Name: Imaging Résolution Sous-nanomètre avec modulation damplitude en microscopie à force atomique en liquide (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Découvrez l'imagerie à résolution sous-nanomètre par microscopie à force atomique à modulation d'amplitude en milieu liquide. Cette méthode optimise les paramètres d'imagerie pour obtenir des résultats de haute qualité avec des AFM commerciaux standard.

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Financement de l&#39;ingénierie et de physique Sciences Research Council (Les subventions 1452230 et EP / M023915 / 1), la biotechnologie et Science Research Council biologique (accorder BB / M024830 / 1) et le Conseil européen (FP7 CIG 631.186) sont appréciés.

1. Nettoyage des outils et autres surfaces NOTE: Dans l&#39;optique de haute résolution, toute forme de contamination peut avoir des conséquences néfastes. Il est donc nécessaire de veiller à tous les outils utilisés pour manipuler l&#39;échantillon, substrat ou AFM conseils sont nettoyés à fond. Applicable à toute surface ou instrument (par exemple, une pince à épiler) qui peuvent entrer en contact avec l&#39;échantillon, en porte à faux, ou d&#39;une cellule de l&#39; AFM, y compris le stade de l&#39; échantillon lui - même. <ol><li> Bath-Soniquer les instruments dans l&#39;eau ultrapure (18,2 MQ, &lt;5 organiques ppm), suivie de l&#39;isopropanol (pureté de 99,7%), suivie par l&#39;eau à nouveau ultrapure, chacune pendant 10 min. Lorsque cela est possible, utiliser l&#39;isopropanol sous une hotte pour réduire l&#39;inhalation de fumées. </li><li> Sec sous un courant d&#39;azote. </li><li> Si l&#39; immersion totale est impossible (par exemple, pour cantilever titulaire / électronique), physiquement nettoyer la surface en essuyant avec un seul pli, des tissus à faible charpie (tissus légers essuie - glaces) trempé dans ultrapure de l&#39;eau, de l&#39;isopropanol et de l&#39;eau ultrapure, séquentiellement. Laisser la surface sécher à l&#39;air (généralement dans les 15 à 30 min). </li></ol> 2. Préparation du substrat NOTE: Le substrat désigne la surface solide supportant directement les échantillons, typiquement en contact physique à la fois avec le scanneur AFM et l&#39;échantillon. La plupart des AFMs ont un support magnétique et disques en acier peuvent être utilisés, mais le même protocole est également adapté pour des substrats tels que des lames de verre. Ici, nous supposons un disque d&#39;acier sur lequel un disque de mica est apposé. Le but de cette procédure est de limiter autant que les sources externes de contamination possibles qui peuvent affecter l&#39;imagerie. Les gants doivent être portés en tout temps. <ol><li> Baignoire à soniquer le disque échantillon d&#39;acier dans de l&#39;eau ultra-pure (18,2 MQ), suivi par de l&#39;isopropanol et enfin par de l&#39;eau ultrapure encore, chacun pendant 10 minutes. </li><li> Sécher les disques sous un flux d&#39;azote. </li><li> Préparer une petite quantité de colle époxy avec des réactifs mélangés soigneusement et lieu ~ 1081; l sur le disque en acier. </li><li> Fixer le substrat (muscovite, de SiO 2 cristalline, le verre, etc.) sur le disque en acier en appliquant une pression sur le substrat. Laisser sécher la colle pendant plusieurs heures à une température élevée (voir les spécifications du fabricant). </li><li> Veiller à ce qu&#39;aucune résine époxy est directement exposée à l&#39;air, autour des bords du substrat. Cela se produira si la quantité excessive d&#39;époxy est utilisé et peut devenir une source de contamination. <ol><li> Pour un substrat de mica, appuyez fermement ~ ruban adhésif 2,5 cm de large sur le substrat, de sorte que l&#39;ensemble du visage est couvert, et en douceur le retirer. Utilisez du ruban adhésif légèrement et peler le mica en tirant parallèlement à la surface. Le matériau enlevé est visible sur la bande. Répétez ce processus 2-3 fois, jusqu&#39;à ce que le mica est lisse comme un miroir à l&#39;œil. </li><li> Pour le verre / SiO 2, si une autre modification chimique de surface est nécessaire, répéter la routine bain-sonication des étapes 2.1-2.2. Vous pouvez également utiliser Uunité d&#39;exposition de V (lampes UV-C germicides 18 W) pour 30-60 min, en fonction de la puissance) à pyrolyser des matières organiques qui peuvent être laissés à la surface. Cette procédure rend également la surface plus hydrophile sans augmenter de manière significative la rugosité. </li></ol></li></ol> 3. Préparation du cantilever et Conseil <ol><li> Immerger la puce en porte à faux dans un bain d&#39;isopropanol, puis de l&#39;eau ultra-pure, chacune pendant 60 min. </li><li> Si la console / pointe nécessite un nettoyage complet (par exemple, après un stockage prolongé dans la boîte de gel), ajouter un trempage de 30 minutes dans de l&#39; acétone (&gt; 99,5% de pureté) avant l&#39; étape 1 (voir également la section portant sur la contamination). Le stockage des conseils dans des boîtes de gel est, dans notre expérience, l&#39; une des principale source de contamination qui peut se produire très rapidement 59. </li><li> Exposer la pointe aux UV brièvement la lumière (&lt;5 min) afin de favoriser la formation de sites d&#39;hydratation stables 60. Évitez de plus longs temps de surexposition car il peut endommager la pointe ou incRease son rayon de courbure. </li><li> Insérez le cantilever en porte à faux de la porte et la pipette de l&#39;AFM ~ 50 pi de solution d&#39;imagerie (la nature de la solution dépendra de l&#39;échantillon à l&#39;étude, mais dans ce cas utiliser une solution à 10 mM de chlorure de rubidium dans l&#39;eau ultrapure) sur la console et la pointe de pré-humide, il; cela va limiter l&#39;apparition de bulles d&#39;air à l&#39;approche de l&#39;échantillon. </li></ol> 4. Mise en place de l&#39;AFM cellulaire <ol><li> Monter le disque de l&#39;échantillon et le substrat sur la scène de l&#39;échantillon et ajouter une goutte de liquide d&#39;imagerie (liquide généralement 2-3 mm d&#39;épaisseur à son point le plus haut). </li><li> Connectez le support en porte à faux à l&#39;AFM. </li><li> Amener le porte à faux et de l&#39;échantillon à proximité immédiate de manière à former un pont capillaire entre les fluides sur le cantilever / pointe et l&#39;échantillon. </li></ol> 5. Initialisation Mesure et étalonnage du cantilever <ol><li> Aligner le laser de mesure (généralement rouge) à proximité de la pointe-end du cantilever. Selon le modèle de l&#39;AFM, le faire soit via des commandes de logiciel ou par le réglage manuel de la position du laser. Acquérir spectre thermique du cantilever dans un liquide (voir la figure 1A). Le processus enregistre les fluctuations thermiques de la console à l&#39;aide du laser, afin de trouver la fréquence de résonance principale de la console (de eigenmode fondamentale). Dans la plupart AFM moderne, cela se fait par le biais des procédures automatisées dans les contrôles logiciels, mais les détails peuvent varier d&#39;AFM à l&#39;AFM. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig1.jpg" /> Figure 1: Tuning et calibrer le cantilever. A: thermique spectre de bruit de déviation verticale de la console (noir) avec un simple ajustement oscillateur harmonique (SHO) de la eigenmode fondamentale (rouge). Ici, la résonance est de 18,7 kHz dans l&#39;eau. Les trois premières fréquences de résonance qui correspondent aux trois premiers modes propres de flexion sont Highlighted avec des flèches bleues. B: Calibrage de Inverse optique Levier Sensibilité du cantilever. Le débattement linéaire de la poutre en appui contre une surface rigide (non déformable) est utilisé pour mesurer le facteur de conversion (de InvOLS) entre la déformation mesurée en volts et la valeur correspondante en nanomètres. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol start="2"><li> Enregistrer une déviation par rapport à la courbe de distance avec le porte à faux sur un support rigide (par exemple, le mica ou le verre) et calibrer la déviation en imposant que la pente de la courbe dans la zone de déviation linéaire (comme sur la figure 1B) est l&#39; unité 61-63. NOTE: Ce procédé trouve le facteur de conversion entre la déformation mesurée sur le photodétecteur (en volts) et le braquage réel du cantilever (en nanomètres) - known comme Inverse optique Levier Sensibilité (InvOLS). Le calibrage peut endommager la pointe, il est donc préférable d&#39;effectuer après toutes les mesures sont terminées. Utilisez la valeur de InvOLS dérivée pour une autre console du même type lors d&#39;une expérience précédente pour obtenir une estimation (en général&gt; 90% de précision) de l&#39;amplitude réelle avant le calibrage. </li><li> Monter le pic de résonance dans le spectre thermique avec un modèle simple de l&#39; oscillateur harmonique 64-66 pour obtenir la constante du ressort du cantilever. Cette procédure est automatisée dans la plupart des logiciels de l&#39;AFM et ne nécessite généralement pas des connaissances spécialisées du modèle en question. </li><li> Tune le cantilever. Trouver la réponse en amplitude de la poutre lorsqu&#39;elle est entraînée à l&#39; extérieur (par exemple acoustique ou par photothermique excitation) sur une plage de fréquences proches de la fréquence de résonance nominale. Régler la fréquence d&#39;entraînement à la proximité du maximum dans ce spectre, un peu vers la gauche. Si la poutre est acoustically entraîné, de nombreux maxima parasites peut apparaître lors du réglage. <ol><li> Sélectionner un pic de résonance aussi proche que possible (et à l&#39;intérieur de l&#39;enveloppe), la résonance identifiés dans le spectre thermique en utilisant le logiciel de contrôle de l&#39;AFM mais des détails peuvent dépendre du type et la version du logiciel qui contrôle l&#39;AFM. </li></ol></li></ol> 6. Approche et Check initiale de l&#39;échantillon <ol><li> Régler l&#39;amplitude d&#39;entraînement de telle sorte que l&#39;amplitude d&#39;oscillation libre est d&#39;environ 5 nm. Cela correspond généralement à 0,2-0,8 V sur la plupart des AFMs (dans le cas où les InvOLS ne sont pas calibrés). Ajuster la valeur de consigne d&#39;amplitude à environ 80% de l&#39;amplitude libre. </li><li> Définissez les gains de rétroaction relativement élevée (la valeur absolue dépend de l&#39;AFM), mais veiller à ce qu&#39;aucune instabilité ou de sonnerie se produit. </li><li> Réglez la vitesse de balayage initiale et la taille de balayage pour les petites valeurs (par exemple, à ~ 1 Hz et 10 nm respectivement). Cela permet de préserver la pointe au cas où certains paramètres de retour sont mal ajustésen évitant le balayage sur de grandes distances. La taille de numérisation peut ensuite être augmentée à une valeur plus grande (par exemple, 100 nm) si les conditions de numérisation semblent appropriés. </li><li> Déterminer la hauteur approximative de la surface (dans certains cas, cela doit être fait optiquement) avant l&#39;approche. </li><li> Initier l&#39;approche de la pointe à la surface à l&#39;aide du logiciel de commande AFM. Les petits détails de ce processus dépendra du modèle de l&#39;AFM et les logiciels utilisés. <ol><li> S&#39;il y a des problèmes avec l&#39;approche lors de l&#39;utilisation d&#39;un porte à faux doux, effectuer l&#39;approche en mode contact. Dans ce cas, veiller à ce que les gains sont plus faibles que dans le mode AM, et régler la consigne à une valeur relativement faible (0,1-0,2 V après le centrage du laser sur le photodétecteur) pour préserver la pointe. </li><li> Évaluer si la pointe a atteint la surface sans commencer à l&#39;image en changeant légèrement la valeur de consigne (augmentation en mode contact ou une diminution en mode AM). Si la pointe est à la surface, l&#39;effet sur til extension de la Z-piezo devrait être négligeable. Les mouvements en direct de la Z-piezo sont généralement affichés graphiquement dans le logiciel de contrôle de la plupart AFM. Si le changement de consigne déclenche un mouvement visible de l&#39;élément piézoélectrique, ce qui indique une fausse engager. Dans ce dernier cas, re-démarrer l&#39;approche de la position actuelle de la pointe, en utilisant un peu plus élevé (contact) ou inférieur (AM) consigne. </li></ol></li><li> Une fois que la pointe a atteint la surface, rétracter le Z-piezo (habituellement en appuyant simplement sur &#39;stop&#39;) et réaccorder le cantilever (répétez l&#39;étape 5.4.); la fréquence de résonance aura probablement changé à une valeur inférieure en raison d&#39;interactions tip-échantillons. </li><li> Pour changer le point de ~ 80% de l&#39;amplitude libre nouvellement accordé (à ce bout-échantillon à distance) ensemble. </li><li> Engager le cantilever et procéder à une analyse nm 2 10 × 10 de la surface en mode AM pour vérifier que les paramètres d&#39;imagerie sont appropriés. <ol><li> Vérifier que la trace (balayage de gauche à droite) et retracer (balayage de droite à gauche)profils superposent. Si pas davantage réduire la consigne et essayez d&#39;augmenter le gain. </li><li> Abaisser les gains si l&#39;image devient bruyant. </li></ol></li><li> Répéter l&#39;opération avec un grand - 1 × 1 pm 2 à 5 x 5 pm 2 - analyse de l&#39;échantillon à condition que cela est possible. Sur des échantillons mous ou biologiques, cela pourrait entraîner une contamination de la pointe. </li></ol> 7. haute résolution d&#39;imagerie <ol><li> Réduire la taille de balayage à une valeur appropriée pour visualiser les caractéristiques (par exemple, 100 x 100 nm 2 pour les cristaux de protéine ou de 20 x 20 nm à 2 mica ou calcite). </li><li> Réduire l&#39;amplitude d&#39;entraînement du levier suffisant pour la boucle de rétroaction de se rétracter automatiquement le Z-piezo et donc la pointe de la surface. Alors que le cantilever est éloignée de la surface, ajuster l&#39;amplitude d&#39;entraînement de sorte que l&#39;amplitude du cantilever est d&#39;environ 1-2 nm (crête à crête). </li><li> Utilisation du logiciel de commande AFM, Progresréduire sivement la consigne de quelques dizaines de mV à un moment jusqu&#39;à ce que le Z-piezo étend à nouveau vers la surface et l&#39;image originale est récupérée. Gardez l&#39;amplitude de consigne entre 75% et 95% de la nouvelle amplitude libre. </li><li> Réajuster les gains en utilisant le logiciel de contrôle de l&#39;AFM; des gains plus élevés peuvent être utilisés à des amplitudes plus faibles sans introduire de bruit important. <ol><li> Répétez les étapes 7,2-7,4 afin de déterminer la meilleure combinaison de libre amplitude, consigne et gagner pour la haute résolution. Les conditions optimales dépendent de l&#39;échantillon (solvatation paysage et les propriétés de mouillage du liquide), mais aussi le cantilever (constante de ressort, la raideur). </li><li> Explorez différentes combinaisons d&#39;amplitudes pour optimiser les conditions d&#39;imagerie. Il peut être nécessaire d&#39;augmenter à nouveau l&#39;amplitude libre 42. Dans un tel cas, réglez d&#39; abord la consigne à une valeur plus élevée et ensuite augmenter le lecteur (ie, la procédure inverse de celle utilisée pour diminuer l&#39;amplitude). </li><li> Gardez le setpoint amplitude dans la gamme de 0,5 nm - 1,5 nm (crête à crête) avec des rapports de consigne maintenue au-dessus de 0,7 (typiquement ,75 à 0,95). Pour les interfaces solvophilic, utilisez cantilevers avec une constante de printemps de 0,5 à 2 N / m. Cela est suffisant pour la pointe pour éliminer la majeure partie du liquide interfaciale sans toucher la surface. Une règle de base est proposé dans l&#39;équation. 4 référence 29. </li></ol></li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Depuis son invention, il y a trois décennies, la microscopie à force atomique (AFM) 1 a imposé comme une technique de choix pour l&#39; étude des échantillons à l&#39;échelle nanométrique, en particulier lorsque la moyenne sur des surfaces macroscopiques est pas possible et l&#39; information locale est nécessaire. Dans une mesure typique de l&#39;AFM, la déviation d&#39;un bras de levier flexible est utilisé pour quantifier la force d&#39;interaction entre un petit nombre de molécules et d&#39;une pointe de ultrasharp monté à l&#39;extrémité du cantilever. Selon le type d&#39;interactions et les échelles de temps considérées, un large éventail d&#39;informations peuvent être dérivées, y compris les propriétés viscoélastiques des membranes biologiques mous 2,3, la force d&#39;un seul produit chimique ou de liaison moléculaire 4,5, les détails d&#39;un atomistique surface 6-8, le 9 magnétique, capacitif 10, la conduite 11, thermiques et chimiques 12,13 14 propriétés d&#39;échantillons <sup&gt; 15. Une partie du succès de l&#39; AFM est sa capacité à travailler sur une large gamme de matériaux 16 et dans de multiples environnements tels que le vide 17, gaz ou liquide 11,18 19,20, car il ne repose pas sur une force spécifique entre la sonde et de l&#39; échantillon . En pratique, toutefois, l&#39;exploitation de l&#39;AFM dans des conditions autres que la température ambiante peut être des résultats difficiles et nombreux sont encore publiés obtenus dans l&#39;air. Une difficulté supplémentaire provient du fait qu&#39;il est généralement nécessaire pour faire fonctionner l&#39;AFM en mode dynamique (pointe vibrante) afin de préserver à la fois la pointe et l&#39;échantillon en évitant d&#39;importantes forces de frottement. Bien que plus difficile, le fonctionnement dynamique peut, en principe, de fournir plus d&#39;informations sur l&#39;échantillon analysé, et sans perte de résolution spatiale. Au cours de la dernière décennie, le domaine de l&#39; AFM dynamique liquide a connu des développements importants, depuis l&#39;avènement de l&#39; AFM vidéo taux de 21 - 23, des mesures multifréquences <sup&gt; 24,25 et sous-nanomètre imagerie des structures d&#39;hydratation au niveau des interfaces 26 - 31. Le fonctionnement de l&#39; AFM tout immergé dans un liquide est maintenant couramment utilisé en biologie et biophysique 32-36, la recherche de polymère 37, électrochimie 38 - 40 et interfaces solide-liquide caractérisation 41-44. La présence de liquide autour du levier vibrant modifie considérablement sa dynamique 45, ainsi que l&#39;interaction entre la pointe et l&#39;échantillon 29,42. Lorsqu&#39;il est utilisé de manière appropriée, le liquide peut être exploitée pour améliorer la résolution d&#39;imagerie 26,29, avec une amélioration typique de presque un ordre de grandeur par rapport à la meilleure résolution obtenue dans des conditions ambiantes 46. Dans AFM, la résolution spatiale la plus élevée possible pour une mesure particulière dépend à la fois la qualité de l&#39;AFM lui-même et la nature de til interaction sondé 20,47,48. À l&#39;heure actuelle, plus haut de gamme, AFMS disponibles dans le commerce présentent des niveaux de bruit qui sont proches de celle de la limite thermique 12 de sorte que le facteur déterminant pour la résolution est généralement l&#39;interaction pointe-échantillon. Il est effectivement le gradient spatial de cette interaction qui détermine la résolution: mesures basées sur courte distance, en décomposition rapide interaction produisent les résultats de la résolution plus élevée que lorsque les interactions à longue portée sont en jeu. Dans un liquide, les forces de solvatation peuvent améliorer la résolution d&#39;image car elles ont tendance à disparaître au- dessus de quelques diamètres moléculaires du liquide (typiquement &lt;1 nm) lors du déplacement à une distance de la surface de l&#39;échantillon 49. Ces forces proviennent de l&#39;interaction entre les molécules de liquide et la surface de l&#39;échantillon. Un liquide ayant une affinité forte pour la surface aura tendance à être plus ordonné et moins mobile que le liquide en vrac à l&#39;interface avec l&#39;échantillon 29,42,50. Par conséquent,il faudra plus d&#39; énergie pour une pointe d&#39;AFM vibrant pour déplacer les molécules liquides interfaciale vrac liquide 42, ce qui rend la mesure très sensible aux variations locales dans les propriétés liquides interfaciale à l&#39;échelle nanométrique -le solvatation paysage. Afin d&#39;exploiter les forces de solvatation, plusieurs aspects pratiques doivent être pris en considération. En premier lieu, l&#39;amplitude d&#39;oscillation de l&#39;embout doit être comparable à la plage des forces de solvatation, typiquement &lt;1 nm. Deuxièmement, le liquide utilisé doit former un paysage de solvatation bien définie à la surface de l&#39;échantillon. Macroscopiquement, ce qui équivaut à imposer un liquide de «mouillage» pour l&#39;échantillon considéré. Par exemple, dans l&#39; eau , il est plus facile d&#39;obtenir une résolution au niveau moléculaire de mica hydrophile que le graphite hydrophobe 42,51. Enfin, la constante du ressort de la poutre supportant la pointe doit être choisie de façon appropriée 52,53. Lorsque vous travaillez dans ces conconditions, l&#39;AFM ne fournissent pas seulement des images de niveau moléculaire de l&#39;interface, mais il tire également des informations sur l&#39;affinité locale échantillon liquide qui peut être utilisé pour obtenir de l&#39; information chimique sur la surface de l&#39;échantillon 54. Les modes les plus dynamiques de fonctionnement communs pour l&#39;AFM en liquide sont à modulation d&#39;amplitude (AM, aussi «mode tapping») AFM et à modulation de fréquence (FM) AFM. Dans le premier cas 55, la pointe raster-analyse de l&#39;échantillon tandis que son amplitude de vibration est maintenue constante par une boucle de rétroaction qui continue ré-ajuste la distance pointe-échantillon. Une image topographique de l&#39;échantillon est obtenue à partir de la correction appliquée par la boucle de rétroaction. En FM-AFM 28,41,56, il est la fréquence d&#39;oscillation du cantilever / pointe qui est maintenue constante tandis que la pointe balaye l&#39;échantillon. Les deux techniques offrent une résolution topographique comparable dans le liquide 36,57. Quantification de l&#39;interaction pointe-échantillon tend à être plus straightforward et précis dans FM-AFM, mais AM-AFM est plus facile à mettre en œuvre, plus robuste, et permet de travailler avec cantilevers plus doux, quelque chose d&#39;utile pour l&#39;étude des échantillons facilement déformables ou délicats. De manière significative, AM-AFM est plus répandue chez les utilisateurs de l&#39;AFM, en partie pour des raisons historiques, mais aussi en raison du fait qu&#39;il est techniquement plus facile à contrôler. Bien que l&#39;amplitude est maintenue constante par la boucle de rétroaction lors de l&#39;imagerie AM-AFM, la phase-décalage entre l&#39;oscillation de la pointe et l&#39;oscillation d&#39;entraînement est autorisé à changer librement. Le retard de phase peut fournir des informations utiles sur les interactions de la pointe-échantillon, étant lié à l&#39;énergie dissipée pendant l&#39; oscillation de la pointe à l&#39;interface avec l&#39;échantillon 58. Ainsi la phase d&#39;imagerie peut être acquis en même temps à l&#39;imagerie topographique, et est souvent complémentaire à mettre en évidence l&#39;hétérogénéité d&#39;une surface de l&#39;échantillon. l&#39;imagerie de phase a été utilisée pour la cartographie des interactions différentes, y compris le dicartographie rect de l&#39; énergie d&#39;adhérence 42, 58 propriétés viscoélastiques et le paysage d&#39;hydratation d&#39;une interface 44. Pratiquement, l&#39;obtention d&#39;images à haute résolution dans le liquide reste non négligeable en raison du grand nombre de paramètres à contrôler, et l&#39;absence d&#39;un protocole simple et systématique qui fonctionne dans toutes les situations. La qualité d&#39;image dépend généralement de la géométrie en porte à faux et l&#39; élasticité, la composition chimique de pointe, l&#39;amplitude d&#39;oscillation et la raideur de l&#39; échantillon, entre autres 55. Les mesures de l&#39;AFM sont aussi, par définition, perturbatifs au système. En conséquence, l&#39;évolution des variables d&#39;imagerie et les conditions environnementales sans considérations appropriées peut conduire à des difficultés de reproductibilité et / ou observations misrepresentative et des résultats erronés. Ici, nous vous présentons notre protocole pour obtenir des images à haute résolution d&#39;échantillons durs et mous en solution, en utilisant des instruments commerciaux exploités en amplitude-modulation. Notre objectif est d&#39;offrir une procédure pratique pour optimiser les principaux paramètres susceptibles d&#39;influer sur la résolution sur différents échantillons, en expliquant dans chaque cas la justification de nos choix à partir des principes physiques sous-jacents du processus d&#39;imagerie. Nous détaillons une approche étape par étape, à partir du substrat de nettoyage et de préparation, au choix du cantilever, réglage des paramètres d&#39;imagerie et de la résolution des problèmes communs. Expliquer le raisonnement scientifique derrière nos choix et nos procédures de haute résolution devrait aider à faire des choix rationnels lors de l&#39;adaptation de la méthodologie, et de servir de point de départ pour les systèmes d&#39;imagerie de nouveaux. Dans tout le texte, nous utilisons AM pour désigner le mode de fonctionnement à modulation d&#39;amplitude d&#39;un AFM. Nous nous référons au paramètre de rétroaction maintenue constante pendant la déviation soit en porte à faux (mode de contact) ou l&#39; amplitude d&#39; oscillation (mode AM) en tant que valeur de consigne. En mode AM, le cantilever est entraîné à l&#39;extérieursoit par une oscillation acoustique ou par un laser pulsé focalisé sur la base de la poutre. L&#39;amplitude d&#39;entraînement est l&#39;intensité du signal oscillant externe. La valeur absolue de l&#39;amplitude d&#39;entraînement nécessaire pour obtenir une amplitude d&#39;oscillation donnée du cantilever dépend de nombreux paramètres tels que la méthode d&#39;entraînement (acoustique, photothermique ou magnétique), en porte à faux fixation et les paramètres (raideur, la géométrie) et l&#39;alignement du laser. La valeur exacte de l&#39;amplitude d&#39;entraînement est donc pas pertinent, mais il est ajusté dans chaque expérience de manière à fournir une amplitude d&#39;oscillation appropriée (et quantifiable) de la poutre. Lorsque le cantilever entraîné est loin de l&#39;échantillon et aucun amortissement de sa vibration se produit à travers des interactions pointe-échantillon, son amplitude d&#39;oscillation est appelée l&#39;amplitude d&#39;oscillation libre. Lorsque la pointe vibrante se rapproche de la surface de l&#39;échantillon, son amplitude commence à diminuer. Si le retour est activé, le z-piezo sera constantly réajuster son extension afin de quille l&#39;amplitude de consigne sélectionnée, constante. La valeur de consigne est normalement toujours inférieure à l&#39;amplitude libre. Il est courant de se référer au rapport de consigne, le rapport de l&#39;amplitude de consigne (imagerie d&#39; amplitude) sur l&#39;amplitude libre. Plus le rapport de consigne, le plus sévère des conditions de formation d&#39;image sont.

<table><tbody><tr><td>Multimode IIIA AFM</td><td>Brucker</td><td>NA</td><td>L’une des machines utilisées</td></tr><tr><td>Cypher ES AFM</td><td>Asylum Resarch</td><td>NA</td><td>L’une des machines utilisées</td></tr><tr><td>AFM cantilever/pointe</td><td>Nanoworld</td><td>Arrow UHF-AUD</td><td>le meilleur pour les AFM haute fréquence</td></tr><tr><td>cantilever/pointe</td><td>Olympus</td><td>RC800-PSA</td><td>eau ultrapure polyvalente et bon marché</td></tr><tr><td></td><td>Milipore</td><td>NA</td><td>les systèmes de filtrage de laboratoire peuvent induire une contamination</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Sigma-Aaldrich</td><td>200-664-3&nbsp ;</td><td>Produit chimique standard, pas d’épuration supplémentaire</td></tr><tr><td>Sels monovalents</td> Produit chimique standard <td>Sigma-Aaldrich</td><td></td><td>, pas d’autre purification</td></tr><tr><td>Lipides</td><td>Avanti Polar Lipides</td><td></td><td>bicouches lipidiques formées à l’aide de protocoles stadard</td></tr><tr><td>Cristaux</td><td>MTI</td><td></td><td>Cristaux polis</td></tr><tr><td>Scotch Ruban</td> adhésif <td>3M</td><td>Scotch Magic Tape</td><td>Le ruban adhésif translucide fonctionne le mieux. Le transparent colle trop fort</td></tr></tbody></table>

imaging résolution sous-nanomètre avec modulation d&#39;amplitude en microscopie à force atomique en liquide

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

La microscopie à force atomique (AFM) est devenue une technique bien établie pour l’imagerie à l’échelle nanométrique d’échantillons dans l’air et dans les liquides. Des études récentes ont montré que lorsqu’elles sont utilisées en mode de modulation d’amplitude (tapping), des images de résolution atomique ou moléculaire peuvent être obtenues sur une large gamme d’échantillons mous et durs dans un liquide. Dans ces situations, les petites amplitudes d’oscillation (SAM-AFM) améliorent la résolution en exploitant le liquide solvaté à la surface de l’échantillon. Bien que la technique ait été appliquée avec succès dans des domaines aussi divers que la science des matériaux, la biologie, la biophysique et la chimie des surfaces, l’obtention d’images à haute résolution dans un liquide peut encore rester difficile pour les utilisateurs novices. Cela est dû en partie au grand nombre de variables à contrôler et à optimiser, telles que le choix du cantilever, la préparation des échantillons et la manipulation correcte des paramètres d’imagerie. Ici, nous présentons un protocole permettant de réaliser des images haute résolution d’échantillons durs et mous en fluide à l’aide de SAM-AFM sur un instrument commercial. Notre objectif est de fournir un guide pratique étape par étape pour obtenir des images à haute résolution, y compris le nettoyage et la préparation de l’appareil et de l’échantillon, le choix du cantilever et l’optimisation des paramètres d’imagerie. Pour chaque étape, nous expliquons la logique scientifique de nos choix afin de faciliter l’adaptation de la méthodologie au système spécifique de chaque utilisateur.

Le protocole décrit dans la section précédente a été appliquée avec succès avec plusieurs AFMs commerciales pour obtenir des images molecular- ou au niveau atomique. Toutes les images ont été obtenues avec des amplitudes de travail entre 0,5 nm et 1,5 nm ajustés individuellement à la suite de la procédure étapes 7,1-7,4. Les résultats pourraient être obtenus sur une large gamme de doux (Figure 2) et (figure 3) échantillons rigides. Dans chaque cas, les caractéristiques d&#39;intérêt sont mis en évidence. Un des grands avantages de la technique est que les petites amplitudes d&#39;oscillation et points de consigne élevés réduisent la force exercée par la pointe sur l&#39;échantillon, ce qui permet fragiles auto-assemblages de lipides (Figure 2A), des protéines (Figure 2B et D), et molécules amphiphiles (figure 2C) à imager sans dommage en solution. Les matériaux plus durs cristallins tels que les minéraux (figures 3A, B, D) etdes ions métalliques simples adsorbées sur une surface (figure 3C) peuvent être imagés en utilisant l&#39;approche , car dans tous les cas, il est interfaciale du liquide qui est effectivement imagée avec le protocole décrit. Les forces de solvatation sont comparables sur les échantillons figures 2 et 3 indiquées: tous les échantillons sont hydrophiles (plus généralement &quot;solvophilic&quot; dans le cas des figures 2C, 3B, 3D) par rapport à la solution d&#39;imagerie. Constamment, cantilevers avec rigidité comparable (0,2 à 0,8 N / m) ont été utilisés dans tous les cas. Tant l&#39;échantillon et la pointe doivent être solvophilic pour assurer que les molécules liquides forment une structure de solvatation bien définie qui peut être imagé. Cela ne veut pas toujours une condition suffisante, mais dans la plupart des cas, et pour des molécules relativement petites de liquide, le liquide se restructure d&#39;une manière qui imite l&#39;échantillon de symétrie. Le principal moteur de la haute résolution est la variation locale de l&#39;affinité des molécules de solvant adsorbéespour les surfaces (Ångström échelle, dans le cas des figures 2A, 3A, 3C). La technique est donc mieux adaptée aux matériaux dont la structure solvant varie dans une large mesure sur toute la surface. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig2.jpg" /> Figure 2: interfaces souples imagées par AM-AFM dans des solutions aqueuses. A: dipalmitoyl-phosphatidylcholine (DPPC) bicouche lipidique dans la phase de gel imagé dans de KCl 150. Les groupes de tête lipidiques hexagonale emballés se distinguent à la fois la topographie et de la phase, ainsi que le contraste local indiquant les variations spécifiques au site dans l&#39;hydratation. B: membranes pourpres de Halobacterium salinarum imager en mM KCl, 150 mM de Tris 10, pH 7,4. Plusieurs trimères de protéines bactériorhodopsine sont mis en évidence. La phase présente un contraste différent de la topographie due à des sites d&#39;hydratation locales sur les protéines. trimères de protéines individuelles<html> peut être établie (lignes en pointillés). C: colorant amphiphiles (Z907) de molécules adsorbées à la surface d&#39;une nanoparticule de TiO 2 dans une cellule solaire sensibilisée par un colorant. L&#39;image a été acquise en sulfone d&#39;éthyle-isopropylique. L&#39;apparence semblable à une éponge est créé par les molécules adsorbées de colorant. D: cristal aquaporine dans les membranes de lentille bovine native imagées dans le même tampon que B. Un tétramère aquaporine est mis en surbrillance. Sous-structure correspondant à des boucles inter-hélicoïdaux sont visibles dans la topographie tandis que la phase montre un contraste étonnamment différent en raison du comportement de l&#39;eau inhabituelle près de la protéine. Les images sont adaptées de refs 36 (B), ref 38 (C) et 67 ref (D). La barre d&#39;échelle est de 5 nm (A), 10 nm (B), 3 nm (C), et 15 nm (D) L&#39;échelle de couleur indique respectivement une hauteur et une variation de phase de 200 h et 15 ° (A), 600 h et 4 ° (B), 2,5 nm et 2,5 ° (C), et 1,6 nm et 9,5 ° (D).charge / 54924 / 54924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig3.jpg" /> Figure 3: images représentant AM-AFM d&#39;échantillons durs dans des solutions fluides. A: calcite cristalline [ <img alt="équation2" src="/files/ftp_upload/54924/54924equation2.jpg" /> ] Surface imagée dans une solution d&#39;eau ultra pure équilibrée. B: le titanate de strontium imagé obtenu dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). Haute résolution n&#39;a pas été possible dans l&#39;eau. C: muscovite mica imagé en mM RbCl 3 - ions adsorbées simples Rb + sont visibles sur les sites du réseau du mica dans les deux scans de phase et de la hauteur. D: Le carbure de silicium dans imagé dans le DMSO. Les arrangements cristallographiques attendus sont présentés dans les images B et D. Les images sont adaptées de ref 68 (A), ref 42 (B et D),ref et 44 (C). La barre d&#39;échelle est de 3 nm (A, B, D) et 5 nm (C). L&#39;échelle de couleur indique respectivement une hauteur et une variation de phase de 250 pm et 14 ° (A), 600 h et 5,5 ° (B), 800 pm et 15 ° (C) et 500 h et 3,5 ° (D). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Nous présentons une méthode pour réaliser des images de résolution sous-nanomètre avec (mode tapping) modulation d&#39;amplitude en microscopie à force atomique dans un liquide. La méthode est mise en évidence sur les microscopes à force atomique commerciales. Nous expliquons les raisons de nos choix de paramètres et de suggérer des stratégies d&#39;optimisation de la résolution.

Imaging Résolution Sous-nanomètre avec modulation d&#39;amplitude en microscopie à force atomique en liquide

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir une imagerie en liquide avec la résolution la plus élevée possible, à l'aide d'un microscope à force atomique (AFM) commercial fonctionnant en modulation d'amplitude, également connu sous le nom de mode tapping. Cette méthode permet de repousser les limites du fonctionnement standard de l'AFM en liquide, en utilisant la meilleure combinaison de paramètres pour une haute résolution. Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut être utilisée avec la plupart des AFM commerciaux, et ne nécessite donc aucun équipement spécialisé.La méthode présentée ici s'adresse aux scientifiques et techniciens qui possèdent déjà des connaissances de base en microscopie à force atomique (AFM), mais qui souhaitent tirer davantage parti de cette technique. Cette méthode ne cible aucun type d'échantillon particulier et peut être largement appliquée à des échantillons provenant des sciences physiques, biologiques, chimiques, des matériaux et des sciences des surfaces. En général, les personnes novices dans cette technique éprouveront des difficultés, car il faut une certaine patience pour trouver les meilleurs paramètres pour un échantillon donné.Placer les instruments et le disque supportant le substrat dans un bain de sonication contenant de l'eau ultra-pure, suivre par de l'isopropanol, puis de nouveau de l'eau ultra-pure, chacun pendant 10 minutes. Lorsqu'on vise une haute résolution, toute contamination peut avoir des conséquences néfastes.Portez des gants en tout temps et assurez-vous que toutes les surfaces ou instruments entrant en contact avec l'échantillon, le levier ou la cellule de MFA sont soigneusement nettoyés. Après la sonication, séchez chaque instrument et le disque d'échantillon sous un flux d'azote. Utilisez un disque en acier comme support pour la mica afin d'imaginer des ions métalliques simples absorbés.Nettoyez physiquement les surfaces qui ne peuvent pas être nettoyées par ultrasons en les essuyant avec des feuilles de tissu peu pelucheux trempées dans de l'eau ultra-pure, de l'isopropanol, puis de l'eau ultra-pure, successivement. Laissez la surface sécher à l'air pendant jusqu'à 30 minutes. Ensuite, préparez une petite quantité de colle époxy en mélangeant soigneusement les réactifs, puis déposez environ 10 microlitres d'époxy sur le disque-échantillon en acier propre.Placez le substrat de mica sur l'époxy et fixez-le au disque d'acier en exerçant une pression sur le substrat. Laissez durcir l'époxy pendant plusieurs heures à une température élevée, conformément aux spécifications du fabricant. Ensuite, appuyez fermement une bande de ruban adhésif de 2,5 centimètres de large sur le substrat, de sorte que toute la surface soit recouverte, puis décollez doucement la couche supérieure.Répétez ce processus deux à trois fois jusqu'à ce que le mica soit parfaitement lisse à l'œil. Plongez la puce de levier dans un bain d'isopropanol, puis dans de l'eau ultra-pure, chacun pendant 60 minutes. Ensuite, exposez la pointe à la lumière UV pendant cinq minutes au maximum afin de favoriser la formation de sites d'hydratation stables.Des durées d'exposition trop longues peuvent endommager la pointe ou augmenter son rayon de courbure. Insérez le levier dans le porte-levier du microscope à force atomique (AFM) et pipetez 25 microlitres du liquide d'imagerie sur le levier et la pointe afin de pré-mouiller la surface. Cela réduira l'apparition de bulles d'air lors de l'approche de l'échantillon.Faites fondre le disque d'échantillon et le substrat sur la platine d'échantillon et ajoutez une goutte de liquide d'imagerie sur l'échantillon. Ensuite, reliez le porte-cantilever au microscope à force atomique (AFM). Rapprochez le cantilever et l'échantillon suffisamment pour former un pont capillaire entre les fluides présents à l'extrémité du cantilever et ceux situés sur l'échantillon.Utilisez le logiciel de microscopie à force atomique (AFM) pour aligner le laser de mesure près de l'extrémité de la pointe du levier. Ensuite, déterminez la fréquence de résonance du levier à partir du pic principal de son spectre thermique. Si la déflexion du levier est calibrée, l'ajustement du pic de résonance à l'aide d'un modèle d'oscillateur harmonique simple permet d'obtenir la constante de raideur du levier.Ensuite, régler le levier en déterminant sa réponse en amplitude lorsqu'il est excité de manière externe sur une gamme de fréquences proche de la fréquence de résonance identifiée dans le spectre thermique. Ajuster l'amplitude d'excitation de sorte que l'amplitude d'oscillation libre soit d'environ cinq nanomètres. Cela correspond généralement à 0,2-0,8 volt sur la plupart des MFA.Ensuite, réglez le point de consigne d'amplitude à environ 80 % de l'amplitude libre. Puis, réglez les gains de rétroaction relativement élevés. Après vous être assuré qu'aucune instabilité ni oscillation ne se produit, réglez la vitesse de balayage initiale à environ un hertz et la taille de balayage à 10 nanomètres.Commencez l'approche de la pointe vers la surface à l'aide du logiciel de commande du microscope à force atomique (AFM). Évaluez si la pointe a atteint la surface sans commencer à imager en modifiant légèrement la valeur du point de consigne. Si la pointe est en contact avec la surface, l'effet sur l'extension de la zone ZPA devrait être négligeable.Une fois que la pointe a atteint la surface, rétractez la zone ZPA et réajustez le levier. La fréquence de résonance aura probablement diminué en raison des interactions entre la pointe et l'échantillon. Réglez maintenant le point de consigne à environ 80 % de l'amplitude libre nouvellement ajustée, puis engagez le levier afin d'effectuer un balayage de 10 par 10 nanomètres carrés de la surface en mode de modulation d'amplitude pour vérifier que les paramètres d'imagerie sont adaptés.Vérifiez que les profils de trace et de retracé se superposent. Sinon, réduisez davantage le point de consigne et essayez d'augmenter les gains. Si l'image devient bruitée, diminuez les gains.Répétez l'opération sur une région plus grande de l'échantillon, comprise entre un et cinq micromètres carrés, si cela est possible. Sur des échantillons mous ou biologiques, cela pourrait entraîner une contamination de la pointe. Réduisez la taille de balayage à une valeur adaptée à la visualisation des caractéristiques d'intérêt.Cela peut être aussi faible que 20 par 20 nanomètres. Ensuite, réduisez suffisamment l'amplitude d'excitation du levier pour que la boucle de rétroaction rétracte automatiquement la zone ZPA, éloignant ainsi la pointe de la surface. Lorsque le levier est éloigné de la surface, ajustez l'amplitude d'excitation de sorte que l'amplitude du levier soit de un à deux nanomètres crête à crête.Réduisez progressivement la consigne par petites étapes, jusqu'à ce que la zone ZPA s'étende de nouveau vers la surface et que l'image d'origine soit récupérée. Maintenez l'amplitude de consigne entre 75 % et 95 % de la nouvelle amplitude libre. Réajustez ensuite les gains, car des gains plus élevés peuvent être utilisés à des amplitudes plus faibles sans introduire de bruit significatif.Optimisez le système afin de trouver la meilleure combinaison d'amplitude libre, de point de consigne et de gain pour une résolution élevée. Les conditions optimales du système dépendent de l'échantillon, des propriétés d'humidité du liquide, ainsi que du levier utilisé. Pour les interfaces solvophiles, utilisez des leviers ayant une constante de raideur comprise entre 0,5 et 2 newtons par mètre.Grâce à cette technique, des images avec une résolution subnanométrique ont été obtenues sur une large gamme d'échantillons. Les échantillons mous présentés ici incluent un doublet lipidique, des membranes pourpres de Halobacterium salinarum, une monocouche auto-assemblée de dimolécules amphiphiles et des cristaux d'aquaporine provenant d'une membrane de cristallin de bovin. Dans chaque cas, les caractéristiques d'intérêt sont mises en évidence.Les faibles amplitudes d'oscillation et les points de consigne élevés minimisent la force exercée par la pointe sur l'échantillon, permettant ainsi d'observer en solution, sans dommage, les assemblages spontanés fragiles des lipides dans le bicouche, des protéines dans les biomembranes natives et des molécules amphiphiles. Des matériaux cristallins plus durs, tels que la calcite, le titanate de strontium, le carbure de silicium et les ions métalliques uniques adsorbés sur une surface de mica, peuvent être imagés à l’aide de cette approche, car dans tous les cas, c’est effectivement le liquide interfacial qui est imagé, et non le cristal lui-même. Une fois maîtrisée, cette technique offre presque systématiquement une résolution au niveau moléculaire ou atomique en milieu liquide lorsque celle-ci est correctement appliquée.Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de garder à l'esprit que c'est le liquide interfacial qui est imagé. Cela implique d'utiliser des conditions d'imagerie douces. La contamination de la pointe, de l'échantillon ou du liquide est généralement la principale cause d'échec à obtenir une résolution élevée.En cas de doute, il est souvent conseillé de nettoyer toutes les surfaces en contact avec le liquide et de réutiliser les solutions d'imagerie. Le bruit externe nuit également à la haute résolution. Un sol peu vibratoire, éloigné d'un conduit de ventilation, est préférable.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d'optimiser vos paramètres d'imagerie pour obtenir une MFA de haute résolution. Bien entendu, comme pour toute technique de pointe, plusieurs essais peuvent être nécessaires pour déterminer la meilleure façon d'imaginer un échantillon, la patience étant donc essentielle.

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Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

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