Mesure de l’absorption microgliale de particules fluorescentes administrées par voie intravitréenne à l’aide de la cytométrie en flux

Commencez avec une plaque multipuits contenant une suspension unicellulaire de cellules myéloïdes rétiniennes de souris, y compris des microglies, des monocytes et des neutrophiles.

Les cellules microgliales - ou cellules immunitaires phagocytaires rétiniennes, présentent une fluorescence due à des bioparticules d’origine fongique marquées au fluorophore englouties, préinjectées par voie intravitréenne.

Centrifuger et ajouter des anticorps récepteurs Fc, en bloquant les sites d’interaction non spécifiques.

Introduire un cocktail d’anticorps marqués au fluorophore ciblant les protéines de surface CD11b, Ly6C et Ly6G, interagissant avec les cellules myéloïdes qui les expriment.

Retirez les anticorps non liés. Traiter avec de l’iodure de propidium, qui pénètre à travers les membranes endommagées, colorant exclusivement les cellules mortes.

En cytométrie en flux, excitez l’iodure de propidium pour exclure les cellules mortes et identifier les cellules vivantes non fluorescentes.

Illuminez les cellules avec un laser violet ; les cellules vivantes excitées signifient les cellules myéloïdes exprimant CD11b.

Ensuite, illuminez avec un laser rouge, excitant le fluorophore rouge proche du rouge lointain dans les cellules CD11b positives, indiquant les monocytes exprimant Ly6C et les neutrophiles exprimant Ly6G.

Exciter les cellules à l’aide d’un laser bleu ; l’émission de fluorescence verte à partir des cellules CD11b positives restantes confirme l’absorption microgliale des particules fluorescentes.

Trois heures après l’injection intravitréenne, utilisez une pince à angle de 45 degrés pour appuyer doucement contre la paupière afin de proptoser le globe oculaire. Placez la pince derrière le globe oculaire et tirez. Ensuite, transférez le globe oculaire dans la zone sèche d’une boîte de Pétri contenant un petit volume de PBS avec du calcium et du magnésium sous un microscope à dissection, et utilisez une pointe de la pince ultra-fine pour perforer l’œil dans le limbe cornéen. Ensuite, en tenant le globe oculaire avec une fine pince inclinée à 45 degrés, utilisez des ciseaux à ressort pour couper autour du limbe cornéen jusqu’à ce qu’environ la moitié de la circonférence soit coupée.

Transférez le globe oculaire dans le PBS et utilisez une deuxième paire de pinces fines à 45 degrés pour déchirer la cornée et la sclérotique. Le cristallin et la rétine en ressortiront intacts. Assurez-vous que le cristallin et la rétine sont séparés et transférez la rétine dans un tube à essai en polystyrène de 5,4 millilitres contenant 2 millilitres de PBS avec du calcium et du magnésium.

Pour obtenir une suspension unicellulaire des cellules rétiniennes, utilisez un kit de dissociation des tissus neuronaux selon les instructions du fabricant et remettez les cellules en suspension dans 200 microlitres de tampon de coloration. Ensuite, transférez l’échantillon dans un puits d’une plaque à fond en U de 96 puits. Après la centrifugation, retournez la plaque pour éliminer le surnageant et bloquez les récepteurs FC avec 25 microlitres de tampon de coloration contenant des anticorps CD16/CD32 par puits pendant 5 minutes à température ambiante. Ensuite, étiquetez les cellules avec les anticorps d’intérêt pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité.

Ensuite, granulez les cellules et faites suivre d’un lavage dans 200 microlitres de tampon de coloration frais par puits. Maintenant, remettez les granulés en suspension dans 200 microlitres de tampon de coloration et de colorant de viabilité et transférez les échantillons dans des tubes de microtitration de 1,2 millilitre. Ensuite, lavez les puits avec 100 microlitres supplémentaires de tampon de coloration et de colorant de viabilité et regroupez les lavages avec les échantillons correspondants pour l’analyse par cytométrie en flux.