Imaging Résolution Sous-nanomètre avec modulation d'amplitude en microscopie à force atomique en liquide

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir une imagerie en liquide avec la résolution la plus élevée possible, à l'aide d'un microscope à force atomique (AFM) commercial fonctionnant en modulation d'amplitude, également connu sous le nom de mode tapping. Cette méthode permet de repousser les limites du fonctionnement standard de l'AFM en liquide, en utilisant la meilleure combinaison de paramètres pour une haute résolution. Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut être utilisée avec la plupart des AFM commerciaux, et ne nécessite donc aucun équipement spécialisé.

La méthode présentée ici s'adresse aux scientifiques et techniciens qui possèdent déjà des connaissances de base en microscopie à force atomique (AFM), mais qui souhaitent tirer davantage parti de cette technique. Cette méthode ne cible aucun type d'échantillon particulier et peut être largement appliquée à des échantillons provenant des sciences physiques, biologiques, chimiques, des matériaux et des sciences des surfaces. En général, les personnes novices dans cette technique éprouveront des difficultés, car il faut une certaine patience pour trouver les meilleurs paramètres pour un échantillon donné.

Placer les instruments et le disque supportant le substrat dans un bain de sonication contenant de l'eau ultra-pure, suivre par de l'isopropanol, puis de nouveau de l'eau ultra-pure, chacun pendant 10 minutes. Lorsqu'on vise une haute résolution, toute contamination peut avoir des conséquences néfastes.

Portez des gants en tout temps et assurez-vous que toutes les surfaces ou instruments entrant en contact avec l'échantillon, le levier ou la cellule de MFA sont soigneusement nettoyés. Après la sonication, séchez chaque instrument et le disque d'échantillon sous un flux d'azote. Utilisez un disque en acier comme support pour la mica afin d'imaginer des ions métalliques simples absorbés.

Nettoyez physiquement les surfaces qui ne peuvent pas être nettoyées par ultrasons en les essuyant avec des feuilles de tissu peu pelucheux trempées dans de l'eau ultra-pure, de l'isopropanol, puis de l'eau ultra-pure, successivement. Laissez la surface sécher à l'air pendant jusqu'à 30 minutes. Ensuite, préparez une petite quantité de colle époxy en mélangeant soigneusement les réactifs, puis déposez environ 10 microlitres d'époxy sur le disque-échantillon en acier propre.

Placez le substrat de mica sur l'époxy et fixez-le au disque d'acier en exerçant une pression sur le substrat. Laissez durcir l'époxy pendant plusieurs heures à une température élevée, conformément aux spécifications du fabricant. Ensuite, appuyez fermement une bande de ruban adhésif de 2,5 centimètres de large sur le substrat, de sorte que toute la surface soit recouverte, puis décollez doucement la couche supérieure.

Répétez ce processus deux à trois fois jusqu'à ce que le mica soit parfaitement lisse à l'œil. Plongez la puce de levier dans un bain d'isopropanol, puis dans de l'eau ultra-pure, chacun pendant 60 minutes. Ensuite, exposez la pointe à la lumière UV pendant cinq minutes au maximum afin de favoriser la formation de sites d'hydratation stables.

Des durées d'exposition trop longues peuvent endommager la pointe ou augmenter son rayon de courbure. Insérez le levier dans le porte-levier du microscope à force atomique (AFM) et pipetez 25 microlitres du liquide d'imagerie sur le levier et la pointe afin de pré-mouiller la surface. Cela réduira l'apparition de bulles d'air lors de l'approche de l'échantillon.

Faites fondre le disque d'échantillon et le substrat sur la platine d'échantillon et ajoutez une goutte de liquide d'imagerie sur l'échantillon. Ensuite, reliez le porte-cantilever au microscope à force atomique (AFM). Rapprochez le cantilever et l'échantillon suffisamment pour former un pont capillaire entre les fluides présents à l'extrémité du cantilever et ceux situés sur l'échantillon.

Utilisez le logiciel de microscopie à force atomique (AFM) pour aligner le laser de mesure près de l'extrémité de la pointe du levier. Ensuite, déterminez la fréquence de résonance du levier à partir du pic principal de son spectre thermique. Si la déflexion du levier est calibrée, l'ajustement du pic de résonance à l'aide d'un modèle d'oscillateur harmonique simple permet d'obtenir la constante de raideur du levier.

Ensuite, régler le levier en déterminant sa réponse en amplitude lorsqu'il est excité de manière externe sur une gamme de fréquences proche de la fréquence de résonance identifiée dans le spectre thermique. Ajuster l'amplitude d'excitation de sorte que l'amplitude d'oscillation libre soit d'environ cinq nanomètres. Cela correspond généralement à 0,2-0,8 volt sur la plupart des MFA.

Ensuite, réglez le point de consigne d'amplitude à environ 80 % de l'amplitude libre. Puis, réglez les gains de rétroaction relativement élevés. Après vous être assuré qu'aucune instabilité ni oscillation ne se produit, réglez la vitesse de balayage initiale à environ un hertz et la taille de balayage à 10 nanomètres.

Commencez l'approche de la pointe vers la surface à l'aide du logiciel de commande du microscope à force atomique (AFM). Évaluez si la pointe a atteint la surface sans commencer à imager en modifiant légèrement la valeur du point de consigne. Si la pointe est en contact avec la surface, l'effet sur l'extension de la zone ZPA devrait être négligeable.

Une fois que la pointe a atteint la surface, rétractez la zone ZPA et réajustez le levier. La fréquence de résonance aura probablement diminué en raison des interactions entre la pointe et l'échantillon. Réglez maintenant le point de consigne à environ 80 % de l'amplitude libre nouvellement ajustée, puis engagez le levier afin d'effectuer un balayage de 10 par 10 nanomètres carrés de la surface en mode de modulation d'amplitude pour vérifier que les paramètres d'imagerie sont adaptés.

Vérifiez que les profils de trace et de retracé se superposent. Sinon, réduisez davantage le point de consigne et essayez d'augmenter les gains. Si l'image devient bruitée, diminuez les gains.

Répétez l'opération sur une région plus grande de l'échantillon, comprise entre un et cinq micromètres carrés, si cela est possible. Sur des échantillons mous ou biologiques, cela pourrait entraîner une contamination de la pointe. Réduisez la taille de balayage à une valeur adaptée à la visualisation des caractéristiques d'intérêt.

Cela peut être aussi faible que 20 par 20 nanomètres. Ensuite, réduisez suffisamment l'amplitude d'excitation du levier pour que la boucle de rétroaction rétracte automatiquement la zone ZPA, éloignant ainsi la pointe de la surface. Lorsque le levier est éloigné de la surface, ajustez l'amplitude d'excitation de sorte que l'amplitude du levier soit de un à deux nanomètres crête à crête.

Réduisez progressivement la consigne par petites étapes, jusqu'à ce que la zone ZPA s'étende de nouveau vers la surface et que l'image d'origine soit récupérée. Maintenez l'amplitude de consigne entre 75 % et 95 % de la nouvelle amplitude libre. Réajustez ensuite les gains, car des gains plus élevés peuvent être utilisés à des amplitudes plus faibles sans introduire de bruit significatif.

Optimisez le système afin de trouver la meilleure combinaison d'amplitude libre, de point de consigne et de gain pour une résolution élevée. Les conditions optimales du système dépendent de l'échantillon, des propriétés d'humidité du liquide, ainsi que du levier utilisé. Pour les interfaces solvophiles, utilisez des leviers ayant une constante de raideur comprise entre 0,5 et 2 newtons par mètre.

Grâce à cette technique, des images avec une résolution subnanométrique ont été obtenues sur une large gamme d'échantillons. Les échantillons mous présentés ici incluent un doublet lipidique, des membranes pourpres de Halobacterium salinarum, une monocouche auto-assemblée de dimolécules amphiphiles et des cristaux d'aquaporine provenant d'une membrane de cristallin de bovin. Dans chaque cas, les caractéristiques d'intérêt sont mises en évidence.

Les faibles amplitudes d'oscillation et les points de consigne élevés minimisent la force exercée par la pointe sur l'échantillon, permettant ainsi d'observer en solution, sans dommage, les assemblages spontanés fragiles des lipides dans le bicouche, des protéines dans les biomembranes natives et des molécules amphiphiles. Des matériaux cristallins plus durs, tels que la calcite, le titanate de strontium, le carbure de silicium et les ions métalliques uniques adsorbés sur une surface de mica, peuvent être imagés à l’aide de cette approche, car dans tous les cas, c’est effectivement le liquide interfacial qui est imagé, et non le cristal lui-même. Une fois maîtrisée, cette technique offre presque systématiquement une résolution au niveau moléculaire ou atomique en milieu liquide lorsque celle-ci est correctement appliquée.

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de garder à l'esprit que c'est le liquide interfacial qui est imagé. Cela implique d'utiliser des conditions d'imagerie douces. La contamination de la pointe, de l'échantillon ou du liquide est généralement la principale cause d'échec à obtenir une résolution élevée.

En cas de doute, il est souvent conseillé de nettoyer toutes les surfaces en contact avec le liquide et de réutiliser les solutions d'imagerie. Le bruit externe nuit également à la haute résolution. Un sol peu vibratoire, éloigné d'un conduit de ventilation, est préférable.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d'optimiser vos paramètres d'imagerie pour obtenir une MFA de haute résolution. Bien entendu, comme pour toute technique de pointe, plusieurs essais peuvent être nécessaires pour déterminer la meilleure façon d'imaginer un échantillon, la patience étant donc essentielle.