Une méthode standardisée pour l'analyse des cellules endothéliales et sinusoïdale du foie Leurs fenestrations par microscopie électronique à balayage

L’objectif global de cette procédure est d’analyser l’endothélium sinusoïdal du foie. Ceci est accompli en isolant d’abord un foie et en le perfusant avec un fixateur. Ensuite, le foie est coupé en blocs et déshydraté en préparation de la microscopie électronique.

Ensuite, les échantillons de foie sont enduits de pulvérisation et examinés au microscope électronique. Enfin, les micrographies électroniques sont analysées et le diamètre, la fréquence et le pourcentage de porosité de la fenestration sont calculés. En fin de compte, la microscopie électronique est utilisée pour montrer les changements dans l’endothélium sinusoïdal hépatique dans diverses conditions.

Cette méthode nous donne un aperçu de l’ultrastructure et de la morphologie des vaisseaux sanguins du foie dans leur endothélium. Il peut également être utilisé pour examiner les reins et le cerveau de la même manière Toutes les procédures impliquant l’utilisation d’animaux sont effectuées conformément à la législation locale. Ce travail est approuvé par le comité local de bien-être animal du district de santé de Sydney.

Les procédures autorisées sont décrites dans la documentation de la licence de projet et suivent des directives qui garantissent le bien-être de l’animal à tout moment. Il s’agit d’une chirurgie de non-survie. Après avoir préparé le fixateur, selon le protocole textuel, réchauffez le tampon de perfusion et le fixateur à 35 à 37 degrés Celsius.

Une fois que l’animal est anesthésié par une injection intrapéritonéale unique de kétamine et de xylazine, évaluer le niveau de sédation par retrait des membres postérieurs et pincement de la queue. Ensuite, avec des ciseaux à bout émoussé, faites une incision en Y dans l’abdomen de l’animal pour exposer le foie et la veine porte. Ensuite, attachez deux sutures très lâches autour de la veine porte, l’une proximale au foie et l’autre plus distalement au foie.

Canulez la veine porte à l’aide d’une canule IV de taille appropriée. Serrez ensuite les sutures pour fixer la canule. Maintenant, en utilisant cinq à 20 millilitres de PBS chaud à 37 degrés Celsius, commencez la perfusion à une pression de 10 centimètres de H2O.

Évitez que des bulles d’air ne pénètrent dans le foie, ce qui produirait des artefacts et une pression atmosphérique trop élevée, ce qui endommagerait le foie, sectionnerait la veine abdominale et thoracique CVA pour permettre au tampon de sortir librement du foie. Cela permet d’éviter une contre-pression élevée, des dommages au foie, aux cellules sinusoïdales et endothéliales ou aux LCC. Une fois que le foie est exempt de sang, remplacez le PBS par la microscopie électronique ou em, fixatrice et perfusante jusqu’à ce que le foie soit durci et très pâle.

Environ cinq minutes. Ensuite, avec le scalpel, coupez le foie en blocs d’un à deux millimètres cubes. Utilisez em fixatif pour poster.

Fixez le mouchoir à quatre degrés Celsius pendant 24 à 72 heures. Transférez ensuite le tissu dans un tampon Cate de sodium de 0,1 molaire et conservez-le à quatre degrés Celsius jusqu’à 12 mois pour monter les échantillons pour la microscopie électronique à balayage ou MEB. Après avoir déshydraté les échantillons conformément au protocole de texte, étiquetez la base des talons MEB métalliques et appliquez du ruban de carbone double face sur le dessus des talons sous un microscope de dissection, visualisez les échantillons pour identifier la surface avec les meilleures sinusoïdes pour le MEB.

Lacet, une surface choisie vers le haut sur la surface du ruban de carbone du talon et collez-la fermement sur le talon. Après avoir effectué le revêtement par pulvérisation cathodique et le MEB conformément au protocole texte, ouvrez une image dans l’image J et utilisez une barre d’échelle intégrée dans l’image pour définir l’échelle à l’aide de l’outil polygone dans l’image J tracez autour de toute la zone plane du LSEC, y compris les zones fenêtrées et fenêtrées, excluez tous les gros débris qui se trouvent à la surface de la cellule et qui pourraient masquer les fenêtres. Pour mesurer le diamètre de la fenestration, placez une ligne à travers le diamètre le plus long de chaque fenestration en sélectionnant l’outil de ligne.

Appuyez sur M pour mesurer la ligne et sur D pour tracer définitivement la ligne sur l’image. Cette ligne est définie comme le diamètre de la fenêtre et sera maintenant disponible dans la boîte de résultats de l’image J.Mesurez tous les espaces qui sont des trous plus grands dans le cytoplasme LSEC de plus de 250 nanomètres, ainsi que les fenêtres. Calculez l’aire des espaces qui ne sont pas circulaires en traçant autour d’eux et en utilisant l’image J pour calculer leur aire au-delà des données de la boîte de résultats de l’image J dans une feuille de calcul Excel.

Pour une analyse plus approfondie, utilisez les formules suivantes pour effectuer les calculs de fenestration. Le diamètre moyen de la fenestration est égal à la moyenne de tous les diamètres de la fenestration. La surface de fenestration est égale à pi r au carré où R est calculé à partir des diamètres de fenestration individuels.

Le pourcentage de porosité est égal à sigma pi R au carré sur la surface totale analysée et les microns multipliés par 100 excluent la somme des surfaces des écarts de ce calcul. Pour présenter les données dans les publications, incluez le diamètre de la fenestration avec une déclaration confirmant que les diamètres limites ont été utilisés pour définir les fenestrations, la fréquence et la porosité de la fenestration, incluez également une déclaration confirmant si des lacunes ont été incluses dans l’analyse, et un graphique de distribution de fréquence du diamètre de la fenestration et le nombre de blocs de foie, ainsi que des images. Un faible grossissement par MEB révèle une surface plane de l’échantillon de foie avec une zone exposée suffisamment grande pour observer de nombreux gros vaisseaux hépatiques et sinusoïdes, y compris le tractus porte et l’ES central, comme illustré ici.

Il est essentiel d’assurer le placement correct du bloc hépatique sur le talon de montage pour obtenir des images claires des sinusoïdes et la capsule glistens, qui couvre tous les détails des sinusoïdes du foie, doit être évitée. Pour cette raison, comme le montre ici, un grossissement plus élevé permet l’observation des fenêtres LSEC. Les plaques d’hépatocytes peuvent ressembler à des vaisseaux sanguins, mais des caractéristiques telles que le BLI aident à l’orientation.

Cette figure démontre qu’une pression de profusion élevée peut provoquer des artefacts tels que de grands espaces dans l’endothélium que l’on pense être causés par la coalescence des plaques SIV LSEC qui sont facilement identifiables sous SEM, en évitant la membrane cellulaire directement au-dessus des noyaux, qui peut être vu comme un renflement sous la surface du LSEC aidera à la précision des calculs de densité et de porosité de fenestration. Enfin, la quantification du diamètre, de la densité et de la fréquence des fenêtres LSEC fournit une mesure empirique des fenestrations et permet de mesurer les changements induits par le vieillissement, les maladies, les toxines ou les thérapies. Après la procédure de perfusion, le tissu peut être traité pour d’autres techniques telles que la microscopie électronique à transmission pour examiner l’ultrastructure cellulaire, la structure mitochondriale.

Il peut également être utilisé pour l’histologie.