Évaluation Retinal microglial phagocytaire Fonction In Vivo L'utilisation d'un test basé sur la cytométrie de flux

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer la fonction phagocytaire de la microglie rétinienne in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ophtalmologie, par exemple si certains composés modifient la fonction phagocytaire de la microglie dans un cadre physiologique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise la cytométrie en flux, permettant une analyse quantitative rapide et précise de la phagocytose microgliale.

Susumu Sakimoto, un postdoctorant de mon laboratoire, m’aidera à faire la démonstration de la procédure. Commencez par charger une aiguille et une seringue de calibre 33 avec 0,5 microlitre de solution de particules marquées par fluorescence. Ensuite, placez une souris anesthésiée sur le côté sur un matériau mou sous un microscope chirurgical et confirmez le niveau approprié de sédation par une absence de réponse au pincement de l’orteil.

Ensuite, utilisez une pince pour appliquer soigneusement une pression autour d’une paupière, de sorte que la boule oculaire sorte légèrement de l’orbite. Saisissez ensuite la tête avec deux doigts juste au-dessus de l’oreille et près de la mâchoire de l’animal, et étirez doucement la peau parallèlement aux paupières pour maintenir l’œil légèrement bombé hors de l’orbite. Les injections intravitréennes sont difficiles et, si elles ne sont pas effectuées correctement, elles conduiront à des résultats biaisés et variables.

Pour réduire les traumatismes oculaires, maintenez l’animal dans une position stable avec un mouvement minimal de la tête. Pour percer le globe oculaire, saisissez doucement la souris d’une main. Localisez ensuite le limbe cornéen où la cornée et la sclérotique se connectent, ce qui est visible sous la forme d’un cercle gris chez les souris pigmentées.

En tenant la seringue dans l’autre main, insérez l’aiguille dans le limbe. Ensuite, rétractez légèrement l’aiguille pour expulser un petit volume de liquide vitré, et appuyez lentement sur le piston pour injecter les particules. Lorsque toutes les billes ont été distribuées, retirez lentement la seringue pour éviter le reflux du matériau injecté et appliquez des gouttes hydratantes pour garder l’œil hydraté une fois que l’œil s’est rétracté en place.

Placez ensuite l’animal sur un coussin chauffant dans sa propre cage avec surveillance jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli. Trois heures après l’injection intravitréenne, utilisez une pince à angle de 45 degrés pour appuyer doucement contre la paupière afin de proptoser le globe oculaire. Placez la pince derrière le globe oculaire et tirez.

Transférez ensuite le globe oculaire dans la zone sèche d’une boîte de Pétri, contenant un petit volume de PBS avec du calcium et du magnésium sous un microscope de dissection. Et utilisez la pointe d’une pince ultrafine pour perforer l’œil dans le limbe cornéen. Ensuite, en tenant le globe oculaire avec une fine pince inclinée à 45 degrés, utilisez des ciseaux à ressort pour couper autour du limbe cornéen jusqu’à ce qu’environ la moitié de la circonférence soit coupée.

Transférez le globe oculaire dans le PBS et utilisez une deuxième paire de pinces fines à 45 degrés pour déchirer la cornée et la sclérotique. Le cristallin et la rétine en ressortiront intacts. Assurez-vous que le cristallin et la rétine sont séparés et transférez la rétine dans un tube à essai en polystyrène de 5,4 millilitres, contenant deux millilitres de PBS avec du calcium et du magnésium.

Pour obtenir une suspension unicellulaire des cellules rétiniennes, utilisez un kit de dissociation des tissus neuronaux selon les instructions du fabricant et remettez les cellules en suspension dans 200 microlitres de tampon de coloration. Transférez ensuite l’échantillon dans un puits d’une plaque à fond en U de 96 puits. Après la centrifugation, retournez la plaque pour éliminer le surnageant et bloquez les récepteurs FC avec 25 microlitres de tampon de coloration contenant des anticorps CD16, CD32 par puits pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, étiquetez les cellules avec les anticorps d’intérêt pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, granulez les cellules et faites-les suivre d’un lavage dans 200 microlitres de tampon de coloration fraîche par puits. Maintenant, remettez les granulés en suspension dans 200 microlitres de tampon de coloration et de colorant de viabilité et transférez les échantillons dans des tubes de microtitration de 1,2 millilitre.

Ensuite, lavez les puits avec 100 microlitres supplémentaires de tampon de coloration et de colorant de viabilité et regroupez les lavages avec les échantillons correspondants pour l’analyse par cytométrie en flux. Cette méthode peut être utilisée chez des souris postnatales ou adultes âgées de 10 à 20 jours et peut être adaptée pour tester l’effet de composés et/ou la manipulation génétique de la phagocytose microgliale. Par exemple, dans cette expérience, après provocation intrapéritonéale avec des doses variables de LPS, une dose de 1,42 milligramme par kilogramme de LPS a été déterminée pour induire une augmentation statistiquement significative du pourcentage de microglie phagocytaire, par rapport aux témoins soumis à l’excipation.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six heures si elle est exécutée correctement. Après cette procédure, d’autres méthodes, telles que le tri cellulaire suivi d’une qPCR ou d’une analyse protéomique, peuvent être utilisées pour répondre à d’autres questions sur les différences entre les microglies phagocytaires et non phagocytaires dans la rétine. En développant cette technique, nous nous attendons à ce que nous puissions maintenant permettre aux scientifiques de la vision et des neurologues d’explorer davantage la fonction phagocytaire microgliale in situ et dans un contexte physiologiquement pertinent.