Name: Assemblage de nucléosomes in situ pour la microscopie à force corrélative et à fluorescence d’une molécule unique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Découvrez l'assemblage de nucléosomes in situ pour la microscopie à force et fluorescence corrélative d'une molécule unique. Cette méthode réduit l'utilisation des réactifs et le temps de préparation tout en permettant l'étude des systèmes chromatiniens.

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<meta charset="utf8"></head><body>Reconstitution in situ de nucléosomes pour l’étude d’une molécule unique

<ol><li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure%3A+A+repeating+unit+of+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184, 868-871 (1974).</li>
<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Zhou, K., Gaullier, G., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+structure+and+dynamics+are+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleosome structure and dynamics are coming of age.</a> Nat Struct Mol Biol. 26, 3-13 (2019).</li>
<li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+nucleosome+recognition+by+chromatin+factors+and+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of nucleosome recognition by chromatin factors and enzymes.</a> Curr Opin Struct Biol. 71, 16-26 (2021).</li>
<li>Fierz, B., Poirier, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+of+chromatin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Biophysics of chromatin dynamics.</a> Annu Rev Biophys. 48, 321-345 (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Single-molecule+techniques%3A+A+laboratory+manual%22">Single-molecule techniques: A laboratory manual</a>. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Chua, G. N. L., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+force+met+fluorescence%3A+Single-molecule+manipulation+and+visualization+of+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">When force met fluorescence: Single-molecule manipulation and visualization of protein-DNA interactions.</a> Annu Rev Biophys. , (2024).</li>
<li>Hashemi Shabestari, M., Meijering, A. E. C., Roos, W. H., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+biological+single-molecule+applications+of+optical+tweezers+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in biological single-molecule applications of optical tweezers and fluorescence microscopy.</a> Methods Enzymol. 582, 85-119 (2017).</li>
<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Opt Lett. 11, 288(1986).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Hansen, J. C., van Holde, K. E., Lohr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+nucleosome+assembly+onto+oligomers+of+the+sea+urchin+5+S+DNA+positioning+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism of nucleosome assembly onto oligomers of the sea urchin 5 S DNA positioning sequence.</a> J Biol Chem. 266, 4276-4282 (1991).</li>
<li>Salt Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gradient+dialysis+reconstitution+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">gradient dialysis reconstitution of nucleosomes.</a> CSH Protoc. 2008, 5113(2008).</li>
<li>Leicher, R., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+interaction+between+chromatin+and+chromatin-associated+complexes+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the interaction between chromatin and chromatin-associated complexes with optical tweezers.</a> Methods Mol Biol. 2478, 313-327 (2022).</li>
<li>Segal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+code+for+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genomic code for nucleosome positioning.</a> Nature. 442, 772-778 (2006).</li>
<li>Ioshikhes, I. P., Albert, I., Zanton, S. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+positions+predicted+through+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleosome positions predicted through comparative genomics.</a> Nat Genet. 38, 1210-1215 (2006).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J Mol Biol. 276, 19-42 (1998).</li>
<li>Chipev, C. C., Wolffe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+organization+of+Xenopus+laevis+oocyte+and+somatic+5S+rRNA+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal organization of Xenopus laevis oocyte and somatic 5S rRNA genes in vivo.</a> Mol Cell Biol. 12, 45-55 (1992).</li>
<li>Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+drives+ATP+hydrolysis-dependent+DNA+sequence+alignment+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination.</a> Cell. 181, 1380-1394 (2020).</li>
<li>Vlijm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+assembly+and+handedness+dynamics+of+%28H3.3-H4%292+tetrasomes+to+canonical+tetrasomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparing the assembly and handedness dynamics of (H3.3-H4)2 tetrasomes to canonical tetrasomes.</a> PLoS One. 10, e0141267(2015).</li>
<li>Mazurkiewicz, J., Kepert, J. F., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+nucleosome+assembly+by+histone+chaperone+NAP1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of nucleosome assembly by histone chaperone NAP1.</a> J Biol Chem. 281, 16462-16472 (2006).</li>
<li>Nakagawa, T., Bulger, M., Muramatsu, M., Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+chromatin+assembly+on+supercoiled+plasmid+DNA+by+nucleosome+assembly+protein-1+and+ATP-utilizing+chromatin+assembly+and+remodeling+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multistep chromatin assembly on supercoiled plasmid DNA by nucleosome assembly protein-1 and ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor.</a> J Biol Chem. 276, 27384-27391 (2001).</li>
<li>Andrews, A. J., Chen, X., Zevin, A., Stargell, L. A., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+chaperone+Nap1+promotes+nucleosome+assembly+by+eliminating+nonnucleosomal+histone+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The histone chaperone Nap1 promotes nucleosome assembly by eliminating nonnucleosomal histone DNA interactions.</a> Mol Cell. 37, 834-842 (2010).</li>
<li>Wu, R., Taylor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+analysis+of+DNA.+II.+Complete+nucleotide+sequence+of+the+cohesive+ends+of+bacteriophage+lambda+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence analysis of DNA. II. Complete nucleotide sequence of the cohesive ends of bacteriophage lambda DNA.</a> J Mol Biol. 57, 491-511 (1971).</li>
<li>King, G. A., Peterman, E. J., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+structural+plasticity+of+stretched+DNA+under+torsional+constraint%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Unravelling the structural plasticity of stretched DNA under torsional constraint.</a> Nat Commun. 7, 11810(2016).</li>
<li>Paik, D. H., Roskens, V. A., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsionally+constrained+DNA+for+single-molecule+assays%3A+An+efficient%2C+ligation-free+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Torsionally constrained DNA for single-molecule assays: An efficient, ligation-free method.</a> Nucleic Acids Res. 41, e179(2013).</li>
<li>Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+in+single-molecule+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers in single-molecule biophysics.</a> Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).</li>
<li>Diaz-Celis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+structural+transitions+during+mechanical+unwrapping+of+nucleosomes+and+their+disassembly+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Assignment of structural transitions during mechanical unwrapping of nucleosomes and their disassembly products.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2206513119(2022).</li>
<li>Leicher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+and+in+silico+dissection+of+the+interaction+between+Polycomb+repressive+complex+2+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule and in silico dissection of the interaction between Polycomb repressive complex 2 and chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 117, 30465-30475 (2020).</li>
<li>Chua, G. N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+dynamics+specify+MeCP2+function+at+methylated+DNA+and+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Differential dynamics specify MeCP2 function at methylated DNA and nucleosomes.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Brower-Toland, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+disruption+of+individual+nucleosomes+reveals+a+reversible+multistage+release+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1960-1965 (2002).</li>
<li>McCauley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+FACT+subunits+coordinate+to+catalyze+both+disassembly+and+reassembly+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human FACT subunits coordinate to catalyze both disassembly and reassembly of nucleosomes.</a> Cell Rep. 41, 111858(2022).</li>
<li>Mihardja, S., Spakowitz, A. J., Zhang, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+force+on+mononucleosomal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Effect of force on mononucleosomal dynamics.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15871-15876 (2006).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome-directed+replication+origin+licensing+independent+of+a+consensus+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Nucleosome-directed replication origin licensing independent of a consensus DNA sequence.</a> Nat Commun. 13, 4947(2022).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+recognition+complex+harbors+an+intrinsic+nucleosome+remodeling+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Origin recognition complex harbors an intrinsic nucleosome remodeling activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2211568119(2022).</li>
<li>Harada, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+nucleosome+translocation+by+RSC+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Stepwise nucleosome translocation by RSC remodeling complexes.</a> Elife. 5, e10051(2016).</li>
<li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+histones+and+nucleosome+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution.</a> Methods Mol Biol. 119, 1-16 (1999).</li>
<li>Rogge, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+nucleosomal+arrays+from+recombinant+core+histones+and+nucleosome+positioning+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning DNA.</a> J Vis Exp. (79), e50354(2013).</li>
<li>Leicher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+nucleic+acid+binding+and+coacervation+by+linker+histone+H1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-stranded nucleic acid binding and coacervation by linker histone H1.</a> Nat Struct Mol Biol. 29, 463-471 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1x tampon</td><td>HR N/A</td><td>N/A</td><td>30 mM&nbsp ; tris&nbsp ; acétate pH 7,5, 20 mM d’acétate de magnésium, 50 mM de chlorure de potassium, 0,1 mg/mL de BSA.</td></tr><tr><td>1x PBS (solution saline tamponnée au phosphate)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>137 mM chlorure de sodium, 2,7 mM chlorure de potassium, 10 mM phosphate de sodium dibasique, 1,8 mM phosulfate de potassium monobasique.</td></tr><tr><td>Acide acétique, glacial</td><td>Millipore Sigma</td><td>AX0074-6</td><td>Utiliser pour fabriquer du tris acétate</td></tr><tr><td>Biotine-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-BIOX-S</td><td></td></tr><tr><td>Biotine-14-dATP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-835-BIO14-S</td><td></td></tr><tr><td>Biotine-14-dCTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-956-BIO14-S</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9418-50G</td><td>Dissoudre dans H2O et passage à travers un filtre de 0,22 μm</td></tr><tr><td>Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye</td><td>Cytiva</td><td>PA23031</td><td>Maleimide fonctionnalisé Cy3 fluorophore</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0442S</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5425 R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-414-051</td><td>Centrifugeuse de paillasse avec refroidissement</td></tr><tr><td>Alcool éthylique,</td><td>Millipore Sigma</td><td>pur 459844</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>E9884</td><td>Dissoudre dans H2O à 0,5 M</td></tr><tr><td>Octamère d’histones humaines (H4, L50C ; H2A, K119C)&nbsp ;</td><td>N/A</td><td>N/A</td> Les <td>protéines d’histones recombinantes et celles hébergeant des mutations de marquage ont été purifiées en interne comme décrit précédemment (voir réf. 33, 34, 35, 36). En bref, les histones recombinantes ont été exprimées dans les cellules pLySS BL21 (De3) (Promega). Les corps d’inclusion ont été isolés après sonication, et les histones ont été extraites dans des conditions de dénaturation. Les histones ont été dialysées dans le tampon A (7 M d’urée, 10 mM de chlorhydrate de tris pH 8,0, 100 mM de chlorure de sodium, 1 mM d’EDTA et 5 mM de 2-mercaptoéthanol), et la solution a été ajoutée à une colonne gravitaire chargée de Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). L’écoulement a ensuite été ajouté à une colonne de gravité SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), et les histones ont été éluées de la colonne en ajoutant le tampon A complété par 600 mM de chlorure de sodium. Des histones porteuses de mutations de marquage (H4, L50C ; H2A, K119C) ont été purifiés puis conjugués au fluorophore souhaité via des colorants fonctionnalisés par maléimide (Cytiva, Lumidyne) en utilisant un rapport molaire colorant/protéine de 20:1 (voir réf. 33, 34). Les octamères d’histones ont été assemblés en ajoutant un rapport molaire égal de chaque histone de type sauvage ou marquée au fluorophore dans des conditions de dénaturation, dialysés dans un tampon à haute teneur en sel contenant 2 M de chlorure de sodium, puis purifiés par chromatographie d’exclusion stérique comme décrit précédemment (voir réf. 36, 37). Alternativement, des protéines d’histones individuelles et des octamères d’histones prêts à l’emploi peuvent être achetés dans le commerce (par exemple, Epicypher).&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tampon d’image</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>20 mM chlorhydrate de tris pH 8,0, 100 mM chlorure de sodium</td></tr><tr><td>Fragment de Klenow (3' à 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA (dam-, dcm-)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SD0021</td><td>Sans méthylation &lambda ; ADN</td></tr><tr><td>LD655-MAL</td><td>Lumidyne Technologies</td><td>9</td><td>Maléimide Fluorophore LD655 fonctionnalisé</td></tr><tr><td>Linker histone H1.4 (A4C)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Protéine recombinante purifiée fabriquée en interne (voir réf. 38)</td></tr><tr><td>LUMICKS C-Trap Dymo</td><td>LUMICKS</td><td>N/A</td><td>Configuration à double piège ; matériaux standard pour l’instrument fournis par le fabricant</td></tr><tr><td>Solution d’acétate de magnésium</td><td>Millipore Sigma</td><td>63052-100ML</td><td>À utiliser pour fabriquer un tampon HR</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Inclus avec le kit de fragments Klenow</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Millipore Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>Dissoudre dans H2O et passer à travers un filtre de 0,22 um</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3911</td><td>Utilisation pour fabriquer un tampon PBS et HR</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Millipore Sigma</td><td>P0662</td><td>À utiliser pour fabriquer du PBS</td></tr><<tr><td>em>S. cerevisiae Nap1</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Nap1 a été purifié en interne comme décrit précédemment (voir réf. 33, 34). Alternativement, Nap1 peut être acheté dans le commerce (par exemple, Active Motif).</td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>Millipore Sigma</td><td>241245</td><td>Dissoudre dans H2O à 3 M</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>Utilisation pour fabriquer du PBS et un tampon d’image</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9763</td><td>Utilisation pour fabriquer des</td></tr><tr><td>particules enrobées de biotine PBS SPHERO (3.0-3.4 &micro ; m)</td> <td>Spectrophotomètre Spherotech</td><td>TP-30-5</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Fisher</td><td>Scientific</td><td>ND2000</td><td>Spectrophotomètre NanoDrop</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Dissoudre dans H2O et ajuster au pH approprié ; utiliser pour faire du tampon d’image et du tris acétate</td></tr></tbody></table>

assemblage de nucléosomes in situ pour la microscopie à force corrélative et à fluorescence d’une molécule unique

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

À l’aide de la configuration décrite à l’étape 3 (figure 1A), la formation de nucléosomes le long du lien d’ADN a été visualisée sous la forme de foyers fluorescents rouges sur un balayage 2D (figures 1B, à gauche) ou de trajectoires dans le temps sur un kymographe (figure 1B, à droite). Des nucléosomes correctement enveloppés ont produit des trajectoires de fluorescence qui étaient stationnaires dans le temps à l’intérieur de la limite de diffraction de la détection confocale (~300 nm). Notamment, plusieurs nucléosomes formés à proximité les uns des autres sous la limite de diffraction ne peuvent pas être résolus spatialement et apparaissent comme des foyers ou des trajectoires plus brillants. Néanmoins, les étapes de photoblanchiment des trajectoires nucléosomales individuelles ont été analysées et ont fréquemment montré des événements de photoblanchiment en 1 étape (Figure 1C) ou en 2 étapes (Figure 1D), ce qui indique que les foyers contenaient principalement des mononucléosomes compte tenu du taux de marquage d’environ 70 % de la protéine H4 dans cet échantillon. De plus, sur la base du nombre moyen de photons pour un seul fluorophore LD655 dans ces conditions expérimentales, le nombre de copies H4 marquées dans chaque trajectoire de nucléosome a été estimé et a montré que les loci des nucléosomes contenaient principalement (&gt;75%) 1 ou 2 copies H2A marquées (Figure 1E), ce qui est encore une fois cohérent avec l’idée qu’ils étaient principalement chargés en tant que mononucléosomes séparés dans l’espace. Les autres foyers plus brillants contenaient plus de 3 copies de H4 marqué, représentant probablement plusieurs nucléosomes à l’intérieur de la limite de diffraction.
La formation des nucléosomes a également été surveillée par une augmentation de la tension le long de l’attache lorsque les positions des OT sont restées constantes alors que plus d’ADN était enroulé autour des octamères d’histones (Figure 1B, en bas). En l’absence de Nap1, les octamères d’histones peuvent toujours se lier à l’ADN mais restent la plupart du temps déballés, car la tension associée lorsque les positions OT étaient maintenues restait constante (Figure 1F). Il est possible que la liaison non spécifique des octamères d’histones à l’ADN se produise même en présence de Nap1. Dans une autre expérience, le même protocole pour former des nucléosomes contenant du H2A marqué au Cy3 a été effectué, ce qui a donné des résultats similaires à ceux obtenus avec du H4 marqué au LD655 (Figure 1G), indiquant l’assemblage d’octamères intacts en nucléosomes.
À l’aide de la configuration décrite à l’étape 4 (Figure 2A), le déballage des nucléosomes a été visualisé au fil du temps sur un kymographe à mesure que la distance d’attache augmentait (Figure 2B). Il a été précédemment rapporté que les octamères d’histones restent souvent liés à l’ADN après avoir été déballés30,31, et par conséquent, les trajectoires fluorescentes persistent souvent même à des tensions élevées. Le déballage des nucléosomes a également été surveillé sur la courbe FD associée (figure 2C). Les caractéristiques quantifiables de la courbe FD comprennent la force à laquelle le ou les nucléosome(s) se déballent (voir « Transition F » dans l’encart de la figure 2C) ainsi que la longueur de l’ADN qui a été libérée de l’octamère d’histones (voir « ΔL » dans l’encart de la figure 2C), qui existe en multiples de ~24 nm, ce qui correspond à un déballage indépendant des spires internes de l’ADN des nucléosomesindividuels 27, 30. Planche à billets Ces paramètres peuvent être utilisés pour estimer le nombre de nucléosomes formés sur chaque attache ou pour une analyse supplémentaire en aval de la mécanique des nucléosomes. Ainsi, le nombre de ruptures du tour interne obtenu à partir d’expériences de traction mécanique a été comparé au nombre estimé de copies H4 marquées à chaque trajectoire de nucléosome en fonction de l’intensité du monomère, ce qui a montré que les nombres sont largement cohérents (exemples illustrés dans les figures 2D-G). Cependant, il a été noté qu’ils ne correspondent pas parfaitement en raison de l’efficacité marquée de ~70% de la protéine H4 dans l’échantillon et de toute liaison résiduelle d’histones indépendantes de Nap1 à l’ADN, comme le montre la figure 1F. Enfin, comme prévu, l’étirement des attaches d’ADN nu liées à Nap1 (sans histones) ne génère pas de transitions induites par la force (Figure 2H), ce qui indique que Nap1 seul ne déforme pas significativement l’ADN.
En utilisant la configuration décrite à l’étape 5 (Figure 3A), la liaison de l’histone de liaison H1 à la chromatine a été visualisée comme l’apparition de foyers fluorescents verts le long du lien de chromatine (Figure 3B). Notamment, les nucléosomes liés à H1 ont généré des trajectoires bicolores (voir les flèches blanches sur la figure 3B) qui sont apparues stationnaires au fil du temps. De plus, des trajectoires de diffusion de H1 à travers des régions d’ADN sans nucléosomes ont été observées (voir les étoiles vertes sur la figure 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig01.jpg"> Figure 1 : Formation de nucléosomes in situ médiée par Nap1. (A) Schéma du dispositif expérimental décrit dans le protocole de formation de nucléosomes in situ médié par Nap1 (étape 3). Une paire de billes a été piégée optiquement dans le chapitre 1, et une seule molécule d’ADN λ a été attachée entre les billes par liaison biotine-streptavidine dans le chapitre 2. La longe a ensuite été déplacée vers le canal 4, contenant les octamères d’histones marqués au LD655 (rouge) et Nap1 pour la formation en temps réel de nucléosomes à travers l’ADN. (B) Balayage 2D représentatif (à gauche) et kymographe (à droite) d’un câble d’ADN contenant un nucléosome marqué au LD655-H4. La lecture de la force associée (en bas) montre une augmentation immédiate de la force lorsque la longe est déplacée vers le canal 4 lorsque les positions OT sont maintenues constantes, indiquant l’enroulement des nucléosomes. Des trajectoires plus brillantes signifient que plusieurs nucléosomes adjacents se trouvent dans la limite de diffraction de ~300 nm. (C) Exemple de kymographe montrant un événement de photoblanchiment en 1 étape (flèche blanche) d’un nucléosome contenant la DL655-H4. (D) Exemple de kymographe montrant un événement de photoblanchiment en 2 étapes (flèches blanches) d’un nucléosome contenant LD655-H4. (E) Fréquence relative du nombre de H4 marqués à la LD655 par trajectoire estimée à partir de leur intensité de fluorescence. (F) Kymographe représentatif d’une longe liée par des octamères d’histones en l’absence de Nap1. La lecture de la force associée (en bas) reste inchangée même lorsque les octamères d’histones se lient à l’ADN. (G) Kymographe représentatif d’une attache d’ADN contenant un nucléosome marqué au Cy3-H2A. La lecture de la force associée (en bas) montre une augmentation de la force immédiatement lorsque la longe est déplacée vers le canal 4 (contenant les octamères et Nap1), car les nucléosomes se forment lorsque les positions OT sont maintenues constantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig02.jpg"> Figure 2 : Essai de désemballage des nucléosomes. (A) Schéma du dispositif expérimental décrit dans le protocole de désemballage des nucléosomes (étape 4). Le lien d’ADN contenant des nucléosomes a été déplacé vers le canal 3 contenant un tampon d’image sans protéines où la distance entre les billes a été augmentée et les nucléosomes ont été déballés. (B) Kymographe représentatif d’une attache d’ADN contenant un nucléosome tirée à des forces élevées en augmentant progressivement la distance entre les billes. La diminution de l’intensité de la fluorescence vers la perle inférieure était probablement due à l’inclinaison de l’ADN légèrement hors de la mise au point du balayage linéaire. (C) La courbe FD associée montrant les transitions induites par la force du déballage du tour intérieur se produisant entre 8 et 37 pN. L’encart montre une vue agrandie d’un exemple de transition pour lequel la distance déroulée (ΔL = ~24 nm pour la rotation interne de l’ADN de nucléosomes individuels) et la force de transition (transition F) peuvent être enregistrées et analysées plus en détail. Pour cette attache, 26 nucléosomes ont été déballés, et la attache s’est rompue à ~65 pN, comme l’indique la ligne pointillée blanche dans le kymographe. (D, E) Exemple : une attache contenant des nucléosomes LD655-H4 tirée à des forces élevées où le nombre de H4 par trajectoire est estimé par l’intensité de fluorescence (indiquée dans le kymographe, D) et le nombre de nucléosomes enroulés est estimé par la taille de la variation de distance induite par la force (indiquée dans la courbe force-distance associée, E). (F,G) Un autre exemple comme dans (D,E). (H) Les attaches d’ADN (n = 5) ont été tirées à des forces élevées après avoir été incubées dans un canal contenant uniquement Nap1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig03.jpg"> Figure 3 : Visualisation de l’interaction protéine-chromatine (A) Schéma du dispositif expérimental décrit dans le protocole de visualisation de la liaison des protéines à la chromatine (étape 5). Le lien d’ADN contenant des nucléosomes a été déplacé vers le canal 5, contenant 10 nM d’histone de liaison H1 marquée par Cy3 (vert). (B) Kymographe bicolore représentatif de H1 se liant à un lien d’ADN contenant un nucléosome. Les événements de colocalisation du nucléosome H1 sont indiqués par des flèches blanches. La trajectoire non liée du nucléosome est indiquée par la flèche magenta. Les molécules H1 diffusant sur l’ADN nu sont désignées par des étoiles vertes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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