Name: Préparation de la qualité de pyrophosphates inositol (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Découvrez une méthode enzymatique pour produire et isoler les pyrophosphates d'inositol IP7, des molécules signalétiques impliquées dans le cancer et le diabète. Ce protocole utilise l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour purifier ces composés.

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Nous remercions A. Riccio pour leurs commentaires et de lire le manuscrit. Ce travail a été soutenu par le Medical Research Council (MRC) de financement à l&#39;Unité de Biologie cellulaire et par un homme Frontier Science Program Grant (RGP0048/2009-C).

1. Réaction enzymatique - jour 1 (1 heure dans l'après-midi) <ol><li> La première étape est de préparer les 10-20 indépendante réactions enzymatiques dans lesquels IP 6 K1 ou VIP1 conversion IP de 6 à isoformes pyrophosphorylated. </li><li> Nous utilisons Sa-IP 6 K1 et TPS-VIP1 enzymes purifiées à partir de E. coli selon le protocole décrit précédemment 17,18. </li><li> Préparer 50 réactions ul contenant 1X tampon de réaction (30 mM Hepes pH 6,8, NaCl 50 mM, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 Phosphocréatine mM (PCR), 25 U / ml CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 mM d'ATP (Mg sel), 0,3 mM IP6, 0,05 à 0,1 mg Sa-IP 6 K1 ou GST-VIP1. Régler le volume avec MiliQ ddH 2 O. </li><li> Centrifuger brièvement la réaction et incuber à 37 ° C pendant la nuit avec la rotation. </li></ol> 2. Coulée de gel de polyacrylamide et chargement - jour 2 (4 heures dans l'après-midi) <ol><li> Le gel de polyacrylamide est préparé à partir de 24 cm de long, 18 cm de plaques de verre de large et 1,5 mm entretoises large. Habituellement une ruelle ou d'un peigne 16 préparative seule voie est utilisée. </li><li> Préparer un mélange (50 ml / gel) contenant les éléments suivants: 35,5% (p / v) d'acrylamide: bis-acrylamide 19h01, le persulfate d'ammonium 1X Tris / borate / EDTA (TBE), 0,05% (p / v) (APS ), 0,05% (p / v) Temed. Verser le mélange entre les plaques pré-moulé en verre, insérez le peigne et laisser polymériser pendant 30-60 minutes à température ambiante. </li><li> Une fois le gel polymérisé, le transfert à l'appareil de la chambre froide et pré-run en TBE 1X pendant environ 30-60 minutes à 200-300 volts. </li><li> Ajouter 1X de OrangeG colorant (10 mM Tris-HCl pH 7,0, EDTA 1 mM, glycérol 30%, 0,1% OrangeG) pour chaque réaction. Préparer un échantillon contenant 2 nmol d'IP 6 à charger comme un contrôle standard. </li><li> Laver chaque puits abondamment avec de tampon en utilisant une seringue et une aiguille 21G de supprimer tout précipité, puis de charger le gel. Évitez de charger sur le puits côté. </li><li> Exécutez le gel de nuit à 450-550 volts (7 mAmp / gel), jusqu'à ce que la bande de teinture OrangeG est dans les 10 derniers cm du bas du gel. </li></ol> 3. Isolement de la PI 7 - 3 jours (4 heures) et 4 jours (6-7 heures de séchage processus SpeedVac) <ol><li> Démonter l'appareil de gel et soigneusement enlever une plaque de verre laissant le gel sur l'autre. Couper une petite portion du gel de la bande juste au-dessus de teinture OrangeG au fond contenant l'adresse IP standard de 6 et une voie de l'échantillon, comme le montre la figure 1. </li><li> Tache la partie découpée du gel au bleu de toluidine (0,1% (p / v) bleu de toluidine, 20% (p / v) méthanol, 2% (p / v) glycérol) pendant quelques minutes (1-3 min) ou jusqu'à ce que la bande de pyrophosphate inositol apparaît. Mettez la plaque de verre préalablement retiré de retour au sommet du gel pour éviter le gel sans tache de sécher. </li></ol> L'IP 7 bandes devraient être visibles, car il tourne légèrement plus lent que l'adresse IP standard de 6. ATP, qui court plus vite que 6 IP, doit également être visible (figure 1). Transférer la partie colorée du gel dans une solution de-coloration (20% (p / v) méthanol) pendant quelques minutes, laver tout excès de bleu de toluidine et de repositionner le gel avec le gel non colorées. Si la visualisation de la hausse des isoformes pyrophosphorylated inositol (IP 8 et 9 IP) est nécessaire, aux taches le gel avec une solution de toluidine coloration bleue pendant 20 minutes à température ambiante. Par la suite, laver les bleu de toluidine avec la solution de-coloration pour environ 15 minutes. <ol start="3"><li> Avec une lame de rasoir couper la propriété intellectuelle 7 bandes sur la partie non colorée du gel en utilisant comme référence la position de la migration IP 7 déterminée avec le gel coloré (figure 1). </li><li> Mettez l'adresse IP 7 bandes qui a été coupé à partir du gel sur un tube de 15 ml et ajouter 10 ml de MilliQ ddH 2 O. Mettez les tubes en rotation pendant 10 minutes à température ambiante. Jeter le liquide pour enlever l'excès de particules d'acrylamide TBE et microscopiques. </li><li> Par la suite, effectuer deux cycles de déshydratation-hydratation. Ajouter 5 ml de 50% (p / v) méthanol pour le tube avec le gel contenant 7 IP et tournent à température ambiante pendant 2 heures. Transférer la tranche de gel d'un nouveau tube de 15 ml contenant 5 ml de MilliQ ddH O 2 et tournent à température ambiante pendant 2 heures. Ne jetez pas le méthanol et l'H 2 O MilliQ des tubes. Répétez le cycle de déshydratation-hydratation fois de plus en re-transférer le gel de polyacrylamide en tubes de 15 ml préalablement utilisés. Un des lavages peuvent être effectués pendant la nuit. </li><li> Pour concentrer la propriété intellectuelle élué 7, sec les 10 mL ensemble (5 ml MilliQddH 2 O et 5 ml à 50% (p / v) méthanol) en utilisant un SpeedVac chauffé à 60 ° C. </li><li> Une fois les échantillons sont presque à sec, le transfert du liquide restant (300-600 ul) à A1.5 tube à centrifuger mL et de spin 2 minutes à 5000 rpm. </li><li> Recueillir le surnageant et transférer dans un nouveau tube de 1,5 ml centrifugeuse, laisserle bas de 20 à 30 uL car il peut contenir des particules d'acrylamide. </li><li> Si nécessaire de poursuivre le processus de séchage en utilisant un SpeedVac non chauffés. La reprise de la PI 7 est considérablement réduit si les échantillons sécher complètement, donc fin du processus de séchage, lorsque les échantillons atteindre le volume de 100-300 mL. </li></ol> 4. Détermination de la PI 7 concentration et la pureté. <ol><li> Utilisez 2-5 uL de la propriété intellectuelle 7 échantillon récupéré à courir sur un gel PAGE, similaire aux sections 2.2 à 2.5. Chargez plusieurs dilutions de IP 6 (soit 0,5, 1, 2, 4 nmol) comme standard de concentration et de 4 nmol de poly-P marqueur. Après l'exécution du gel, de visualiser les isoformes pyrophosphate inositol par coloration et de-coloration du gel complet avec Toluidine solution bleue, suivant la procédure décrite à la section 3.2 (figure 2A). </li><li> Après coloration de toluidine, les concentrations peuvent être déterminées en analysant le gel et la comparaison des différences d'intensité entre 6 IP et IP 7, en utilisant un logiciel d'imagerie telles que Image-J, comme le montre la figure 2B. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: La conversion enzymatique préparative de la PI de 6 à 7 IP utilisant le protocole IP enzymes 6 K1 et VIP1 peut être facilement résolu en utilisant l'analyse PAGE (figure 1). Le chargement de 6 IP comme un contrôle de taille avec coloration gel bleu de toluidine permet l'identification des dérivés pyrophosphorylated, car ils courent plus lentement en fonction du nombre de groupes phosphates présents sur le cycle inositol. La procédure décrite ci-dessus permet la purification facile de 7 IP. L'analyse de la pyrophosphate purifiée inositol par PAGE a révélé la pureté de notre IP 7 (figure 2A). Fait intéressant, le 1/3PP-IP 5 isomère de l'IP 7 produit des VIP1 migre légèrement plus lent que l'5PP-IP 5 isomère de 7 IP qui est généré par la propriété intellectuelle 6 K1. L'utilisation de IP 6 normes permettent une quantification facile de la concentration de l'IP purifiée 7 (figure 2B). Avant d'utiliser 7 IP pour d'autres expériences, son activité biologique peut être évaluée (Figure 3). 5PP-IP 5 est incubée avec VIP1 et avec l'IP 7 phosphatase DDP1 (phosphohydrolase polyphosphate diphosphoinositol). Régulièrement, l'IP purifiée 7 est converti en IP 8 par VIP1 et à IP 6 par DDP1 (figure 3). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1:. Coloration Toluidine du PAGE et l'isolement de l'IP 7 bandes La portion du gel contenant le standard IP (6) a été coupées et colorées avec une solution de bleu de toluidine. Les trois bandes représentent (de haut en bas) IP 7, IP 6 et ATP. La partie colorée du gel a été ensuite aligné avec le reste du gel. Cela permet la localisation de la portion du gel contenant 7 IP, qui peut ensuite être coupé et purifié (zone en pointillés). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: Analyse de la PI PAGE produits de réaction 6 K1 et VIP1. A) Analyse de la propriété intellectuelle 6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) par coloration au bleu de toluidine a été utilisée afin de déterminer la concentration de propriété intellectuelle 7 purifiés à partir de deux 6 IP K1 (5PP-IP 5) et VIP1 (1/3PP-IP 5) les réactions. B) Analyse Nuage de points pour déterminer la concentration de l'IP purifiée 7. Les concentrations ont été déterminées en fonction de l'intensité des bandes, calculé en utilisant le logiciel ImageJ, par rapport à des quantités prédéterminées de 6 IP. L'axe X représente les intensités; l'axe Y représente la concentration exprimée en nmoles. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3:. Analyse de l'activité biologique IP 7 Pour déterminer la qualité de l'IP purifiée 7 nous avons incubé 5PP-IP 5 (6 K1 IP IP généré 7) avec VIP1 ou avec l'IP 7 phosphatase DDP1 puis la réaction résolue sur la page. La coloration DAPI et Toluidine révélé la production attendue de 8 IP par VIP1 et la conversion de IP à IP 7 6 par DDP1.

<ol><li>Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates%3A+metabolism+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).</li>
<li>Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+inositol+pyrophosphates+signalling+molecules%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Are inositol pyrophosphates signalling molecules?</a> J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).</li>
<li>Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates%3A+structure%2C+enzymology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).</li>
<li>Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphosphoinositol+polyphosphates%3A+metabolic+messengers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Diphosphoinositol polyphosphates: metabolic messengers.</a> Mol Pharmacol. 76, 236-252 (2009).</li>
<li>Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+diphosphoinositol+pentakisphosphate+by+a+newly+identified+family+of+higher+inositol+polyphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases.</a> Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).</li>
<li>Draskovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+hexakisphosphate+kinase+products+contain+diphosphate+and+triphosphate+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups.</a> Chem Biol. 15, 274-286 (2008).</li>
<li>Mulugu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+family+of+enzymes+that+phosphorylate+inositol+hexakisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate.</a> Science. 316, 106-109 (2007).</li>
<li>Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+two+human+VIP1-like+inositol+hexakisphosphate+and+diphosphoinositol+pentakisphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases.</a> J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).</li>
<li>Illies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+inositol+pyrophosphates+for+full+exocytotic+capacity+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells.</a> Science. 318, 1299-1302 (2007).</li>
<li>Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+regulate+cell+death+and+telomere+length+through+phosphoinositide+3-kinase-related+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).</li>
<li>York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+diphosphate+signaling+regulates+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inositol diphosphate signaling regulates telomere length.</a> J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).</li>
<li>Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+mediate+chemotaxis+in+Dictyostelium+via+pleckstrin+homology+domain-PtdIns%283%2C4%2C5%29P3+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions.</a> Cell. 114, 559-572 (2003).</li>
<li>Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+regulate+endocytic+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).</li>
<li>Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plc1p%2C+Arg82p%2C+and+Kcs1p%2C+enzymes+involved+in+inositol+pyrophosphate+synthesis%2C+are+essential+for+phosphate+regulation+and+polyphosphate+accumulation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).</li>
<li>Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphate+mediated+pyrophosphorylation+of+AP3B1+regulates+HIV-1+Gag+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).</li>
<li>Bhandari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+pyrophosphorylation+by+inositol+pyrophosphates+is+a+posttranslational+event%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).</li>
<li>Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+InsP7+by+the+Inositol+Hexakisphosphate+Kinase+1+%28IP6K1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1).</a> Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).</li>
<li>Otto, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+inositol+phosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of inositol phosphate kinases.</a> Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).</li>
<li>Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+and+their+unique+metabolic+complexity%3A+analysis+by+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis.</a> PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

L&#39;utilisation de pyrophosphate inositol en biochimie est sévèrement limitée par l&#39;indisponibilité commerciale de ces composés et la faible sensibilité des méthodes de détection existantes. La combinaison de la page, qui permet la séparation de molécules possédant un nombre différent de groupes phosphate, et bleu de toluidine (figure 1), un colorant métachromatique qui se lie à des groupes phosphate, permet la détection facile des isoformes pyrophoshate inositol ouvrir de nouvelles avenues de recherche 20. L&#39;utilisation de la technologie décrite PAGE pour purifier les produits pyrophosphate inositol de la réaction enzymatique réalisée outby soit 6 IP K1 ou VIP1 est une méthode simple, économique et fiable qui permet la production de grandes quantités d&#39;IP de haute qualité 7. La méthode décrite ci-dessus n&#39;est pas limitée à la simple purification de la PI 7, mais de légères modifications du protocole décrit peut permettre la purification d&#39;une gamme différente de pyrophosphates inositol. Supérieur phosphorylée isoformes pyrophosphate inositol, contenant plus de huit groupes de phosphate peuvent être détectées en utilisant l&#39;IP 7 ou différents montants de 6 IP comme substrat 20,6. Ces pyrophosphates inositol peut être détecté en augmentant la longueur de la procédure de coloration et ensuite purifié (section 3.2). Par ailleurs, l&#39;utilisation de 5 IP comme substrat pour la réaction enzymatique permettant la purification de la PP-PI 5 et d&#39;autres pyrophosphates inositol contenant un groupe hydroxyle sur le cycle inositol. En conclusion, cette méthode permet peu exigeante pour la purification de quantités fiables milligramme de pyrophosphates inositol avec des instruments largement disponibles, ouvrant ainsi de nouvelles avenues pour ce domaine de recherche passionnant.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> L&#39;acide phytique (IP 6) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8810 </td></tr><tr><td> Poly-P (hexamétaphosphate de sodium) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8510 </td></tr><tr><td> ATP-Mg 2 + sel </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9187 </td></tr><tr><td> OrangeG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3756 </td></tr><tr><td> Phosphocréatine (PCr) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7936 </td></tr><tr><td> Kinase CreatinePhospho (CPK) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3755 </td></tr><tr><td> TPS-VIP1 </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Son-IP6K1 </td><td> 18 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> Son-Ddp1 </td><td> Disponible dans le laboratoire </td><td> Disponible dans le laboratoire </td></tr><tr><td> L&#39;acrylamide: bis-acrylamide 19h01 (40%) </td><td> Flowgen </td><td> H16972 </td></tr><tr><td> Persulfate d&#39;ammonium (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9164 </td></tr><tr><td> Tris / borate / EDTA (TBE) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T 9060 </td></tr><tr><td> Temed </td><td> BDH </td><td> 43083G </td></tr><tr><td> Bleu de toluidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 198161 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Le Christ </td><td> 100218 </td></tr><tr><td> Appareil de gel </td><td> Hoefer </td><td> SE600 </td></tr><tr><td> Collecteur à vide </td><td> Le Christ </td><td> Alpha 2-4 </td></tr><tr><td> Pompe à vide </td><td> ABM Greiffenberger </td><td> 4EKF63CX </td></tr></tbody></table>

préparation de la qualité de pyrophosphates inositol

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol est présent dans la nature soit intact ou en plus complexes dérivés phosphorylés. De la dernière, les deux plus abondants dans les cellules eucaryotes sont pentakisphosphate inositol (IP 5) et hexakisphosphate inositol (acide phytique ou IP 6). IP 5 et 6 du protocole IP sont les précurseurs des molécules qui contiennent pyrophosphate inositol une ou plusieurs liaisons pyrophosphates 1. La phosphorylation de propriété intellectuelle génère six diphoshoinositolpentakisphosphate IP (7 ou PP-PI 5) et bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate IP (8 ou (PP) 2-IP 4). Pyrophosphates inositol ont été isolées de tous les organismes eucaryotes étudiées jusqu&#39;ici. En outre, les deux classes distinctes d&#39;enzymes responsables de la synthèse du pyrophosphate inositol sont très conservés au cours de l&#39;évolution 2-4. Le 6 IP kinases (IP 6 Ks) possèdent une énorme flexibilité catalytique, la conversion IP et IP 5 6 PP-PI 4 et 7, respectivement IP et ensuite, en utilisant ces produits comme substrats, promouvoir la production de molécules plus complexes 5,6 . Récemment, une deuxième classe d&#39;enzymes générant pyrophosphate a été identifié dans la forme de la protéine de levure VIP 1 (aussi appelé le PP-PI 5 K), qui est capable de convertir IP à IP 6 7 8 7,8 et IP. Pyrophosphates Inositol réguler de nombreux processus cellulaires disparates tels que 9 sécrétion d&#39;insuline, la longueur des télomères 10,11, 12 chimiotactisme, le trafic vésiculaire 13, 14 homéostasie du phosphate et du VIH-1 gag communiqué 15. Deux mécanismes d&#39;actions ont été proposées pour cette classe de molécules. Ils peuvent affecter la fonction cellulaire par allostériquement interagissant avec des protéines spécifiques comme AKT 16. Alternativement, le groupe pyrophosphate pouvez faire un don d&#39;un phosphate de pré-phosphorylée protéines 17. L&#39;énorme potentiel de ce domaine de recherche est entravée par l&#39;absence d&#39;une source commerciale de pyrophosphates inositol, qui empêche de nombreux scientifiques de l&#39;étude de ces molécules et cette nouvelle modification post-traductionnelle. Les méthodes actuellement disponibles pour isoler les pyrophosphates inositol nécessitent sophistiqués appareil chromatographique 18,19. Ces procédures utilisent des conditions acides qui pourraient conduire à la dégradation de l&#39;inositol pyrophosphate 20 et donc à une mauvaise récupération. Par ailleurs, la lourdeur des procédures dessalage post-colonne de restreindre leur utilisation à des laboratoires spécialisés. Dans cette étude, nous décrivons une méthode peu exigeante pour la génération, l&#39;isolement et la purification des produits de l&#39;IP 6-kinase et PP-PI-5 kinases réactions. Cette méthode a été possible par la capacité de l&#39;électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) pour résoudre hautement phosphorylée polyphosphates inositol 20. Suite à IP 6 K1 et PP-PI 5 réactions enzymatiques en utilisant K 6 IP comme substrat, PAGE a été utilisé pour séparer les pyrophosphates généré inositol qui ont été ensuite élue à l&#39;eau.

Pyrophosphates Inositol jouer un rôle important dans les pathologies humaines telles le cancer, le diabète et l&#39;obésité; cependant, le mécanisme d&#39;action exact est un sujet de litige. Le manque de commerce pyrophosphates inositol rend études détaillées problématique. Nous décrivons ici un protocole simple de produire et d&#39;isoler milligrammes de pyrophosphates inositol.

Préparation de la qualité de pyrophosphates inositol

Le myo-inositol est présent dans la nature soit sous forme non modifiée, soit sous forme de dérivés phosphorylés plus complexes. Parmi ces derniers, les deux plus abondants dans les cellules eucaryotes...

L'objectif général de cette procédure est de produire et de purifier du pyrophosphate d'inositol de bonne qualité. Cela est réalisé en utilisant d'abord l'IP6 comme substrat pour la kinase IP6, un enzyme permettant de générer l'IP7. Ensuite, les réactions enzymatiques sont chargées sur un gel de polyamide et la bande correspondant à l'IP7 est excisée.L'IP sept est ensuite isolé par des cycles successifs de déshydratation et d'hydratation. La dernière étape de la procédure consiste à confirmer la pureté du produit et à déterminer sa concentration. Enfin, des résultats peuvent être obtenus qui montrent l'activité biologique de l'IP sept par incubation de l'IP sept.Avec le VIP, une kinase et avec l'IP, sept phosphatases DDP1, ces réactions produisent respectivement l'IP8 et l'IP6. Cette méthodologie peut fournir des informations sur la signalisation par l'IP7. Elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les parties de phosphates comme l'IP8 ou le PPIP4 dérivé de l'IP5.Ce protocole commence par la préparation de réactions enzymatiques dans lesquelles la kinase IP six 1 ou VIP 1 convertissent l'IP six en isoformes apparentés au pyrophosphate. Pour cette démonstration, l'IP six marquée par l'histamine, la kinase IP six 1 marquée par His et les enzymes VIP 1 marquées par GST ont été purifiées à partir d’E. coli selon une procédure décrite précédemment. Pour commencer, préparez de 10 à 20 réactions enzymatiques indépendantes contenant l'IP six et la kinase IP six 1 His ou VIP 1 GST comme décrit dans le protocole écrit.Ramener le volume à 50 microlitres avec de l’eau doublement distillée milli Q. Après une brève centrifugation des tubes, incuber les réactions à 37 degrés Celsius toute la nuit sous agitation. Préparer l’appareil pour gel de polyacrylamide en utilisant des plaques de verre de 24 centimètres de long sur 18 centimètres de large, des entretoises de 1,5 millimètre d’épaisseur et un peigne à 16 puits.Ensuite, versez une solution de gel préparée au préalable entre les plaques de verre préformées, avec un volume de 50 millilitres par gel. Insérez le peigne et laissez le gel polymériser de 30 à 60 minutes à température ambiante. Une fois la polymérisation du gel terminée, transférez l'appareil dans la chambre froide.Faites pré-électrophoréser le gel dans du TBE 1× pendant environ 30 à 60 minutes à 200 à 300 volts, en parallèle avec du colorant orange G 1×. Pour chaque réaction, préparez un échantillon témoin contenant deux mol d'IP six. Après la pré-électrophorèse, rincez soigneusement chaque puits avec le tampon de migration.Utiliser une seringue fixée à une aiguille de calibre 21 pour éliminer tout précipité. Ensuite, charger les échantillons dans le gel, en évitant les deux premières et les deux dernières bandes du gel. Enfin, faire migrer le gel toute la nuit à sept milliampères par gel jusqu'à ce que la bande du colorant orange G se trouve dans les 10 derniers centimètres du bas du gel.Pour commencer l'isolement de l'IP sept, démonter l'appareil de gel et retirer délicatement une plaque de verre en laissant le gel sur l'autre. Découper une petite portion du gel depuis juste au-dessus de la bande orange de GD jusqu'au bas, en incluant l'étalon d'IP six et une voie d'échantillon. Colorer la portion découpée du gel avec du bleu de toluidine pendant quelques minutes jusqu'à l'apparition de la bande d'Anatol Pyrophosphate.Entre-temps, remettez la plaque de verre préalablement retirée par-dessus le gel afin d'empêcher le gel non coloré de sécher. Transférez la partie colorée du gel dans une solution de coloration au DES pendant quelques minutes afin d'éliminer l'excès de bleu de toluidine, puis remettez en place le gel avec la partie non colorée. La bande IP sept doit être visible, car elle migre légèrement plus lentement que l'étalon IP six de l'ATP, tandis que l'IP six, qui migre plus rapidement, doit également être visible.Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour découper la bande IP seven sur la partie non colorée du gel. Utilisez la position de migration de l'IP seven déterminée avec le gel coloré. Pour estimer l'emplacement de la bande IP seven, placez la bande IP seven découpée du gel dans un tube de 15 millilitres et ajoutez 10 millilitres d'eau doublement distillée Milli Q.Faites tourner les tubes pendant 10 minutes à température ambiante après l'incubation, puis jetez le liquide par décantation pour éliminer l'excès de tampon TBE et les particules microscopiques d'acrylamide. Effectuez ensuite deux cycles de déshydratation-rehydratation en ajoutant d'abord cinq millilitres de méthanol à 50 % dans le tube contenant le gel IP sept. Faites tourner l'échantillon à température ambiante pendant deux heures.Transférez ensuite le morceau de gel dans un nouveau tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres d'eau doublement distillée Milli-Q et agitez à température ambiante pendant deux heures. Conservez le tube contenant le méthanol pour une utilisation ultérieure après l'incubation. Répétez une fois de plus le cycle de déshydratation-hydratation afin de concentrer l'IP sept élué.Combiner les cinq millilitres d'eau et les cinq millilitres de méthanol 50 % ajoutés précédemment. Sécher la solution combinée à l'aide d'un évaporateur rotatif chauffé à 60 degrés Celsius. Une fois que les échantillons sont presque secs, transférer le liquide restant dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre.Faire tourner le tube pendant deux minutes à 5 000 tours par minute. Recueillir le surnageant SUP, en laissant les 20 à 30 microlitres du fond, car ils peuvent contenir des particules d'acrylamide. Transférer l'échantillon dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 millilitre.Si nécessaire, poursuivez le processus de séchage à l’aide d’un évaporateur à vide sans chauffage. La récupération de l’IP sept est considérablement réduite si les échantillons sèchent complètement. Il est donc impératif d’interrompre le processus de séchage lorsque les échantillons atteignent un volume de 100 à 300 microlitres.Une fois que l'IP sept isolée a été récupérée, chargez deux à cinq microlitres de l'échantillon sur un gel PAGE afin de déterminer sa concentration et sa pureté. Chargez plusieurs dilutions de l'IP six comme étalons de concentration ainsi que quatre mol de marqueur polyp. Après électrophorèse, visualisez les isoformes initiales de pyrophosphate par coloration et décoloration complète du gel avec une solution de bleu de toluidine.Après avoir suivi la procédure décrite ci-dessus après la coloration au toluidine, les concentrations peuvent être déterminées en analysant le gel et en comparant les différences d'intensité entre l'IP six et l'IP seven. À l'aide d'un logiciel d'analyse d'images tel qu'Image J, la conversion enzymatique préparative de l'IP six en IP seven, réalisée à l'aide des enzymes IP six kinase one et VIP one, peut être facilement résolue par analyse sur gel.Le chargement de l'IP6 comme témoin de taille, associé à la coloration du gel au bleu de toluidine, permet l'identification des dérivés pyrophosphorylés. Étant donné qu'ils migrent plus lentement, en fonction du nombre de groupes phosphate présents sur l'initiale, la procédure décrite ci-dessus a permis la purification aisée de l'IP7. De plus, l'analyse de l'anatol pyrophosphate purifié par électrophorèse sur gel révéla la pureté de l'IP7.Curieusement, l'isomère de l'IP sept produite par VIP un, qui possède un groupe pyrophosphate en position trois sur l'IP cinq, migre légèrement plus lentement que l'isomère de l'IP sept produite par VIP sept, qui possède un groupe pyrophosphate en position cinq sur l'IP cinq et qui est générée par la kinase IP six. L'utilisation d'étalons d'IP six permet une quantification facile de la concentration d'IP sept purifiée avant son utilisation. Pour des expériences supplémentaires, son activité biologique peut être évaluée.Le pyrophosphate IP cinq est incubé avec FIP un et la phosphatase IP sept DDP un de manière routinière. L'IP sept purifié est converti en IP huit par VIP un et en IP six par DDP un. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles qu'une coloration prolongée au toluidine bleue, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'isolement de l'IP huit ou d'autres formes phosphorylées d'isoformes.

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