Évaluation Retinal microglial phagocytaire Fonction

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la fonction phagocytaire des microglies rétiniennes in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'ophtalmologie, comme de savoir si certains composés modifient la fonction phagocytaire des microglies dans un contexte physiologique. Le principal avantage de cette technique est qu'elle utilise la cytométrie en flux, permettant une analyse quantitative rapide et précise de la phagocytose microgliale.

Seront m'aider à démontrer la procédure Susumu Sakimoto, un postdoctorant de mon laboratoire. Commencez par charger une aiguille de calibre 33 et une seringue avec 0,5 microlitre de solution de particules marquées de façon fluorescente. Ensuite, placez une souris anesthésiée sur le côté, sur un matériau souple, sous un microscope chirurgical, et confirmez le niveau approprié de sédation par l'absence de réponse à une pincement des orteils.

Ensuite, utilisez une pince pour appliquer délicatement une pression autour d'une paupière, de manière à faire légèrement sortir le globe oculaire de son orbite. Saisissez ensuite la tête avec deux doigts juste au-dessus de l'oreille et sur la mâchoire de l'animal, puis étirez doucement la peau parallèlement aux paupières afin de maintenir l'œil légèrement proéminent hors de son orbite. Les injections intravitréennes sont délicates et, si elles ne sont pas réalisées correctement, entraînent des résultats biaisés et variables.

Pour réduire le traumatisme oculaire, maintenez l'animal en position stable avec un mouvement minimal de la tête. Pour percer le globe oculaire, saisissez délicatement la souris avec une main. Repérez ensuite le limbe cornéen, zone de jonction entre la cornée et la sclérotique, visible sous forme d'un cercle gris chez les souris pigmentées.

Tenant la seringue de l'autre main, insérez l'aiguille dans le limbe. Ensuite, retirez légèrement l'aiguille pour expulser un petit volume de liquide vitréen, puis appuyez lentement sur le piston pour injecter les particules. Une fois que toutes les billes ont été administrées, retirez lentement la seringue afin d'éviter un reflux du matériau injecté et appliquez des gouttes hydratantes pour maintenir l'œil hydraté une fois qu'il est revenu en place.

Ensuite, placer l'animal sur un tapis chauffant dans sa propre cage avec surveillance jusqu'à ce qu'il soit complètement rétabli. Trois heures après l'injection intravitréenne, utiliser une pince à angle de 45 degrés pour appuyer doucement contre la paupière afin de faire proptoser le globe oculaire. Positionner la pince derrière le globe oculaire et tirer.

Ensuite, transférez le globe oculaire dans la zone sèche d'une boîte de Pétri contenant un petit volume de PBS avec du calcium et du magnésium sous un microscope stéréo. Utilisez ensuite une pointe d'une pince très fine pour perforer l'œil au niveau du limbe cornéen. Puis, en maintenant le globe oculaire avec une pince fine à angle de 45 degrés, utilisez des ciseaux à ressort pour découper tout autour du limbe cornéen jusqu'à ce qu'environ la moitié de la circonférence soit sectionnée.

Transférez le globe oculaire dans du PBS et utilisez une deuxième paire de forceps fins angulés à 45 degrés pour séparer la cornée et la sclérotique. Le cristallin et la rétine sortiront intacts. Veillez à bien séparer le cristallin et la rétine, puis transférez la rétine dans un tube à essai en polystyrène de 5,4 millilitre contenant deux millilitres de PBS avec du calcium et du magnésium.

Pour obtenir une suspension monocellulaire des cellules rétiniennes, utilisez un kit de dissociation des tissus neuronaux conformément aux instructions du fabricant et resuspendez les cellules dans 200 microlitres de tampon de marquage. Transférez ensuite l'échantillon dans un puits d'une plaque en U de 96 puits. Après centrifugation, retournez la plaque pour éliminer le surnageant et bloquez les récepteurs FC avec 25 microlitres de tampon de marquage contenant l'anticorps anti-CD16, CD32 par puits pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, étiquetez les cellules avec les anticorps d'intérêt pendant 15 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière. Ensuite, centrifugez les cellules et effectuez un lavage avec 200 microlitres de tampon de marquage frais par puits. Resuspendez maintenant les culots dans 200 microlitres de tampon de marquage et de colorant de viabilité, puis transférez les échantillons dans des tubes microtitres de 1,2 millilitre.

Ensuite, lavez les puits avec 100 microlitres supplémentaires de tampon de marquage et de colorant de viabilité, puis rassemblez les lavages avec les échantillons correspondants pour analyse par cytométrie en flux. Cette méthode peut être utilisée chez des souris postnatales âgées de 10 à 20 jours ou chez des adultes, et peut être adaptée pour évaluer l'effet de composés et/ou de la modulation génétique de la phagocytose microgliale. Par exemple, dans cette expérience, après une stimulation intrapéritonéale avec différentes doses de LPS, une dose de 1,42 milligramme par kilogramme de LPS s'est révélée induire une augmentation statistiquement significative du pourcentage de microglies phagocytaires, par rapport aux témoins traités au véhicule.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six heures si elle est correctement exécutée. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le tri cellulaire suivi d'une qPCR ou d'une analyse protéomique peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires concernant les différences entre les microglies phagocytaires et non phagocytaires dans la rétine. En développant cette technique, nous espérons désormais permettre aux chercheurs en vision et en neurosciences d'explorer plus en profondeur la fonction phagocytaire des microglies in situ et dans un contexte physiologiquement pertinent.