Imaging Résolution Sous-nanomètre avec modulation d'amplitude en microscopie à force atomique en liquide

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir la plus haute résolution d’imagerie possible dans un liquide, avec un AFM commercial et une modulation d’amplitude, également connue sous le nom de mode de tapotement. Cette méthode permet de repousser les limites du fonctionnement standard de l’AFM dans un liquide, en utilisant la meilleure combinaison de paramètres pour une haute résolution. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée avec la plupart des AFM commerciaux, et en tant que telle, elle ne nécessite aucun équipement spécialisé.

La méthode présentée ici s’adresse aux scientifiques et aux techniciens qui ont déjà des connaissances de base en AFM, mais qui souhaitent tirer le meilleur parti de la technique. Cette méthode ne vise pas un type particulier d’échantillon et peut être largement appliquée à des échantillons de physique, de biologie, de chimie, de matériaux et de sciences des services. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette technique auront du mal, car il faut un peu de patience pour trouver les meilleurs paramètres pour un échantillon donné.

Bain sonicate les instruments, et le disque supportant le substrat dans de l’eau ultra pure. Suivi d’isopropanol, et à nouveau d’eau ultra pure, chacun pendant 10 minutes. Lorsque l’on vise une haute résolution, toute contamination peut avoir des conséquences néfastes.

Portez des gants en tout temps et assurez-vous que toutes les surfaces ou tous les instruments qui entrent en contact avec l’échantillon, le cantilever ou la cellule AFM sont soigneusement nettoyés. Après sonication, séchez chacun des instruments et le disque d’échantillon sous un flux d’azote. Utilisez un disque d’acier comme support pour le mica, afin d’imager les ions métalliques absorbés uniques.

Nettoyez physiquement les surfaces qui ne peuvent pas être nettoyées par sonication en les essuyant avec des mouchoirs à faible peluche monocouche imbibés d’eau ultra pure, d’isopropanol et d’eau ultra pure séquentiellement. Laissez la surface sécher à l’air libre jusqu’à 30 minutes. Ensuite, préparez une petite quantité de colle époxy en mélangeant soigneusement les réactifs et placez environ 10 microlitres d’époxy sur le disque d’échantillon en acier propre.

Placez le substrat de mica sur l’époxy et fixez-le sur le disque d’acier en appliquant une pression sur le substrat. Laissez l’époxy durcir pendant plusieurs heures à une température élevée selon les spécifications du fabricant. Ensuite, appuyez fermement sur un morceau de ruban adhésif de 2,5 centimètres de large sur le substrat, de sorte que tout le visage soit couvert, et décollez en douceur la couche supérieure.

Répétez ce processus deux à trois fois jusqu’à ce que le mica soit lisse comme un miroir à l’œil. Plongez la puce en porte-à-faux dans un bain d’isapropanol suivi d’une eau ultra pure pendant 60 minutes chacun. Ensuite, exposez la pointe à la lumière UV jusqu’à cinq minutes afin de favoriser la formation de sites d’hydratation stables.

Des temps de surexposition plus longs peuvent endommager la pointe ou augmenter son rayon de courbure. Insérez le cantilever dans le support de cantilever de l’AFM et pipetez 25 microlitres de liquide d’imagerie sur le cantilever et la pointe pour pré-mouiller la surface. Cela réduira l’apparition de bulles d’air à l’approche de l’échantillon.

Faites fondre le disque d’échantillon et le substrat sur la platine d’échantillonnage et ajoutez une gouttelette du liquide d’imagerie à l’échantillon. Connectez ensuite le support en porte-à-faux à l’AFM. Rapprochez le cantilever et l’échantillon de manière à former un pont capillaire entre les fluides de l’extrémité du cantilever et ceux de l’échantillon.

Utilisez le logiciel AFM pour aligner le laser de mesure près de l’extrémité de la pointe du cantilever. Ensuite, déterminez la fréquence de résidence du porte-à-faux à partir du pic principal de son spectre thermique. Si la déflexion du cantilever est calibrée, l’ajustement du pic de résidence avec un modèle d’oscillateur harmonique simple donne la constante de ressort du cantilever.

Ensuite, réglez le cantilever en trouvant sa réponse d’amplitude lorsqu’il est entraîné de l’extérieur sur une gamme de fréquences proches de la fréquence de résonance identifiée dans le spectre thermique. Ajustez l’amplitude d’entraînement de sorte que l’amplitude d’oscillation libre soit d’environ cinq nanomètres. Cela correspond généralement à 0,2-0,8 volts sur la plupart des AFM.

Ensuite, ajustez le point de consigne d’amplitude à environ 80 % de l’amplitude libre. Ensuite, réglez les gains de retour d’information relativement élevés. Après vous être assuré qu’il n’y a pas d’instabilité ou de bourdonnement, réglez la vitesse de balayage initiale sur environ un hertz et la taille de balayage sur 10 nanomètres.

Amorcez l’approche de la pointe vers la surface à l’aide du logiciel de contrôle AFM. Évaluez si la pointe a atteint la surface sans commencer à imager en modifiant légèrement la valeur de consigne. Si la pointe est à la surface, l’effet sur l’extension de la zone ZPA devrait être négligeable.

Une fois que la pointe a atteint la surface, rétractez la zone ZPA et réaccordez le cantilever. La fréquence de résonance aura probablement évolué vers une valeur plus basse en raison des interactions de l’échantillon de pointe. Maintenant, changez le point de consigne à environ 80 % de l’amplitude libre nouvellement réglée et engagez le cantilever pour effectuer un balayage carré de 10 par 10 nanomètres de la surface en mode de modulation d’amplitude pour vérifier que les paramètres d’imagerie sont appropriés.

Vérifiez que les profils trace et retrace se superposent. Si ce n’est pas le cas, réduisez encore le point de consigne et essayez d’augmenter les gains. Si l’image devient bruyante, réduisez les gains.

Répétez l’opération avec une grande région d’un à cinq micromètres carrés de l’échantillon, si cela est possible. Sur les échantillons mous ou biologiques, cela peut entraîner une contamination de la pointe. Réduisez la taille du balayage à une valeur adaptée à la visualisation des caractéristiques qui vous intéressent.

Cela peut être aussi bas que 20 par 20 nanomètres. Ensuite, réduisez suffisamment l’amplitude d’entraînement du porte-à-faux pour que la boucle de rétroaction rétracte automatiquement la zone ZPA, améliorez la pointe de la surface. Lorsque le cantilever est éloigné de la surface, ajustez l’amplitude de l’entraînement de sorte que l’amplitude du cantilever soit d’un à deux nanomètres de crête à crête.

Réduisez progressivement le point de consigne par petites étapes, jusqu’à ce que la zone ZPA s’étende à nouveau vers la surface et que l’image d’origine soit récupérée. Maintenez l’amplitude du point de consigne entre 75 % et 95 % de la nouvelle amplitude libre. Ensuite, réajustez les gains, car des gains plus élevés peuvent être utilisés à des amplitudes plus faibles sans introduire de bruit significatif.

Optimisez le système pour trouver la meilleure combinaison d’amplitude libre, de point de consigne et de gain pour une haute résolution. Les conditions optimales du système dépendent de l’échantillon, des propriétés de mouillage du liquide et du porte-à-faux utilisé. Pour les interfaces solvophiles, utilisez des porte-à-faux avec une constante de ressort de 0,5 à deux newtons par mètre.

En utilisant cette technique, des images de résolution subnanométrique ont été obtenues sur une large gamme d’échantillons. Les échantillons mous présentés ici comprennent une bicouche lipidique, des membranes violettes d’halobacterium salinarum, une monocouche auto-assemblée de dimolécules amphophiles et des cristaux d’aquaporine provenant d’une membrane de lentille bovine. Dans chaque cas, les caractéristiques d’intérêt sont mises en évidence.

Les petites amplitudes d’oscillation et les points de consigne élevés minimisent la force exercée par la pointe sur l’échantillon, ce qui permet d’imager les assemblages fragiles des lipides dans la bicouche, des protéines dans les biomembranes natives et des molécules amphophiles en solution sans dommage. Des matériaux cristallins plus durs, tels que la calcite, la titanite de strontium, le carbure de silicium et les ions métalliques uniques absorbés sur une surface de mica, peuvent être imagés à l’aide de cette approche, car dans tous les cas, c’est le liquide interfacial qui est effectivement imagé, et non le cristal lui-même. Une fois maîtrisée, cette technique fournit une résolution au niveau moléculaire ou atomique dans le liquide presque à chaque fois qu’elle est exécutée correctement.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de garder à l’esprit qu’il s’agit du liquide interfacial qui est imagé. Cela signifie utiliser des conditions d’imagerie douces. La contamination de la pointe, de l’échantillon ou du liquide est généralement la principale cause de l’incapacité à atteindre une résolution élevée.

En cas de doute, il est souvent judicieux de nettoyer toutes les surfaces en contact avec le liquide et de réutiliser les solutions d’imagerie. Le bruit extérieur est également préjudiciable à la haute résolution. Un plancher à faibles vibrations, loin d’un conduit de ventilation, est préférable.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’optimiser vos paramètres d’imagerie pour obtenir un AFM haute résolution. Bien sûr, comme pour toute technique de pointe, il faut parfois plusieurs essais pour comprendre la meilleure façon d’imager un échantillon, la patience est donc la clé.