.

Éliminez les mesures peu fiables ou ininterprétables en éliminant les données des mauvaises courbes avec des valeurs SSR élevées. Si vous le souhaitez, convertissez le module d’élasticité ou E en module pur. G.En utilisant la relation E, on obtient deux fois la somme de un plus de nouveaux temps G.To visualiser les modèles spatiaux de rigidité collectés en mode de carte de force, tracer les données de module et les cartes de contour, par exemple, dans une grille de 16 par 16 couvrant une zone de 80 micromètres sur 80 micromètres.

Pour traiter une grande quantité de données de courbe de force, un algorithme personnalisé peut être écrit pour ajuster automatiquement les courbes de déplacement de force, extraire des cartes modulaires et/ou tracer des cartes de contour ou une greffe ELA. En utilisant les mêmes procédures et paramètres que ceux décrits ci-dessus, cette figure montre que je coupe et colore correctement les tissus. Le micro alvéolaire du parenchyme pulmonaire est bien préservé comme observé par coloration immunofluorescente pour le composant de la membrane basale, laminine sans fixation ni perméation.

Ces panels montrent une coloration immunofluorescente pour le collagène, l’une dans des poumons frais non fixés prélevés sur des souris précédemment traitées avec du PBS ou traitées avec de la mycine blio pour induire une fibrose. Des tracés de déplacement de force d’échantillon obtenus à partir d’une micro-indentation FM sont présentés ici avec la même force appliquée. La pointe A FM génère une grande indentation sur une région molle, ce qui entraîne une courbe de déplacement de force relativement plate indiquée en bleu par rapport à une petite indentation et une courbe de déplacement de force abrupte pour une région plus rigide indiquée en rouge.

Afin d’obtenir des courbes de force nettes après chaque indentation, l’embout A FM doit être complètement rétracté de la surface de l’échantillon et libre de contact avant l’indentation suivante. Cet état sans contact correspond à la région plate de la courbe où la pointe se déplace sans déviation en porte-à-faux. Cette figure montre une fausse courbe typique sans région plate, qui se produit lorsque la pointe n’est pas complètement rétractée de la surface de l’échantillon, par exemple lorsque l’échantillon mou se fixe à la pointe, ce qui rend impossible la détermination du point de contact si la pointe est complètement coincée dans l’échantillon mou.

La courbe peut ressembler à ceci sans déviation claire, mais avec un faible bruit. Cette figure montre une rigidité. Les données extraites des courbes de déplacement forcé affichées spatialement sous forme de cartes de rigidité appelées greffes ELA où les échelles de couleurs avec la greffe ELAs de rigidité montrent des différences frappantes dans la gamme et la distribution de la rigidité tissulaire dans le parenchyme pulmonaire normal et fibreux et de grandes variations spatiales de la rigidité, en particulier dans l’échantillon de poumon fibrotique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de caractériser l’environnement mécanique local du parenchyme pulmonaire en mesurant directement les propriétés élastiques locales du tissu pulmonaire frais à l’aide de la copie microscopique de la force atomique.