Pathologie d’expansion : une méthode d’imagerie optique à haute résolution d’échantillons de tissus cliniques

La pathologie d’expansion, ou ExPath, est une technique de préparation d’échantillons pour des échantillons biologiques, qui permet à la microscopie optique conventionnelle d’imager des structures à l’échelle nanométrique en les dilatant à l’aide d’un système polymère.

Tout d’abord, prenez une lame d’échantillon de tissu immunocoloré traitée et recouvrez-la d’une solution d’ancrage contenant à la fois des groupes réactifs aux protéines et aux polymères. Le groupe protéique réactif du réactif d’ancrage se lie aux amines des biomolécules dans les cellules.

Ensuite, ajoutez une solution gélifiante appropriée sur l’échantillon et incubez pour permettre sa diffusion à l’intérieur du tissu. Le groupe polymère-réactif du réactif d’ancrage se lie aux monomères libres dans la solution gélifiante, permettant aux biomolécules de s’ancrer au polymère au fur et à mesure de sa polymérisation.

Une fois la polymérisation de l’échantillon terminée, recouvrez la lame d’une solution de protéinase. Les protéinases digèrent les protéines du cytosquelette pour éliminer toute résistance structurelle, permettant aux cellules de se développer sans se rompre. Lors de la digestion enzymatique, l’échantillon gélifié se détache de la lame et se met en suspension.

Maintenant, transférez l’échantillon dans un tampon de lavage approprié dans un récipient compatible avec le microscope. Ensuite, remplacez le tampon par de l’eau et incubez. Le polymère absorbe une énorme quantité d’eau par rapport à sa masse et gonfle.

Au fur et à mesure que le polymère se dilate, les biomolécules ancrées au réseau de polymères s’éloignent tout en conservant leur orientation spatiale. Cela permet de les visualiser facilement sous un microscope optique conventionnel.

Préparez la solution d’ancrage selon les instructions du manuscrit. Placez les lames dans une boîte de Pétri de 100 millimètres. Pipetez la solution d’ancrage sur le tissu et incubez-les pendant au moins 3 heures à température ambiante. Ensuite, préparez la solution gélifiante selon les instructions du manuscrit.

Retirez l’excès de solution d’ancrage de la section du tissu et remettez la glissière dans la boîte de Pétri. Ajoutez une solution de gélification fraîche et froide à l’échantillon et incubez le mélange pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius. Pour construire une chambre sur la lame autour de l’échantillon, créez des espaceurs en coupant finement des morceaux de verre de couverture avec un couteau diamanté. Fixez les entretoises de chaque côté du tissu avec de l’eau et placez soigneusement un couvercle en verre de protection sur la lame, en veillant à éviter de piéger des bulles d’air sur le tissu.

Ensuite, incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius dans un environnement humidifié pendant 2 heures. Retirez le couvercle de la chambre de gélification en glissant doucement une lame de rasoir sous la lamelle et en la soulevant lentement de la surface du gel. Coupez le gel vierge autour du tissu pour minimiser le volume, en vous assurant de couper le gel de manière asymétrique pour suivre l’orientation.

Diluez la protéinase K 1:200 dans le tampon de digestion, en vous assurant de préparer suffisamment de solution pour immerger complètement le gel. Ensuite, incubez l’échantillon avec la solution dans un récipient fermé pendant 3 heures à 60 degrés Celsius. Si l’échantillon ne se détache pas pendant la digestion, utilisez une lame de rasoir pour le retirer délicatement.

À l’aide d’un pinceau doux, transférez l’échantillon dans un PBS 1X dans un récipient compatible avec le système d’imagerie souhaité et suffisamment grand pour accueillir le gel entièrement expansé. Lavez l’échantillon dans du PBS pendant 10 minutes et, si vous le souhaitez, recolorez-le avec du DAPI de 300 millimolaires. Élargissez les échantillons en lavant l’échantillon avec un volume excédentaire d’eau double distillée 3 à 5 fois pendant 10 minutes par lavage. Ensuite, effectuez une imagerie de fluorescence.

• Expansion Pathology (ExPath) - A sample preparation technique for biological specimens.
• Acryloyl-X SE - A protein-reactive group used in the anchoring solution during ExPath.
• BP160/100 - Another term for the anchoring solution used in ExPath.
• P06-1.5H-N - A specific type of gelling solution used in ExPath.
• Gelling Solution - The solution that allows biomolecules to anchor to the polymer in ExPath.

• Introduce Expansion Pathology (ExPath) – A sample preparation technique that enables conventional light microscopy to better visualize nano-scale structures (e.g., ExPath).
• Key Concepts – This includes the use of an anchoring solution and a gelling solution which helps in better visualization (e.g., Acryloyl-X SE, P06-1.5H-N).
• Underlying Mechanisms – These involve the biomolecules anchoring to the polymer as it gets polymerized, followed by the expansion of this polymer (e.g., BP160/100).
• Connect to Experiment – This technique eventually allows biomolecules to retain their spatial orientation while being easily visualized under a microscope.

• What is Expansion Pathology (ExPath) and how does it help in sample preparation for biological specimens?
• What are the steps and key elements used in the Expansion Pathology process?
• How does the use of specific solutions like Acryloyl-X SE and P06-1.5H-N impact the procedure?

• Practical Applications – Expansion Pathology (ExPath) enhances the visualization process in microscopy (e.g., medical research).
• Industry Impact – Sectors like biomedical research and healthcare benefit from this procedure (e.g., diagnostics).
• Societal Importance – Enhancing our ability to study and understand biological specimens at a nano-scale (e.g., medical advancements).
• Link to Scientific Advancements – Improvements in visual imaging can lead to scientific breakthroughs (e.g., disease treatment).