Une méthode de quantification sensible et spécifique pour la détermination de sérum myosine cardiaque Binding Protein-C par immuno-Electrochemiluminescence

L’objectif global de cette procédure est de quantifier simultanément la protéine C de liaison à la myosine cardiaque et la troponine I cardiaque dans des échantillons de sérum. Pour ce faire, il suffit d’abord d’enduire une plaque à 96 puits d’un anticorps de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque pour un test plex, ou d’utiliser un test triplex précodé. Dans un deuxième temps, les plaques revêtues sont incubées à l’aide d’étalonneurs et d’échantillons de sérum.

Ensuite, des anticorps de détection marqués sont ajoutés à l’étape finale, un signal de chimiluminescence est produit qui est détecté par le lecteur de plaques. En fin de compte, les niveaux des protéines cardiaques d’intérêt présentes dans les échantillons de sérum peuvent être déterminés par des immunoessais simples ou multiplexes. La veille de l’expérience, pipette 30 microlitres d’anticorps monoclonal anti myosine binding protein C de souris sans gélatine dans le coin inférieur de chaque puits d’une plaque standard nue de découverte à l’échelle miso de 96 puits.

Tapotez ensuite les côtés de la plaque pour étaler la solution d’anticorps au fond de chaque puits. Après scellement, incubez la plaque pendant une nuit à quatre degrés Celsius sans secouer. Le lendemain matin, tapotez la solution au-dessus d’un évier, puis sur une pile de serviettes en papier.

Ajoutez ensuite 150 microlitres de 1 % de bloqueur A dans du PBS dans chaque puits pour bloquer la liaison non spécifique. Incuber la plaque scellée pendant une heure à température ambiante tout en agitant à 700 tr/min pendant l’étape de blocage, diluer le fragment C de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque recombinante à une concentration de départ de 2000 nanogrammes par millilitre dans 1 % de bloqueur A dans PBS. Ensuite, diluez cette solution en série par un facteur de cinq, pour un total de sept étalons.

Retirez maintenant la solution de blocage comme nous venons de le démontrer, puis lavez la plaque trois fois avec 150 microlitres de 0,05 % entre 20 po de PBS. Après le troisième lavage, retournez vigoureusement l’assiette au-dessus d’un évier, puis tapotez fermement l’assiette sur une couche de papier absorbant jusqu’à ce qu’elle soit complètement sèche. Ensuite, pipetez 25 microlitres de chaque étalon et échantillonnez dans les puits appropriés.

Ensuite, pendant que la plaque scellée incube sur l’agitateur pendant une heure à température ambiante, diluez sur mesure l’anticorps de détection de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque étiqueté avec sul oag à un microgramme par millilitre dans 1 % de bloqueur A dans PBS. Après avoir soigneusement lavé la plaque comme cela vient d’être démontré, ajoutez 25 microlitres de solution d’anticorps de détection dans chaque puits, puis incubez la plaque scellée pendant une heure à température ambiante tout en l’agitant pendant la période d’incubation, faites fonctionner la plaque de démonstration avec des lumières LED pour assurer le bon fonctionnement de l’imageur de secteur et du logiciel diluez le tampon Reid à ce moment-là également. Après avoir soigneusement lavé la plaque comme démontré précédemment, utilisez une pipette multicanaux pour ajouter 150 microlitres de tampon Reid à chaque puits en prenant soin d’éviter les bulles d’air, puis balayez immédiatement la plaque dans l’imageur sectoriel avant de commencer le test triplex.

Laissez les solutions de plaque triplex à 96 puits et de diluant s’équilibrer à la température ambiante. Ajoutez ensuite 25 microlitres de 1 % de bloqueur A dans du PBS dans la plaque, en vous assurant que tout le puits est recouvert de solution et incubez la plaque scellée à température ambiante pendant 30 minutes tout en agitant. Entre-temps, diluez la protéine de liaison à la myosine cardiaque recombinante C-C-K-M-B et la troponine cardiaque I ensemble dans 1 % de bloqueur A dans le PBS pour créer un étalon contenant 2000 nanogrammes par millilitre de protéine de liaison à la myosine cardiaque, 100 nanogrammes par millilitre de CKMB et 25 nanogrammes par millilitre de troponine cardiaque.

Je dilue ensuite en série ce mélange d’un facteur cinq jusqu’à un volume final d’au moins 100 microlitres pour chaque échantillon dilué standard deux fois avec 1 % de bloqueur A dans du PBS. Ensuite, ajoutez 2 répétitions techniques de 25 microlitres des étalons ainsi que les échantillons aux 25 microlitres de tampon bloquant déjà présents dans les puits de la plaque à trois plex, incluez un blanc de diluant uniquement après avoir incubé la plaque scellée tout en agitant, diluez les trois anticorps de détection d’OAG SUL ensemble à une concentration finale d’un microgramme par millilitre chacun dans un bloqueur de solution A à 1 % et PBS après deux heures. Lavez la plaque comme vous venez de le démontrer, puis utilisez une pipette multicanaux pour ajouter 25 microlitres de solution d’anticorps de détection à chacune.

Bien incuber la plaque scellée pendant une heure tout en secouant à 700 tr/min pendant la période d’incubation. Exécutez la plaque de démonstration et diluez la mémoire tampon Reid comme nous venons de le démontrer. Ensuite, après avoir lavé la plaque avec 0,05 % d’entretoise 20 en PBS, utilisez la pipette multicanaux pour ajouter 150 microlitres de tampon Reid à chaque puits en évitant les bulles d’air et balayez immédiatement la plaque dans l’imageur sectoriel.

Dans cette figure, la courbe standard de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque dans le test plex est comparée à celle de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque dans le test des trois plex. Les deux dosages présentent une sensibilité très élevée et une plage dynamique élevée. La zone de détection du test est affichée en gris, à la fois plex et trois plex.

Les courbes standard de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque sont similaires. La limite inférieure de détection, la limite inférieure de quantification et la limite supérieure des niveaux de quantification sont comparables dans les essais plex et triplex. Ces graphiques montrent les courbes standard de la troponine cardiaque I et de la CKMB de la plaque triplex.

Les deux calibrateurs ont montré une sensibilité élevée et une large plage dynamique. La zone de détection du test est affichée en gris. La réactivité croisée des anticorps de détection avec les deux autres calibrateurs a été étudiée en incubant les courbes standard individuelles des trois calibrateurs avec des anticorps de détection uniques ; seule une faible réactivité croisée a été observée entre le calibrateur CKMB et les anticorps de détection de la troponine I cardiaque et de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque.

Bien qu’aucune réactivité croisée n’ait été observée entre les autres calibrateurs et les anticorps de détection comme preuve de l’applicabilité du test pour la détection des lésions cardiaques, les taux sériques de 16 sujets atteints d’infarctus du myocarde ont été comparés à ceux d’un groupe témoin en utilisant les taux sériques des trois plaques plex de la protéine de liaison à la myosine cardiaque C-C-K-M-B et de la troponine cardiaque. J’ai constaté que les trois biomarqueurs étaient plus élevés chez les patients atteints d’infarctus du myocarde par rapport au groupe témoin.