Dans l'endocytose hépatique in vivo suivie d'une purification des cellules du foie par perfusion du foie

Les objectifs généraux de cette procédure sont d’évaluer l’activité endocytaire des cellules hépatiques, suivie de l’isolement d’une population pure de cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques viables qui peuvent être cultivées dans des boîtes en plastique. Ceci est accompli en canulant et en excissant le foie d’un animal vivant et en rinçant le foie avec une solution tamponnée en sel pour éliminer le sang. Les cellules du foie sont ensuite exposées à des ligands marqués pour l’internalisation.

L’étape suivante consiste à digérer le foie avec de la collagénase pour produire un mélange de cellules hépatiques en suspension. Ensuite, la centrifugation différentielle avec gradients de perol est utilisée pour séparer les secondes des cellules étoilées, des petits hépatocytes, des cellules sanguines résiduelles et des débris cellulaires. La dernière étape consiste à séparer les secondes des cellules de cuivre par adhérence sur le verre.

En fin de compte, des secs purifiés viables sont obtenus qui peuvent être analysés pour l’absorption de ligands et/ou être cultivés pour des applications en aval. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la biologie du foie, telles que le rôle des cellules endothéliales hépatiques et l’élimination des macromolécules dans le sang, ou les réponses à différentes conditions physiologiques telles que les lésions hépatiques, la stéatose hépatique, le ssis, la fibrose et le vieillissement. Contrairement à d’autres cellules hépatiques immortalisées, il n’existe pas de lignées cellulaires endothéliales sinusoïdales hépatiques différenciées.

Ces cellules primaires doivent donc être dérivées directement de l’animal. La procédure que nous allons vous montrer aujourd’hui implique la purification des cellules endothéliales sinusoïdales du foie sans l’utilisation d’équipements tels que la centrifugation et la lution. La procédure que nous allons vous montrer implique la récolte de cellules sur une base de culture à court terme, où nous n’allons pas utiliser de technique stérile tout au long de la procédure.

Cependant, si vous souhaitez utiliser des cultures à long terme, vous devez utiliser une technique stérile et utiliser une enceinte de biosécurité. La démonstration visuelle de cette procédure est essentielle car le placement du cathéter ainsi que l’étanchéité des sutures, ainsi que le prélèvement du foie de l’animal sans couper le foie, ainsi que le désengagement du cathéter sont essentiels. Préparez-vous à l’expérience en pesant la collagénase et en la mettant sur de la glace.

Ensuite, réchauffez et oxygénez le TBS et préparez les outils nécessaires. Ensuite, sélectionnez un rat de 200 grammes et anesthésez-le profondément dans une chambre en fluor. Confirmez l’anesthésie en mouillant l’abdomen ventral avec de l’éthanol à 70 %.

S’il n’y a pas de réponse, procédez à l’ouverture de la cavité abdominale à l’aide de ciseaux et de pinces pour de meilleurs résultats. Les étapes suivantes du blanchiment du foie ne devraient prendre que quelques minutes. Localisez la veine porte et placez deux sutures sous la veine, juste au-dessus de la branche mésentérique.

Maintenant, canulez la veine avec un cathéter de calibre 18. L’aiguille qui bouche le cathéter doit dépasser de plusieurs millimètres la boucle du fil, déclencher la libération de l’aiguille et resserrer la suture avec deux nœuds simples, également appelés nœuds de grand-mère ou de nœuds carrés. Commencez à rincer le sang du foie avec le TBS pendant pas plus de 10 minutes.

Sectionnez l’une des artères principales pendant que le foie est en train de rougir. Exciser le foie en coupant le tractus gastro-intestinal et le tissu conjonctif. Placez le foie excisé sur un entonnoir qui permet la recirculation des liquides, mais ne faites pas encore recirculer les fluides à 50 millilitres.

RPMI Media dans un petit bécher. Ajouter à une concentration finale, 0,05 % BSA et 0,01 millicuries d’héparine radiomarquée ou un autre ligand correctement marqué. Pour l’endocytose, fixez-le à l’appareil pour permettre l’oxygénation.

Éteignez la pompe, changez le tube d’entrée, puis allumez la pompe à 20 millilitres par minute. Lorsque l’IPRP étiqueté s’approche du foie, éteignez la pompe et laissez l’excès de liquide dans l’entonnoir et le tube s’écouler. Placez le tube de vidange dans le bécher de média pour permettre la recirculation du média étiqueté, puis redémarrez la pompe.

Laissez les liquides recirculer dans le foie pendant pas plus d’une heure. Au cours de cette étape d’internalisation, assurez-vous que la température dans le foie est stable en le recouvrant et préparez la collagénase pour la digestion afin de mettre fin à l’endocytose du ligand. Le foie est rincé avec du TBS pendant deux minutes pour débarrasser les sinusoïdes hépatiques du ligand non lié en préparation de la digestion de la collagénase.

Pendant les deux minutes qui suivent le nouveau rinçage au TBS, dissoudre la collagénase A pré-pesée dans le tampon deux jusqu’à une concentration de 0,45 micromolaire et filtrer la solution immédiatement après le rinçage du foie, éteindre la pompe et changer les fluides pour rincer la collagénase. A commencer le rinçage avec recirculation au même débit. Évaluer jusqu’à quelques minutes après la collagénase.

Une perfusion. Retirez le cathéter et transférez le foie dans une coupelle. Contenir le tampon un à l’aide d’une pince, retirer la capsule du foie et secouer les cellules dans le liquide.

Au fur et à mesure que le liquide devient opaque, passez les cellules à travers un maillage de 100 microns suivi d’un maillage de 30 microns, puis dans un cylindre conique de 50 millilitres. À température ambiante, ajoutez plus de tampon dans la boîte et dissociez mécaniquement plus de cellules hépatiques. Transférez-les ensuite sur le filtre.

Continuez ce processus jusqu’à ce qu’aucune cellule ne puisse être délogée en secouant raisonnablement. Commencez par laver les cellules, centrifugez-les à 150 fois G jusqu’à ce qu’elles soient pâles. Transférez ensuite le S natin contenant des cellules non parenchymateuses dans un cône de 50 millilitres sur de la glace et remettez en suspension le granulé dans 40 millilitres.

Tampon un. Répétez le processus de lavage deux fois dans le tampon trois pour faire des pastilles qui sont au moins 97 % d’hépatocytes pour obtenir une population de S secs qui est au moins 95 % pure centrifugeuse, la conique de super natin à 200 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, jetez le liquide et réusez, suspendez toutes les pastilles de cellules dans cinq millilitres de R-P-M-I-B-S-A à quatre degrés Celsius.

Tirez les cellules dans deux tubes et remplissez les tubes avec R-P-M-I-B-S-A à 35 millilitres. Maintenant, centrifugez les cellules à 100 fois G pendant trois minutes et transférez les 25 millilitres supérieurs de surnageant contenant les secondes dans un cône de 50 millilitres sur glace. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans les 10 millilitres de milieu restants et ajoutez 25 millilitres de solution froide R-P-M-I-B-S-A.

Répétez l’étape de lavage une fois pour faire deux autres collections de S natin avec des secs. Maintenant, centrifugez les collections de surnageants à 200 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pendant la centrifugation. Remplissez trois coniques avec 20 millilitres de 25 % par appel dans PBS.

Mettez-les sur de la glace et mettez en place une pente par sous-couche. 15 millilitres de 50 % par appel dans chaque tube. Remettez les cellules en suspension dans un total de 30 millilitres, RPMI avec BSA, combinez-les, puis superposez soigneusement chaque gradient avec 10 millilitres de suspension de cellules combinées.

Centrifugez les gradients à 900 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius car les cellules secondes et cofer sont à l’interface 25 50 % et aspirent de haut en bas jusqu’à près de l’interface 25 50 %. Cela enlève les cellules stellaires qui collectent maintenant les cellules dans les interfaces 25 à 50 % et les transfèrent dans une conique avec RPMI froid jusqu’à un volume final d’environ 40 millilitres. Cela dilue la centrifugeuse par appel, les secondes et les cellules fer à 350 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Remettez le granulé en suspension dans environ 10 millilitres de pré-averti non modifié. RPMI transfère la suspension dans une boîte de Pétri ou une boîte de cristallisation et incube la boîte pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, agitez doucement le plat et récupérez les secondes dans le surnageant.

Les cellules Cooper auront adhéré au verre et les secondes pourront être cultivées sur des plaques recouvertes de fibronectine avec des lysats de cellules médiales RPMI modifiés à partir de cellules qui ont adhéré à la boîte et celles qui sont restées en suspension ont été séparées par la page SDS et sondées avec des anticorps anti CD 1 63 Les cellules Cooper, qui contenaient le marqueur CD 1 63 ont été séparées de la CCS par fixation à des cellules de verre qui n’ont pas adhéré à la Le verre a été plaqué sur du plastique recouvert de fibronectine. Six plats bien cuisés et incubés pendant la nuit. Avec RPMI complété par 0,1 % BSA et pen streptocoque.

Sous contraste de phase comme en microscopie, les secondes présentent une morphologie cytoplasmique très plate rappelant leur architecture in vivo. Un anticorps monoclonal contre les deux isoformes du récepteur S Stalin deux. Un marqueur de différenciation SEC a été utilisé pour sonder les hépatocytes, les lysats et les CSC collectés à l’aide du protocole de contour.

Comme prévu, les secondes ont été positives pour stepin. Deux. Dans des expériences antérieures, j’ai injecté de l’héparine marquée avec une étiquette de biotine sur le groupe carboxylate de l’héparine. Le disaccharide a été conjugué à la streptavidine iodée pendant les 30 minutes suivant l’injection.

Le foie était le principal organe qui éliminait l’héparine marquée à l’aide des procédures. Dans cette vidéo, nous montrons que la grande majorité de l’héparine étiquetée est internalisée par secs. Contrairement aux hépatocytes, ces événements d’internalisation se sont produits dans un foie intact dans lequel les cellules sont dans leur état natif.

Donc, après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques d’un animal vivant. Et il est important d’utiliser ces cellules dans les 24 à 48 heures. Comme le foie, les cellules endothéliales sinusoïdales perdent leurs caractéristiques instinctives en très peu de temps en culture.