Une méthode standardisée pour l'analyse des cellules endothéliales et sinusoïdale du foie Leurs fenestrations par microscopie électronique à balayage

L'objectif général de cette procédure est d'analyser l'endothélium sinusoïdal hépatique. Cela est réalisé en isolant d'abord un foie et en le perfusant avec un fixateur. Ensuite, le foie est découpé en blocs et déshydraté en vue d'une microscopie électronique.

Ensuite, les échantillons de foie sont recouverts par pulvérisation cathodique et examinés au microscope électronique. Enfin, les microphotographies électroniques sont analysées et les diamètres et fréquences des fenestrations ainsi que le pourcentage de porosité sont calculés. En définitive, la microscopie électronique est utilisée pour mettre en évidence les modifications de l'endothélium sinusoïdal hépatique dans diverses conditions.

Cette méthode nous permet d'obtenir des informations sur l'ultrastructure et la morphologie des vaisseaux sanguins du foie au niveau de leur endothélium. Elle peut également être utilisée pour examiner de la même manière le rein et le cerveau. Toutes les procédures impliquant l'utilisation d'animaux sont réalisées conformément à la législation locale. Ce travail a été approuvé par le comité de bien-être animal du district sanitaire local de Sydney.

Les procédures autorisées sont décrites dans la documentation de la licence du projet et suivent des directives garantissant le bien-être de l'animal en tout temps. Il s'agit d'une chirurgie non vitale. Après avoir préparé le fixateur selon le protocole indiqué, chauffer le tampon de perfusion et le fixateur à une température comprise entre 35 et 37 degrés Celsius.

Une fois l'animal anesthésié par une injection intrapéritonéale unique de kétamine et de xylazine, évaluer le niveau de sédation par le retrait de la patte postérieure et une pincée de la queue. Ensuite, à l’aide de ciseaux à extrémités émoussées, pratiquer une incision en Y dans l’abdomen de l’animal afin d’exposer le foie et la veine porte. Puis placer deux ligatures très lâches autour de la veine porte, une proximale par rapport au foie et l’autre plus distale par rapport au foie.

Canulez la veine porte avec un cathéter intraveineux de taille appropriée. Serrez ensuite les points de suture pour fixer le cathéter. À l’aide de cinq à 20 millilitres de PBS préchauffé à 37 degrés Celsius, commencez la perfusion à une pression de 10 centimètres de H2O.

Évitez que des bulles d'air n'entrent dans le foie, car elles produiraient des artefacts et une pression d'air trop élevée, ce qui endommagerait le foie ; sectionnez la veine cave abdominale et thoracique pour permettre au tampon de s'écouler librement du foie. Cela empêche une pression rétrograde excessive, ainsi que des lésions hépatiques, des cellules sinusoidales, endothéliales ou des LCC. Une fois que le foie est débarrassé du sang, remplacez le PBS par un fixateur pour microscopie électronique ou ME, et perfusez jusqu'à ce que le foie devienne dur et très pâle.

Environ cinq minutes. Ensuite, avec le scalpel, découper le foie en blocs d'un à deux millimètres cubes. Utiliser un fixateur EM pour la post-fixation.

Fixez le tissu à quatre degrés Celsius pendant 24 à 72 heures. Ensuite, transférez le tissu dans un tampon au catéchol de sodium 0,1 molaire et conservez-le à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à 12 mois afin de monter les échantillons pour la microscopie électronique à balayage ou MEV. Après avoir déshydraté les échantillons conformément au protocole décrit, étiquetez la base des supports métalliques MEV et appliquez un ruban de carbone double face sur le dessus des supports sous un microscope stéréoscopique, puis observez les échantillons pour identifier la surface présentant les meilleurs sinusoides pour la MEV.

Placez la dentelle, une surface choisie face vers le haut, sur la surface du ruban de carbone du porte-objet et fixez-la fermement sur celui-ci. Après avoir réalisé le revêtement par pulvérisation cathodique et la MEB conformément au protocole décrit, ouvrez une image dans ImageJ et utilisez la barre d'échelle intégrée à l'image pour définir l'échelle à l'aide de l'outil polygone. Dans ImageJ, tracez tout autour de la zone plane complète des CESP, y compris les zones fenestrées et non fenestrées, en excluant tout gros débris présent à la surface de la cellule qui pourrait masquer des fenestrations. Pour mesurer le diamètre des fenestrations, placez une ligne traversant le diamètre le plus long de chaque fenestration en utilisant l'outil ligne.

Appuyez sur M pour mesurer la ligne et sur D pour dessiner définitivement la ligne sur l'image. Cette ligne est définie comme le diamètre de la fenestration et sera désormais disponible dans la boîte de résultats d'ImageJ. Mesurez tous les intervalles qui sont des trous plus larges dans le cytoplasme des LSEC de plus de 250 nanomètres, ainsi que les fenestrations. Calculez la surface des intervalles non circulaires en les délimitant au contour et en utilisant ImageJ pour calculer leur surface ; reportez ensuite les données provenant de la boîte de résultats d'ImageJ dans une feuille de calcul Excel.

Pour l'analyse complémentaire, utilisez les formules suivantes pour effectuer les calculs de fenêtration. Le diamètre moyen des fenestrations est égal à la moyenne de tous les diamètres de fenestration. La surface de fenestration équivaut à pi r carré, où R est calculé à partir des diamètres individuels des fenestrations.

Le pourcentage de porosité est égal à sigma pi R carré divisé par la surface totale analysée en micromètres, multiplié par 100 ; exclure de ce calcul la somme des surfaces des espaces vides. Pour présenter les données dans des publications, inclure le diamètre des fenestrations accompagné d'une phrase confirmant que les diamètres des limites ont été utilisés pour définir les fenestrations, la fréquence des fenestrations et la porosité ; inclure également une déclaration précisant si les espaces vides ont été pris en compte dans l'analyse, ainsi qu'un graphique de distribution de fréquence du diamètre des fenestrations, le nombre de blocs de foie, et des images. Une faible grossissement par MEB révèle une surface plane de l'échantillon de foie avec une zone exposée suffisamment grande pour observer de nombreux vaisseaux hépatiques et sinusoides importants, y compris le tractus porte et le centre ES, comme illustré ici.

Veiller à un positionnement correct du fragment de foie sur la platine de montage est essentiel pour obtenir des images nettes des sinusoides et de la capsule brillante ; toute réflexion qui masquerait les détails des sinusoides du foie doit être évitée. Pour cette raison, comme illustré ici, un grossissement plus élevé permet d'observer les fenestrations des LSEC. Les plaques d'hépatocytes peuvent ressembler à des vaisseaux sanguins, mais des caractéristiques telles que l'ILP aident à l'orientation.

Cette figure montre qu'une pression de perfusion élevée peut provoquer des artefacts tels que de grands espaces dans l'endothélium, probablement dus à la coalescence des plaques SIV des LSEC, facilement identifiables en MEB. Éviter la membrane cellulaire directement au-dessus des noyaux, qui apparaît comme une saillie sous la surface des LSEC, contribuera à améliorer la précision des calculs de densité et de porosité des fenestrations. Enfin, la quantification du diamètre, de la densité et de la fréquence des fenestrations des LSEC fournit une mesure empirique des fenestrations et permet d'évaluer les modifications induites par le vieillissement, les maladies, les toxines ou les traitements. Après la procédure de perfusion, le tissu peut être préparé pour d'autres techniques, comme la microscopie électronique en transmission, afin d'examiner l'ultrastructure cellulaire et la structure mitochondriale.

Il peut également être utilisé pour l'histologie.