Développement d’organoïdes nerveux moteurs dérivés d’iPSC humains à l’aide d’une puce microfluidique

Prenez des cellules souches pluripotentes induites humaines, ou iPSC, dans un milieu de cellules souches riche en nutriments avec des inhibiteurs de la Rho-kinase.

Les inhibiteurs pénètrent dans les cellules et bloquent les enzymes rho-kinases, empêchant ainsi la mort cellulaire apoptotique.

Les cellules utilisent les nutriments pour proliférer et s’agréger spontanément pour former un amas de cellules tridimensionnelles appelé sphéroïde.

Progressivement, remplacez le milieu par un milieu d’induction neuronale. Les modulateurs de signalisation du milieu entraînent la différenciation des cellules souches en cellules neurales.

Remplacez-les par un milieu neuronal riche en facteurs de croissance pour différencier les cellules sphéroïdes en motoneurones et former un sphéroïde de motoneurone ou MNS.

Transférez ces MNS dans une puce microfluidique recouverte de polymère contenant un milieu de maturation.

Les facteurs de croissance nerveuse dans le milieu stimulent les axones ou les projections plus longues des neurones à se développer à partir du sphéroïde et à s’étendre à travers le microcanal de la puce.

Cela forme un organoïde du nerf moteur, un modèle tridimensionnel du tissu nerveux moteur.

Pour induire la différenciation des cellules iPS 3D en motoneurones, ensemencez 4 x 10^cellules 4 iPS par puits dans le nombre approprié de puits d’une plaque à fond en U de 96 puits dans 100 microlitres de milieu de culture cellulaire nourricier et sans sérum complété par 10 micromolaires Y27632.

Le lendemain, remplacez le surnageant dans chaque puits par 100 microlitres de milieu KSR complété par 10 micromolaires SB-431542 et 100 nanomolaires LDN-193189. Les jours 2 et 3, remplacez les surnageants par 100 microlitres de milieu KSR complété par 10 micromolaires SB-431542, 100 nanomolaires LDN-193189, 5 micromolaires DAPT, 5 micromolaires SU-5402, 1 acide rétinoïque micromolaire et un agoniste micromolaire lissé. Les jours 4 et 5, remplacez les surnageants par un mélange de 75 % de milieu KSR et de 25 % de milieu N2, complété par 10 micromolaires SP-431542, 100 nanomolaires LDN-193189, 5 micromolaires DAPT, 5 micromolaires SU-5402, 1 acide rétinoïque micromolaire et 1 agoniste micromolaire lissé.

Les jours 6 et 7, remplacez les surnageants par un mélange de 50 % de milieu KSR et de 50 % de milieu N2, complété par 5 DAPT micromolaires, 5 micromolaires SU-5402, 1 acide rétinoïque micromolaire et 1 agoniste lissé micromolaire. Les jours 8 et 9, remplacez les surnageants par un mélange de 25 % de milieu KSR et de 75 % de milieu N2, complété par 5 micromolaires DAPT, 5 micromolaires SU-5402, 1 acide rétinoïque micromolaire et 1 agoniste micromolaire lissé. Les jours 10 et 11, remplacez les surnageants par un milieu N2 complété par 5 micromolaires DAPT, 5 micromolaires SU-5402, 1 acide rétinoïque micromolaire et 1 agoniste micromolaire lissé. Le 12e jour, remplacez les surnageants dans chaque puits par 100 microlitres de milieu de maturation, complétés par 20 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé du cerveau par puits.

Pour induire la formation d’organoïdes du nerf moteur, remplacez la solution d’enrobage dans la puce PDMS par 150 microlitres de milieu de maturation complété par 20 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé du cerveau, et utilisez une pointe de micropipette à large alésage pour ajouter doucement des sphéroïdes de motoneurones d’un puits de la plaque de 96 puits dans l’entrée du microcanal de la puce. Placez un petit réservoir d’eau stérile près de la puce de culture tissulaire dans la boîte pour éviter l’évaporation du milieu, et placez la boîte dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Tous les deux à trois jours, remplacez la moitié du milieu de culture épuisé du centre du réservoir de milieu par un milieu de maturation frais complété par 20 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé du cerveau. Les axones se développeront à partir du sphéroïde du motoneurone dans le canal, s’assemblant spontanément en un seul faisceau sur une période de deux à trois semaines pour former un organoïde de nerf moteur.