Name: Une méthode standardisée pour lanalyse des cellules endothéliales et sinusoïdale du foie Leurs fenestrations par microscopie électronique à balayage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Découvrez une méthode standardisée d'analyse des cellules endothéliales sinusoïdales du foie par microscopie électronique à balayage. Ce protocole permet de mesurer précisément la taille et la fréquence des fenestrations pour étudier la fonction hépatique.

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NOTE: Toutes les procédures impliquant l&#39;utilisation d&#39;animaux sont réalisées conformément à la législation locale. Notre travail est approuvé par le Comité de santé du district Animal Welfare Sydney locale. Les procédures autorisées sont décrites dans la documentation de licence de projet et suivent des lignes directrices qui assurent le bien-être de l&#39;animal en tout temps. Veiller au respect de la législation sur l&#39;expérimentation animale du pays où le travail est effectué. 1. Protocole de préparation EM Fixative <ol><li> Pour 100 ml de fixateur, préparer paraformaldéhyde en ajoutant 2 g de poudre de paraformaldéhyde à 25 ml d&#39;eau distillée dans une fiole conique, la chaleur à 65 ° C, en remuant constamment avec un agitateur magnétique. NOTE: Glutaraldéhyde, le paraformaldéhyde et le tampon de cacodylate de sodium sont toutes les substances dangereuses et doivent toujours être manipulés dans hotte. </li><li> Chauffer à 65 ° C pendant 2 min puis laisser refroidir. Si nécessaire, ajouter la solution d&#39;hydroxyde de sodium dropwise en remuant pour effacer solution complètement. NOTE: l&#39;hydroxyde de sodium est dangereux, manipuler avec précaution. </li><li> Ajouter 10 ml de grade EM stocks glutaraldéhyde, 50 ml de tampon de cacodylate de sodium 0,2 M et 2 g de saccharose et remuer avec agitateur magnétique. Ajouter 2 ml de 1,0 M CaCl 2. </li><li> Ajuster à pH 7,4 avant de procéder à la solution jusqu&#39;à 100 ml avec de l&#39;eau distillée. Le fixateur final contient 2,5% de glutaraldéhyde, 2% de paraformaldehyde, 2 mmol CaCl 2, 2% de saccharose dans du tampon 0,1 M de cacodylate. Assurez-vous que l&#39;osmolalité totale est de 440 mOsmol / L. Utiliser dans les 24 heures de préparation. </li></ol> 2. Fixation de perfusion hépatique <ol><li> Tampon de perfusion chaud et fixatif à 35-37 ºC. La température correcte du tampon de exsanguination et fixateur aide à assurer l&#39;intégrité des tissus. </li><li> Anesthésier l&#39;animal avec une seule injection intraperitoneale de 50 mg / kg de kétamine et 5 mg / kg de xylazine. </li><li> Une fois que l&#39;animal est en coursanesthésie profonde, évaluée par le retrait des membres postérieurs et pincement de la queue, une incision est faite avec Y contondants terminé ciseaux dans l&#39;abdomen de l&#39;animal pour exposer le foie et la veine porte. NOTE: Assurez-vous que le matériel est propre pour éviter la contamination des échantillons avec des micro-organismes et les débris générale qui seront facilement visibles sur SEM. </li><li> Attachez deux sutures très lâches autour de la veine porte une proximale pour le foie, l&#39;autre plus distale pour le foie. </li><li> Cathétériser la veine porte avec une canule IV de taille appropriée (18 G pour les rats, 22 G pour les souris) sutures .Tighten pour garantir canule. </li><li> Commencer la perfusion avec une solution saline tamponnée au phosphate chauffé à 37 ° C, et sous une pression de 10 cm de H 2 0. Entre 5 et 20 ml de PBS sont habituellement exigés pour être exsangue le foie. REMARQUE: Ne pas permettre à des bulles d&#39;air d&#39;entrer dans le foie par les tubes reliés à la canule car ils induisent des artéfacts secondaires pour embolisation et de la pression; Dommages aux hépatocytes, sinusoids et fenestrations LSEC produit si la pression de perfusion est trop élevé. </li><li> Sectionner la veine cave abdominale et thoracique pour permettre au tampon pour sortir librement du foie. Ceci empêche des dommages haute-pression à LSECs. </li><li> Une fois que le foie est libre de sang, remplacer PBS avec EM fixateur et perfuser pendant environ 5 minutes, jusqu&#39;à ce que le foie est durci et très pâle. </li><li> Cesser la perfusion et de couper le foie fixe dans 1 - 2 mm 3 blocs à l&#39;aide d&#39;un scalpel. </li><li> Tissus post-correctif dans EM fixatif pour les 24 - 72 h à 4 ºC. NOTE: En général, underfixation provoque plus que des objets overfixation. </li><li> Changer fixateur après la période post-correctif à sodium 0,1 M tampon cacodylate pour le stockage à 4 ºC. NOTE: Les échantillons stockés de cette manière seront conservés pour une période de temps significative (jusqu&#39;à 12 mois), fixation secondaire mais en temps opportun et de l&#39;examen est recommandé pour de meilleurs résultats. </li></ol> 3. Aiguille Perfusion REMARQUE: fixation d&#39;aiguille est une variante de fixation qui implique la perfusion de fixateur injection directement dans le tissu de biopsie du foie. L&#39;objectif est de fixateur pour être rincée à travers les vaisseaux sanguins afin de les exposer toutes être exsangue et du bloc de tissu de fixateur. Des précautions doivent être prises pour maintenir la pression d&#39;injection faible pour éviter les blessures de pression 18,19. <ol><li> Retirer un petit morceau de foie de l&#39;animal ou de l&#39;objet et rincer dans une solution saline pour éliminer le sang et les débris. </li><li> Dessiner la solution saline normale dans la seringue munie d&#39;une aiguille de petit calibre (typiquement une seringue d&#39;insuline). </li><li> Injecter la solution saline très lentement dans le foie jusqu&#39;à ce que le sang est évacuée du tissu. Des injections multiples peuvent être nécessaires. </li><li> Dessinez le fixateur EM dans une autre seringue munie d&#39;une aiguille de petit calibre (typiquement une seringue d&#39;insuline). </li><li> Injecter le fixateur très lentement dans le foie jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne dur et de couleur beige. Injection multiples peut être nécessaire. </li><li> Couper le foie fixe dans 1 - 2 mm 3 blocs en utilisant un scalpel. Incuber dans EM fixatif pour les 24 - 72 h à 4 ° C. Laver 3 fois dans du tampon cacodylate de sodium 0,1 M avant le début de la fixation secondaire. </li></ol> 4. Préparation de la microscopie électronique à balayage <ol><li> Laver échantillon 3 fois dans du tampon cacodylate de sodium 0,1 M. Pour fixer les lipides, après fixer l&#39;échantillon dans 2% de tétroxyde d&#39;osmium dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 M pendant 2 heures. NOTE: Complete lavage est très important que croix glutaraldéhyde et tétroxyde d&#39;osmium réagissent et génèrent des artefacts sur SEM. </li><li> Rincer les échantillons à des concentrations croissantes d&#39;éthanol, à commencer la déshydratation. Rincer d&#39;abord dans de l&#39;éthanol à 50% pendant 5 minutes; puis 3 fois pendant 5 min avec 70% d&#39;éthanol; rinçage trois fois pendant 5 min avec 90% d&#39;éthanol; rincer deux fois pendant 5 min dans 100% d&#39;éthanol; et enfin rincer deux fois pendant 10 minutes dans 100% d&#39;éthanol (tamis moléculaire). </li><li> Retirez tout l&#39;éthanol à partir des échantillons<html> et le remplacer par de l&#39;hexaméthyldisilazane (HMDS) en hotte et laisser reposer 10 min. Retirer HMDS à partir des échantillons de tissu et laisser évaporer. NOTE: HMDS est fortement hygroscopique froid donc permettre d&#39;atteindre RT avant de l&#39;utiliser pour l&#39;étape finale de déshydratation. </li><li> Eventuellement, monter immédiatement les échantillons ou les placer dans un dessiccateur jusqu&#39;au moment de monter pour la SEM. </li></ol> 5. Montage NOTE: montage correct de l&#39;échantillon sera de maximiser le nombre de sinusoïdes clairement délimitées disponibles pour l&#39;analyse sous SEM. <ol><li> Étiqueter la base des moignons métalliques SEM et appliquer du ruban double face conductrice carbone haut de la moignons. </li><li> Visualiser les échantillons en utilisant un microscope à dissection pour déterminer la surface avec les meilleurs pour les sinusoïdes SEM ultérieure. Placer cette surface vers le haut sur la surface du ruban de carbone du moignon. </li><li> spécimens de tenir fermement le talon, les échantillons sont maintenant prêts pour revêtement par pulvérisation. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Revêtement NOTE: Le revêtement des spécimen avec une fine pellicule de métal conducteur (or ou de platine) dans un Pulvérisateur cathodique motifs de l&#39;échantillon et le protège des dommages causés par le faisceau d&#39;électrons. Si le revêtement est trop épais structures d&#39;intérêt peuvent être obscurcies. <ol><li> La place talons dans la chambre à vide de pulvérisation coucheuse automatique amende, le mode à la rotation et de revêtement par pulvérisation automatique fixés pour 45 sec. Utilisation revêtement de platine pour des détails plus fins, mais l&#39;or est également approprié. </li><li> Appliquez une fine couche de peinture de carbone sur les surfaces extérieures des échantillons de foie montés, en prenant soin de ne pas revêtir les surfaces sinusoïdales. </li><li> Une fois que les échantillons sont revêtus avec du platine et de la peinture de carbone a séché ce qu&#39;ils soient prêts pour l&#39;observation sur le SEM. Les échantillons peuvent être stockés dans un dessiccateur. </li></ol> 7. Utilisation du microscope électronique à balayage <ol><li> Placer les échantillons dans un microscope électronique à balayage et retrouver le microscope à vide. &lt;/ Li&gt; <li> En utilisant des procédures d&#39;exploitation de microscope standard pour la visualisation des spécimens en commençant à un faible grossissement, en augmentant progressivement grossissement. </li><li> Vérifiez que le microscope est ajusté de façon appropriée pour travailler la distance, la taille du spot et l&#39;astigmatisme. </li><li> Vérifier l&#39;intégrité de fixation. Si le LSEC est surtout exempt de lacunes et contient fenestrations de mesure de 30 à 250 nm de diamètre ce indiquerait généralement que la préparation des échantillons a été couronnée de succès. </li><li> Si les sinusoïdes sont pleines de lacunes ou dépourvu de fenestrations la préparation de l&#39;échantillon n&#39;a pas été couronnée de succès ou il ya pathologie importante. Dans ce cas, couper l&#39;échantillon avec une lame de rasoir très fine, et les surfaces de coupe retraitées comme et analysés pour sinusoïdes fixes succès. </li><li> À environ 15.000-20.000 grossissement sélectionner surfaces LSEC plats qui sont exempts de débris avec une bonne fixation et où les fenestrations sont clairement visibles (typiquement contenant au moins 10 fenestrations). </li><li> Enregistrer des images d&#39;au moins 10 sinusoïdes par le foie, à partir de différentes zones des blocs, en utilisant au moins deux blocs par le foie. Échantillonnage 10 micrographies à 15.000 - 20.000 grossissement par animal est généralement suffisante pour la quantification des fenestrations soit représentatif de l&#39;ensemble du foie. </li></ol> 8. Analyse REMARQUE: Le logiciel ImageJ qui peut être téléchargé gratuitement à partir du NIH est utilisé pour quantifier le diamètre de la fenestration et la fréquence ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij">www.imagej.nih.gov/ij</a> ). <ol><li> Ouvrir une image J et définir l&#39;échelle en utilisant la barre d&#39;échelle intégrée dans l&#39;image (Capture d&#39;écran 1). </li><li> Utilisation de l&#39;outil de polygone dans ImageJ, trace autour de l&#39;ensemble de la surface plane de la LSEC y compris les zones fenêtrées et défenestré. Ne vous contentez pas de retracer les plaques de tamis comme cela faussement gonfler porosité. Éliminer les gros morceaux de débris qui se trouvent sur la surface des cellules qui peuvent être obscurifenestrations Ng. </li><li> Pour mesurer le diamètre de la fenestration, tracer une ligne à travers le plus grand diamètre de chaque fenestration en sélectionnant l&#39;outil de ligne, et appuyez sur &quot;m&quot; pour mesurer la ligne, et &quot;d&quot; (tirer) pour dessiner la ligne de façon permanente sur l&#39;image. Cette ligne est définie comme le diamètre de la fenestration. La longueur de la ligne sera désormais disponible dans la zone de résultats de ImageJ (Capture d&#39;écran 2). </li><li> Mesurer toutes les lacunes qui sont plus grands trous dans le cytoplasme LSEC plus de 250 nm, ainsi que des fenestrations. Les lacunes sont souvent objets reflétant une mauvaise perfusion ou la fixation, cependant lacunes peuvent également survenir à la suite de la maladie et la toxicité. Les données pour les lacunes sera exclu du calcul des paramètres de fenêtrage plus tard dans l&#39;analyse. </li><li> La zone des lacunes qui ne sont pas circulaire devrait être calculée en traçant autour des lacunes et calculer leur surface sur ImageJ. </li><li> Collez les données de la boîte de résultats dans ImageJ dans un tableur Excel pour furtheanalyse de r. </li></ol> 9. Calculs <ol><li> Fenestration diamètre moyen = moyenne de tous les diamètres de fenêtrage (non compris les lacunes, dont les lacunes sont ≥ 250 nm). </li><li> Zone de fenêtrage = πr 2 où r, le rayon, est calculée à partir de l&#39;individu fenestrations diamètre (r = d / 2), à l&#39;exclusion des lacunes. </li><li> Porosité (%) = (Σ (πr 2) / superficie totale analysée - Σ (zone de lacunes =)) (pm 2)) x 100. </li><li> Fenestration fréquence = nombre total de fenestrations / (superficie totale analysée-Σ (domaine de lacunes) (pm 2). </li></ol> 10. Présentation des données Fenestration NOTE: Chaque fois que possible, des publications, y compris la quantification des données de fenêtrage doivent inclure les informations suivantes <ol><li> Fenestration diamètre, avec une déclaration confirmant ce diamètres limites où utilisé pour définir fenestrations (typiquemententre 50 à 250 nm), la fréquence Fenestration (nombre / um 2) et la porosité (%). </li><li> Une déclaration confirmant que des lacunes ont été inclus dans l&#39;analyse, la distribution de fréquence graphique de diamètre de la fenestration et le nombre de foies, des blocs, des images et des fenestrations devrait être inclus dans l&#39;analyse. </li></ol>

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<li>Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+endothelial+cells+of+developing+rat+liver+in+the+transition+from+fetal+to+postnatal+life%5BTitle%5D)+AND+%22JJ+Ultrastruct+Mol+Struct+Res%22%5BJournal%5D)">Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life.</a> JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).</li>
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<li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li>
<li>Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+atomic+force+microscopy+study+on+living+skin+fibroblasts+and+liver+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).</li>
<li>Monkemoller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+fenestrations+in+liver+sinusoidal+endothelial+cells+by+optical+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy.</a> Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La capacité de mesurer de façon précise et reproductible l&#39;état du foie endothélium sinusoïdal est une étape importante dans la compréhension de la biologie de ces cellules hautement spécialisées. De nouvelles techniques telles que la microscopie d&#39;éclairage structuré 32, microscopie à force atomique 33 et d-STORM (directe stochastique optique reconstrucion Microscopy) 34 seront de communiquer des informations importantes concernant la morphologie de ces cellules in vitro,</e...

Les cellules endotheliales sinusoïdales hépatiques (LSECs) sont très différenciées des cellules endothéliales qui tapissent la paroi de la sinusoïde hépatique. LSECs sont perforées avec des fenestrations qui sont non diaphragmée, transcellulaire des pores de 50 à 250 nm de diamètre. Jusqu&#39;à 20% de la surface de LSECs est couverte par fenestrations, qui sont habituellement en groupes de quelques dizaines à quelques centaines appelés plateaux perforés 1 à 3 (figure 1). Fenestrations permettent le transfert de plasma et nanosubstrates entre le sang et les hépatocytes, la création d&#39;un système d&#39;ultrafiltration est performant. Fenestrations sont des structures dynamiques - à la fois leur taille et / ou le numéro peuvent être modifiées en réponse à différents états physiologiques, les médicaments et la maladie. Par exemple, fenestrations sont plus grandes dans le jeun que dans l&#39;état nourri 4; 2-di-iodoamphétamine augmente numéro de fenestration; 5,6 et une réduction de la taille et du nombre de fenestrations par cellule se produit au cours du vieillissement et de nombreux états pathologiques 7-13 </sup&gt;. La mesure précise de la taille et du nombre de fenestrations est important pour comprendre comment LSEC morphologie est influencé par diverses maladies, toxiques, et les états physiologiques; leur impact sur la fonction hépatique; et pour le développement de fenestration modulation des interventions thérapeutiques 1. L&#39;étude de fenestrations est difficile. Le diamètre de fenestrations est inférieure à la résolution de la microscopie optique classique, de sorte que précédemment microscopie électronique d&#39;observation en utilisant à la fois LSECs de tissus du foie ou de culture a été possible intactes. Le microscope électronique à balayage (MEB) a le plus souvent été utilisée pour étudier la taille de fenêtrage, de la fréquence et de la porosité (pourcentage de membrane LSEC qui est perforée par des fenestrations) car SEM permet l&#39;observation de vastes zones de la surface de l&#39;endothélium et la mesure des milliers, sinon des dizaines de milliers de fenestrations. Malgré son utilité, les résultats qui sont rapportés de SEM-basés pour des étudesLSEC paramètres tels que la taille de la fenestration, le nombre, la fréquence et la porosité varient largement dans la littérature (tableau 1). Fenestrations et des plaques de tamis sont des structures fragiles de ce contrat, se brisent, se dilatent ou se unissent pendant la préparation de l&#39;échantillon, le traitement ainsi minutieuse est nécessaire pour préserver leur intégrité. La pression de perfusion élevée 14; osmolarité incorrecte du fixateur et tampons 15; une mauvaise fixation ou la fixation du temps; et la vitesse de post-fixation déshydratation et séchage sont tous les domaines de la transformation des SEM qui peuvent produire des artefacts qui interfèrent avec la préservation de l&#39;ultrastructure (Figure 2). La perte de fenestrations (&#39;defenestration&#39;) et fenestration rétrécissement peut se produire à la suite d&#39;une mauvaise fixation, ce qui entraîne diamètre réduit de fenêtrage et la porosité de la cellule. Méthodes pour améliorer la conservation des spécimens pour analyse SEM ont été décrits précédemment 15-17 et seront discutésici avec des conseils supplémentaires sur la façon d&#39;améliorer la conservation de l&#39;échantillon. Les principaux objectifs de la préservation de l&#39;échantillon sont pour enlever le sang des sinusoïdes de telle sorte que la surface de la LSEC peut être visualisé et pour éviter d&#39;endommager LSEC soit de haute pression ou de la fixation retardée. Toute perfusion du foie de fixateur via la veine porte est la méthode préférée pour la fixation du foie. Comme décrit en détail ailleurs 16,18 perfusion doit être effectué à basse pression (par exemple 10 cm de H 2 0) pour éviter les artefacts et les dommages liés à la pression de perfusion à l&#39;LSEC, manifestent généralement que de grandes lacunes au sein de la membrane cellulaire. Toutefois, la fixation raisonnable peut souvent être obtenue en utilisant l&#39;aiguille de perfusion biopsies du foie provenant d&#39;humains et d&#39;animaux, comme décrit en détail par ailleurs 19. Cette technique consiste à injecter directement fixateur dans le tissu jusqu&#39;à ce que le sang est évacuée de l&#39;échantillon et le tissu est ferme et fixe. Fixation d&#39;échantillons pour la microscopie électronique doit être perfOrmed aussi rapidement que possible après l&#39;arrêt de la circulation sanguine pour éviter les changements ultrastructuraux survenant à la suite des foies des processus d&#39;autolyse extrêmement rapides. Nous présentons également une méthode d&#39;analyse d&#39;image qui réduit au minimum l&#39;inclusion d&#39;artefacts, et normalise la mesure de fenestrations. Variation dans la sélection des sinusoïdes pour microscopie, analyse d&#39;images d&#39;objets, et la mesure de la surface de la cellule pour la porosité et la fenestration fréquence ont conduit à des écarts importants dans les résultats publiés. Une approche normalisée pour l&#39;évaluation et la mesure des fenestrations et les exigences minimales pour la présentation des données ne sont pas clairement abordée dans la littérature précédemment 4,10,20-31.

<table><tbody><tr><td>25 % de glutaraldéhyde de qualité EM</td><td>ProSciTech</td><td>C001</td><td>Stocker le stock à -20 C jusqu’à ce que nécessaire, éviter de recongeler</td></tr><tr><td>Poudre de paraformaldéhyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>Préparez toujours du paraformaldéhyde poudre fraîche de</td></tr><tr><td>cacodylate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td>Préparez un stock de 0,2 M, pH 7,4 en dissolvant la poudre dans dH2O, utilisé principalement à 0,1 M en préparant une dilution 1:2</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de calcium Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>Préparez 1 M de CaCl2 en dissolvant la poudre dans du dH2O</td></tr><tr><td>Tretroxide d’osmium</td><td>ProSciTech</td><td>C011</td><td>Laver les ampoules dans un acide faible avant utilisation pour éviter toute contamination. Préparez 2 % de stock dans une bouteille en verre</td></tr><tr><td>Éthanol - Absolu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>459836&nbsp ;</td><td>L’éthanol à 100 % doit être de haute qualité et stocké avec un tamis moléculaire</td></tr><tr><td>Autres grades d’éthanol</td><td>Labtech</td><td>EL5</td><td>Préparez des éthanols classés avec dH2O</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52619&nbsp ;</td><td>Laisser atteindre la température ambiante avant utilisation</td></tr><tr><td>Canules</td><td>Terumo</td><td>TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C</td><td>18 G convient à la plupart des rats, 22 G convient à la plupart des souris, mais il est bon d’en avoir quelques 24 G sous la main en cas de très petites souris</td></tr><tr><td>Ruban de carbone conducteur</td><td>ProSciTech</td><td>IA0201</td><td></td></tr><tr><td>Peinture au carbone</td><td>ProSciTech</td><td>I003</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td></td><td></td><td>Doit être obtenu sous licence</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td></td><td></td><td>Doit être obtenu sous licence</td></tr><tr><td>Tamis moléculaire</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208647</td><td>Élimine l’eau de l’éthanol à 100 %</td></tr></tbody></table>

une méthode standardisée pour l&#39;analyse des cellules endothéliales et sinusoïdale du foie leurs fenestrations par microscopie électronique à balayage

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques sont la porte d’entrée du foie, leurs fenestrations transcellulaires permettent le transfert sans entrave de substances petites et dissoutes du sang dans le parenchyme hépatique pour le métabolisme et le traitement. Les fenêtres sont des structures dynamiques - leur taille et/ou leur nombre peuvent être modifiés en réponse à divers états physiologiques, médicaments et maladies, ce qui en fait une cible importante pour la modulation. Pour comprendre comment la morphologie de la LSEC est influencée par diverses maladies, états toxiques et physiologiques, et comment ces changements affectent la fonction hépatique, il faut mesurer avec précision la taille et le nombre de fenêtres. Dans cet article, nous décrivons les techniques de fixation et de traitement de la microscopie électronique à balayage utilisées dans notre laboratoire pour assurer une préparation reproductible des échantillons et une interprétation précise. Les méthodes comprennent la fixation par perfusion, la fixation secondaire et la déshydratation, la préparation au microscope électronique à balayage et l’analyse. Enfin, nous proposons une méthode étape par étape pour l’analyse d’images standardisée qui profitera à tous les chercheurs dans le domaine.

La visualisation initiale à faible grossissement par microscopie électronique à balayage révèle une surface plane de l&#39;échantillon de foie avec une zone exposée assez grand pour observer de nombreux grands vaisseaux du foie et des sinusoïdes (figure 1A). Assurer le placement de bloc de foie correcte sur le talon de montage est essentiel pour obtenir des images claires des sinusoïdes et la capsule de Glisson du foie devraient être évités pour cette raison (figure 1B). L&#39;augmentat...

La cellule endothéliale sinusoïdale hépatique fenêtrée est un système de filtrage biologiquement important qui est fortement influencé par diverses maladies, toxines et états physiologiques. Ces changements ont un impact significatif sur la fonction hépatique. Nous décrivons des méthodes de standardisation de la mesure de la taille et du nombre de fenêtres dans ces cellules.

Une méthode standardisée pour l&#39;analyse des cellules endothéliales et sinusoïdale du foie Leurs fenestrations par microscopie électronique à balayage

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

L'objectif général de cette procédure est d'analyser l'endothélium sinusoïdal hépatique. Cela est réalisé en isolant d'abord un foie et en le perfusant avec un fixateur. Ensuite, le foie est découpé en blocs et déshydraté en vue d'une microscopie électronique.Ensuite, les échantillons de foie sont recouverts par pulvérisation cathodique et examinés au microscope électronique. Enfin, les microphotographies électroniques sont analysées et les diamètres et fréquences des fenestrations ainsi que le pourcentage de porosité sont calculés. En définitive, la microscopie électronique est utilisée pour mettre en évidence les modifications de l'endothélium sinusoïdal hépatique dans diverses conditions.Cette méthode nous permet d'obtenir des informations sur l'ultrastructure et la morphologie des vaisseaux sanguins du foie au niveau de leur endothélium. Elle peut également être utilisée pour examiner de la même manière le rein et le cerveau. Toutes les procédures impliquant l'utilisation d'animaux sont réalisées conformément à la législation locale. Ce travail a été approuvé par le comité de bien-être animal du district sanitaire local de Sydney.Les procédures autorisées sont décrites dans la documentation de la licence du projet et suivent des directives garantissant le bien-être de l'animal en tout temps. Il s'agit d'une chirurgie non vitale. Après avoir préparé le fixateur selon le protocole indiqué, chauffer le tampon de perfusion et le fixateur à une température comprise entre 35 et 37 degrés Celsius.Une fois l'animal anesthésié par une injection intrapéritonéale unique de kétamine et de xylazine, évaluer le niveau de sédation par le retrait de la patte postérieure et une pincée de la queue. Ensuite, à l’aide de ciseaux à extrémités émoussées, pratiquer une incision en Y dans l’abdomen de l’animal afin d’exposer le foie et la veine porte. Puis placer deux ligatures très lâches autour de la veine porte, une proximale par rapport au foie et l’autre plus distale par rapport au foie.Canulez la veine porte avec un cathéter intraveineux de taille appropriée. Serrez ensuite les points de suture pour fixer le cathéter. À l’aide de cinq à 20 millilitres de PBS préchauffé à 37 degrés Celsius, commencez la perfusion à une pression de 10 centimètres de H2O.Évitez que des bulles d'air n'entrent dans le foie, car elles produiraient des artefacts et une pression d'air trop élevée, ce qui endommagerait le foie ; sectionnez la veine cave abdominale et thoracique pour permettre au tampon de s'écouler librement du foie. Cela empêche une pression rétrograde excessive, ainsi que des lésions hépatiques, des cellules sinusoidales, endothéliales ou des LCC. Une fois que le foie est débarrassé du sang, remplacez le PBS par un fixateur pour microscopie électronique ou ME, et perfusez jusqu'à ce que le foie devienne dur et très pâle.Environ cinq minutes. Ensuite, avec le scalpel, découper le foie en blocs d'un à deux millimètres cubes. Utiliser un fixateur EM pour la post-fixation.Fixez le tissu à quatre degrés Celsius pendant 24 à 72 heures. Ensuite, transférez le tissu dans un tampon au catéchol de sodium 0,1 molaire et conservez-le à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à 12 mois afin de monter les échantillons pour la microscopie électronique à balayage ou MEV. Après avoir déshydraté les échantillons conformément au protocole décrit, étiquetez la base des supports métalliques MEV et appliquez un ruban de carbone double face sur le dessus des supports sous un microscope stéréoscopique, puis observez les échantillons pour identifier la surface présentant les meilleurs sinusoides pour la MEV.Placez la dentelle, une surface choisie face vers le haut, sur la surface du ruban de carbone du porte-objet et fixez-la fermement sur celui-ci. Après avoir réalisé le revêtement par pulvérisation cathodique et la MEB conformément au protocole décrit, ouvrez une image dans ImageJ et utilisez la barre d'échelle intégrée à l'image pour définir l'échelle à l'aide de l'outil polygone. Dans ImageJ, tracez tout autour de la zone plane complète des CESP, y compris les zones fenestrées et non fenestrées, en excluant tout gros débris présent à la surface de la cellule qui pourrait masquer des fenestrations. Pour mesurer le diamètre des fenestrations, placez une ligne traversant le diamètre le plus long de chaque fenestration en utilisant l'outil ligne.Appuyez sur M pour mesurer la ligne et sur D pour dessiner définitivement la ligne sur l'image. Cette ligne est définie comme le diamètre de la fenestration et sera désormais disponible dans la boîte de résultats d'ImageJ. Mesurez tous les intervalles qui sont des trous plus larges dans le cytoplasme des LSEC de plus de 250 nanomètres, ainsi que les fenestrations. Calculez la surface des intervalles non circulaires en les délimitant au contour et en utilisant ImageJ pour calculer leur surface ; reportez ensuite les données provenant de la boîte de résultats d'ImageJ dans une feuille de calcul Excel.Pour l'analyse complémentaire, utilisez les formules suivantes pour effectuer les calculs de fenêtration. Le diamètre moyen des fenestrations est égal à la moyenne de tous les diamètres de fenestration. La surface de fenestration équivaut à pi r carré, où R est calculé à partir des diamètres individuels des fenestrations.Le pourcentage de porosité est égal à sigma pi R carré divisé par la surface totale analysée en micromètres, multiplié par 100 ; exclure de ce calcul la somme des surfaces des espaces vides. Pour présenter les données dans des publications, inclure le diamètre des fenestrations accompagné d'une phrase confirmant que les diamètres des limites ont été utilisés pour définir les fenestrations, la fréquence des fenestrations et la porosité ; inclure également une déclaration précisant si les espaces vides ont été pris en compte dans l'analyse, ainsi qu'un graphique de distribution de fréquence du diamètre des fenestrations, le nombre de blocs de foie, et des images. Une faible grossissement par MEB révèle une surface plane de l'échantillon de foie avec une zone exposée suffisamment grande pour observer de nombreux vaisseaux hépatiques et sinusoides importants, y compris le tractus porte et le centre ES, comme illustré ici.Veiller à un positionnement correct du fragment de foie sur la platine de montage est essentiel pour obtenir des images nettes des sinusoides et de la capsule brillante ; toute réflexion qui masquerait les détails des sinusoides du foie doit être évitée. Pour cette raison, comme illustré ici, un grossissement plus élevé permet d'observer les fenestrations des LSEC. Les plaques d'hépatocytes peuvent ressembler à des vaisseaux sanguins, mais des caractéristiques telles que l'ILP aident à l'orientation.Cette figure montre qu'une pression de perfusion élevée peut provoquer des artefacts tels que de grands espaces dans l'endothélium, probablement dus à la coalescence des plaques SIV des LSEC, facilement identifiables en MEB. Éviter la membrane cellulaire directement au-dessus des noyaux, qui apparaît comme une saillie sous la surface des LSEC, contribuera à améliorer la précision des calculs de densité et de porosité des fenestrations. Enfin, la quantification du diamètre, de la densité et de la fréquence des fenestrations des LSEC fournit une mesure empirique des fenestrations et permet d'évaluer les modifications induites par le vieillissement, les maladies, les toxines ou les traitements. Après la procédure de perfusion, le tissu peut être préparé pour d'autres techniques, comme la microscopie électronique en transmission, afin d'examiner l'ultrastructure cellulaire et la structure mitochondriale.Il peut également être utilisé pour l'histologie.

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JoVE Journal

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Biologie

L'étude des cellules endothéliales sinusoïdales du foie (secs) doit être effectuée avec des cellules primaires provenant de l'animal car aucune des lignées de cellules existent. Cette méthode repose sur la digestion du foie et centrifugation différentielle pour la purification de la SEC pour la culture subséquente et l'expérimentation.

Dans l&#39;endocytose hépatique in vivo suivie d&#39;une purification des cellules du foie par perfusion du foie

le recrutement de leucocytes dans le foie se produit dans les canaux spécialisés des sinusoïdes hépatiques qui sont bordées par des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques uniques. Phase microscopie en contraste de recrutement de leucocytes à travers l'endothélium sinusoïdal hépatique humaine dans des conditions de stress de cisaillement physiologique peut faciliter l'élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce processus.

Un flux Essai d&#39;adhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

Le but du présent protocole est d’obtenir la grande viabilité et à haut rendement des hépatocytes et des cellules endothéliales sinusoïdales du foie. Ceci est accompli en perfusant le foie avec une solution de collagènase de type IV via la veine porte, suivie d’une centrifugation différentielle afin d’obtenir des hépatocytes et des cellules endothéliales sinusoïdales.

Purification des hépatocytes et des cellules endothéliales sinusoïdales foie de souris Perfusion

Ce protocole vise à identifier les populations de cellules endothéliales lymphatiques dans le foie à l’aide de marqueurs décrits. Nous utilisons la collagénase IV et DNase et un hachage doux de tissu, combiné à la cytométrie en flux, afin d’identifier une population distincte de cellules endothéliales lymphatiques.

Digestion du foie murin pour une cytométrie de cellules endothéliales lymphatiques

Ici, nous présentons un protocole pour la coloration d'immunofluorescence pour observer les cellules endothéliales de l'aorte de souris directement. Cette technique est utile lors de l'étude du phénotype cellulaire et moléculaire des cellules endothéliales dans différents schémas de flux et dans le développement de l'athérosclérose.

Utilisation de la coloration en immunofluorescence pour observer directement les cellules endothéliales vasculaires

Ce protocole décrit une méthode de routine pour l’utilisation de la microscopie électronique à balayage de bloc-face série (SBF-SEM), une technique d’imagerie 3D puissante. L’application réussie de SBF-SEM s’articule sur la fixation appropriée et les techniques de souillure de tissu, aussi bien que l’examen soigneux des arrangements de formation image. Ce protocole contient des considérations pratiques pour l’ensemble de ce processus.

Microscopie électronique à balayage par blocs série (SBF-SEM) d’échantillons de tissus biologiques

Ici, nous présentons comment générer un modèle de poisson zèbre associé à la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) associé au carcinome hépatocellulaire (CHC) pour étudier l’impact du surplus de cholestérol sur le microenvironnement hépatique et le paysage des cellules immunitaires.

Analyse du microenvironnement hépatique au cours de la progression précoce du carcinome hépatocellulaire associé à la stéatose hépatique non alcoolique chez le poisson zèbre

Ici, nous décrivons et démontrons un protocole pour l’isolement des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques primaires (LSEC) de souris. Le protocole est basé sur la perfusion de collagénase hépatique, la purification des cellules non parenchymateuses par centrifugation à basse vitesse et la sélection de billes magnétiques CD146. Nous phénotypons et caractérisons également ces LSTEC isolés à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie électronique à balayage.

Isolement et caractérisation des cellules endothéliales sinusoïdales primaires du foie de souris

Le protocole actuel optimise les méthodes de perfusion/décellularisation in situ du foie et de microscopie à deux photons afin d’établir une plateforme fiable pour visualiser la dynamique du remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) au cours de la stéatohépatite non alcoolique (NASH).

Imagerie 3D de la matrice extracellulaire hépatique dans un modèle murin de stéatohépatite non alcoolique

Un protocole simple et complet pour acquérir des détails tridimensionnels des sites de contact membranaire entre les organites dans les hépatocytes du foie ou les cellules d’autres tissus.

Caractérisation tridimensionnelle des sites de contact interorganelles dans les hépatocytes à l’aide de la microscopie électronique à section série

Nous décrivons ici l’enrichissement de petites vésicules extracellulaires dérivées du tissu cancéreux du foie grâce à une méthode d’ultracentrifugation différentielle optimisée.

Procédé d’enrichissement de petites vésicules extracellulaires dérivées de tissus cancéreux du foie

Découvrez une méthode standardisée d'analyse des cellules endothéliales sinusoïdales du foie par microscopie électronique à balayage. Ce protocole permet de mesurer précisément la taille et la fréquence des fenestrations pour étudier la fonction hépatique.

Une méthode standardisée pour lanalyse des cellules endothéliales et sinusoïdale du foie Leurs fenestrations par microscopie électronique à balayage (Vidéo) | JoVE Journal

Une méthode standardisée pour l'analyse des cellules endothéliales et sinusoïdale du foie Leurs fenestrations par microscopie électronique à balayage

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