Exécution personnalisée expériences de micropuces MicroRNA

L’objectif général de cette procédure est d’effectuer une expérience de micro-réseau d’ARN. Pour ce faire, il faut d’abord acquérir des lames de microréseaux imprimées contenant une bibliothèque de sondes de micro-ARN et préparer des échantillons d’ARN de qualité et de quantité appropriées. Ensuite, l’échantillon d’ARN et d’ADN contrôlé A est marqué avec des colorants fluorescents.

Ensuite, les acides nucléiques marqués sont ajoutés à une lame de microréseau pour l’hybridation. Enfin, la lame de la puce est lavée et scannée et la lame est régénérée. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent l’expression des microARN à l’échelle du génome grâce à l’analyse de la lame pour les intensités d’hybridation des sondes individuelles de microARN.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’expression génique, telles que la façon dont les conditions physiologiques normales ou les conditions pathologiques différentielles affectent l’expression des besoins microscopiques à l’échelle mondiale. La qualité de la fabrication des microréseaux est l’un des facteurs les plus critiques pour le succès d’une expérience de microréseaux. Après avoir isolé l’ARN à l’aide d’une méthode qui préserve les petits ARN et l’avoir suspendu à une concentration égale ou supérieure à deux milligrammes par millilitre, marquez l’ARN dans un volume de réaction de 20 microlitres en mélangeant d’abord environ 25 microgrammes d’ARN total avec 0,5 microgramme de cinq premiers P-C-U-D-Y 5 4 7 3 premiers dans un tampon X HEPS complété par T quatre ARN Ligase 1D TT, et un TP. S’il y a moins d’ARN disponible, réduisez la quantité d’ARN et la réaction.

Si l’ARN est très dilué, ajoutez un support tel que la levure, l’ARNt pour aider à la précipitation, incubez la réaction sur de la glace à l’intérieur d’un réfrigérateur pendant deux à 24 heures. Ensuite, ajoutez de l’acétate de sodium à 0,3 molaire, puis trois volumes d’éthanol et précipitez l’ARN pendant la nuit à moins 20 degrés Celsius. Pour utiliser les lames pour la première fois, pré-hybridez-les dans une solution filtrée de trois XSSC, 0,1 % SDS et 0,2 % BSA pendant 30 à 60 minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, immergez les toboggans dans l’eau à quelques reprises. Ensuite, dans l’isopropanol, séchez les lames à l’aide d’une centrifugeuse avec un adaptateur de lame à 100 fois G pendant cinq minutes à 22 degrés Celsius. Rincez les bandes de levage à l’eau.

Puis dans l’éthanol avant de sécher à l’air, placez une lame à l’intérieur d’une base de chambre d’hybridation de microarray et une lamelle de levage sur le dessus de la lame de sorte que la lamelle de levage recouvre la zone de la sonde et ses bandes blanches. Contactez la lame dans l’obscurité, faites tourner l’ARN marqué précipité, lavez-le une fois avec de l’éthanol à 70 % et séchez la pastille à l’air. La pastille doit être de couleur rougeâtre.

Préparez une solution d’hybridation en utilisant un 15e à un 100e en volume de l’ADN de référence marqué purifié par échantillon d’ARN Dissoudre complètement la pastille d’ARN avec environ 60 microlitres de la solution d’hybridation pour s’assurer que la solution d’hybridation ne se dessèche pas. Pendant l’incubation, ajoutez 20 microlitres d’eau dans chacun des puits d’humidification. Dans la base de la chambre d’hybridation de microarray.

Ajoutez un mélange d’ARN marqué et d’ADN de référence à la lame. À l’aide d’une pointe de pipette fine, touchez doucement le bord de la glissière de l’élévateur et par aspiration. Laissez la solution pénétrer dans l’espace entre le glissement et le glissement de l’élévateur.

Placez le couvercle de la chambre d’hybridation sur la base. Scellez ensuite la chambre avec des clips métalliques. Mettez toute la chambre à l’intérieur du sac en plastique fourni avec la cassette de la chambre.

Enfin, placez la cassette de chambre dans un récipient avec une serviette en papier humide. Ensuite, couvrez le récipient d’une pellicule plastique et placez-le dans un incubateur de culture cellulaire humide à 37 degrés Celsius pendant environ 24 heures. Pour traiter les lames après hybridation, démontez les cassettes de la chambre une par une, immergez une diapositive et sa lame de levage en deux XSSC à 22 degrés Celsius.

La lamelle de levage tombera naturellement de la glissière, lavera les diapositives en 0,8 XSSC deux fois, puis trois fois en 0,4 XSSC pendant un total d’une à deux minutes. Séchez les lames à l’aide d’une centrifugeuse munie d’un adaptateur de lame. Ensuite, numérisez les lames à l’aide d’un scanner à microréseaux et utilisez un programme tel que blue fuse pour quantifier les intensités des fichiers d’image.

Inspectez les points individuels pour exclure les points anormaux qui résultent généralement de l’impression ou de la manipulation des lames après l’hybridation. Pour l’analyse et la présentation des données, utilisez des programmes tels que gene springing et excel pour réutiliser la puce à puce. Décapage la lame en la rinçant à l’eau, puis en l’immergeant dans un plat de coloration d’un millimolaire de NAOH et de 0,1 XSSC à 62 degrés Celsius pendant 10 à 20 minutes.

Répétez l’incubation une deuxième fois. Lavez les lames plusieurs fois dans l’eau pendant 60 minutes maximum en les secouant doucement à 22 degrés Celsius. Séchez les lames à l’aide d’une centrifugeuse et conservez-les à 22 degrés Celsius.

Les lames peuvent être utilisées sans pré-hybridation. Cette figure montre une image scannée d’une puce à ADN montrant des signaux d’hybridation très précis et forts. Les taches rouges résultaient de l’hybridation de l’ADN de référence, les taches vertes de l’échantillon d’ARN marqué DY 5 47, et les taches jaunes provenaient de l’hybridation de l’ADN et de l’ARN vers les mêmes sondes.

Les coefficients de corrélation de Pearson entre les répétitions techniques de l’hybridation de microréseaux sont d’environ 0,99, ce qui indique une excellente reproductibilité. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une expérience personnalisée sur les microrayons, non seulement pour quantifier la micronase, mais aussi pour quantifier d’autres types d’acides nucléiques tels que les ARNm.