Microscopie statique à force atomique pour visualiser et caractériser les nucléosomes assemblés

Les nucléosomes, l’unité répétitive de base de la chromatine eucaryote, comprennent des spires d’ADN enroulées autour d’un noyau de protéines histones.

Pour visualiser les nucléosomes assemblés par microscopie statique à force atomique, AFM, commencez par une fine bande de mica, fonctionnalisée pour rendre la surface chargée positivement. Coupez la bande en petits carrés. Pipeter une suspension de nucléosomes assemblée.

L’ADN chargé négativement dans le nucléosome se lie au groupe chargé positivement de la bande de mica fonctionnalisée par des interactions électrostatiques. Laver avec un tampon pour éviter l’encombrement des nucléosomes.

Fixez la bande de mica sur un disque de support d’échantillon. Montez-la sur la platine de l’instrument AFM.

Fixez le support de sonde à la tête optique de l’instrument. Le support contient un cantilever AFM prémonté avec une pointe à son sommet.

Alignez le faisceau laser sur le dos du porte-à-faux pour une mesure précise de la déflexion. Positionnez l’extrémité en contact direct avec la surface contenant le nucléosome.

Lors de l’imagerie en mode contact, lorsque l’extrémité en porte-à-faux balaye la surface du nucléosome, des forces répulsives se produisent à la suite d’interactions entre les atomes de l’extrémité et de l’échantillon. Cela provoque la flexion du porte-à-faux. Le faisceau laser est réfléchi différemment et dirigé vers le photodétecteur sensible à la position.

La boucle de rétroaction maintient une déviation constante en porte-à-faux par le mouvement vertical du scanner pendant le balayage. Ce signal de rétroaction est ensuite utilisé pour générer des images topographiques de nucléosomes. Le noyau du nucléosome apparaît sous forme de taches brillantes, avec de minces bras représentant l’ADN flanquant.

Préparez la surface du mica pour l’imagerie AFM statique. Pour ce faire, préparez d’abord une solution mère APS de 50 millimolaires dans de l’eau désionisée. Conservez 1 millilitre d’aliquotes de la solution à 4 degrés Celsius, jusqu’à ce qu’elle soit nécessaire.

À partir de la solution mère, préparez une solution APS fonctionnelle pour la modification du mica en dissolvant 50 microlitres de la solution APS de 50 millimolaires dans 15 millilitres d’eau distillée désionisée. Mélangez la solution puis remplissez une cuvette avec la solution.

Ensuite, coupez des bandes de mica de 1 x 3 centimètres dans des feuilles de mica de haute qualité. Vérifiez que la pièce s’adapte lorsqu’elle est placée en diagonale dans une cuvette. Ensuite, clivez les couches de mica jusqu’à ce que les deux côtés soient fraîchement clivés et que le morceau soit aussi mince que 0,1 millimètre.

Placez immédiatement le morceau de mica dans la cuvette remplie d’APS et incubez le mica pendant 30 minutes. Transférez le morceau de mica dans une cuvette remplie d’eau distillée déminéralisée et faites-le tremper pendant 30 secondes. Ensuite, utilisez de l’argon pour sécher complètement les deux côtés de la bande de mica APS.

Appliquez du ruban adhésif double face sur plusieurs rondelles magnétiques et placez-les sur le côté. Ensuite, coupez le substrat APS-mica en carrés de 1 centimètre sur 1 centimètre et couvrez-les d’une boîte de Pétri propre. Ensuite, préparez trois dilutions des nucléosomes assemblés à l’aide d’un tampon filtré de 0,22 micron contenant 10 millimolaires de HEPES et 4 millimolaires de chlorure de magnésium à un pH de 7,5.

Pour limiter la perte de nucléosomes à la faible concentration finale, la dilution doit être effectuée un par un, immédiatement avant le dépôt sur l’APS-mica.

Déposez 5 à 10 microlitres de chaque échantillon de nucléosome au centre d’un morceau de mica APS, et laissez-les incuber pendant 2 minutes. Ensuite, rincez doucement l’échantillon avec 2 à 3 millilitres d’eau distillée déminéralisée pour éliminer les composants tampons, et séchez l’échantillon déposé sous un léger jet d’argon.

Pour commencer, montez une pointe sur le support d’embout de la configuration AFM. Ensuite, montez le premier échantillon sur la platine AFM, en faisant attention de ne pas entrer en contact avec la surface de l’échantillon. Positionnez le laser sur le porte-à-faux jusqu’à ce que sa somme soit au maximum et ajustez les valeurs de déviation verticale et latérale à près de 0. Ensuite, réglez la sonde AFM pour trouver sa fréquence de résonance. Ajustez l’amplitude du lecteur et réglez la taille de l’image sur 100 par 100 nanomètres. Une fois configuré, cliquez sur le bouton Engager pour commencer l’approche.

Une fois l’approche terminée, optimisez progressivement le point de consigne d’amplitude jusqu’à ce que la surface de l’échantillon soit clairement visible. Ensuite, augmentez la taille du balayage à 1 micron par 1 micron et la résolution à 512 par 512 pixels. Enfin, cliquez sur le bouton Capturer pour commencer l’acquisition de l’image.