Name: Profilage de la pré-micro ARNs et micro-ARN en utilisant quantitative PCR en temps réel (qPCR) Arrays (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Découvrez la configuration automatisée de réseaux qPCR pour le profilage de pré-microARNs et microARNs. Cette méthode permet une préparation rapide et fiable des échantillons pour l'analyse d'expression génique.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH DE018304, R01DE018281. KT est soutenu par T32 GM07092-34 et par une subvention à l&#39;Université de Caroline du Nord à Chapel Hill de Howard Hughes Medical Institute (HHMI) à travers la Méditerranée en Grad Initiative. PC T32 est soutenu par CA009156.

Les tableaux qPCR profilage pré-miARN peuvent être mis en place comme entièrement automatisée avec un robot Tecan Freedom EVO (A) ou à la main avec la pipette multicanaux matrice électronique (B). 1) Préparer le mélange maître, plaques apprêt et échantillons. <ol><li> Plaques amorce contenant 186 paires d'amorces au format 96 puits (un total de 2 plaques) à 12h05 doit être stocké à -80 ° C. Plaques décongeler à température ambiante, vortex et centrifuger brièvement avant utilisation. </li><li> Pour préparer le mélange maître, dégeler SYBR Green PCR 2x Mélanger à température ambiante. Chaque réaction utilise master mix 8ul avec un apprêt 2UL. La composition du mélange maître par réaction est un mélange SYBR 4UL, l'eau de qualité 3UL PCR et 10-20 ng d'échantillon d'ADN ou d'ADNc. </li><li> Pour la configuration de chaque plaque d'amorce de 96 puits, quatre tubes master mix sera nécessaire. Les échantillons peuvent être exécutés 4 échantillons par plaque (singlicate), 2 échantillons par plaque (double) ou d'un seul échantillon en quatre exemplaires. </li><li> Préparer le mélange maître en combinant SYBR, l'eau et l'échantillon dans chacun des tubes Eppendorf 4-2ml. Chaque tube doit contenir master mix assez pour environ 100 réactions, permettant l'excès pour le pipetage des déchets. Vortex pour mélanger. </li></ol> Configuration A. de dosage pré-miARN utilisant la Liberté Tecan Evo robot. <ol><li> Après l'initialisation du robot et le chargement du programme EVOware, rincer trois fois avec chaque 30ml pour effacer le système de bulles d'air qui va interférer avec la précision de pipetage. </li><li> Configuration de la plateforme de robot pour y inclure les éléments suivants: <ul><li> Étiqueté 384 puits </li><li> Plaque de 96 puits d'amorces (1) </li><li> Maître mêle </li><li> Un bac contenant de l'eau de Javel à 2% </li><li> Un récipient rempli de liquide du système </li><li> Conteneur à déchets vide </li></ul></li><li> Commencez courir robot automatisé en sélectionnant "Exécuter" deux fois. </li><li> À la fin du programme, retirez la plaque de 384 puits et sceller avec une feuille d'étanchéité LightCycler 480 et centrifuger brièvement. Placez scellées plaque de 384 puits dans la position 1 de l'hôtel. </li><li> Passez à l'étape 2.2 et répéter pour 2 plaque d'amorce avec des mélanges nouveau maître et une nouvelle plaque de 384 puits. <ol><li> Placer la plaque scellée en position 2 de l'hôtel. </li></ol></li><li> Ouvrez nouveau programme EVOware pour le chargement des Lightcycler de l'hôtel et sélectionner "Exécuter" deux fois. <ol><li> Freedom EVO se charge automatiquement chaque plaque dans le LightCycler et exécutez la commande suivante SYBR-vert I / GRH programme de cyclisme: Pré (1 cycle): 50 ° pendant 5 minutes à vitesse de rampe de 4,8 ° / sec 95 ° pendant 5 minutes à vitesse de rampe de 4,8 ° / sec Amp (45 cycles): 95 ° pendant 15 secondes au taux de rampe de 4,8 ° / sec 62 ° pendant 30 sec à vitesse de rampe de 2,5 ° / sec (Simple d'acquisition de données au cours de cette étape) Courbe de fusion: 95 ° pendant 5 sec à vitesse de rampe de 4,8 ° / sec 60 ° pendant 1 minute à taux de rampe de 2,5 ° / sec 95 ° en continu au taux de rampe de 0,11 ° / sec avec 5 acquisitions par ° C Cool: 50 ° pendant 30 sec à vitesse de rampe de 25 ° / sec </li></ol></li></ol> Installation de dosage B. miARN pré-utilisation de la pipette multicanaux matrice électronique: <ol><li> Placez le contenu du tube master mix 1 dans un réservoir. </li><li> Régler la pipette pour aspirer électroniques 16ul de mélange maître avec 2-8ul passer les étapes suivies par une étape de purge. </li><li> Pour Mix Master 1, passer dans chaque 8ul bien d'autres de la plaque de 384 puits (réglé sur 384 et l'espacement pointe), en commençant par le puits A1. (Ie puits A1, C1, E1, etc) Pour la seconde 8ul passer, passer à la colonne 3 (ie puits A3, C3, E3, etc) puis purger au cours d'un conteneur de déchets et des conseils céder. </li><li> Suivez ce modèle pour les 5 autres cycles jusqu'à atteindre ainsi A23. </li><li> Répétez l'opération pour Mix Master 2, (à commencer par godet A2, C2, E2, etc); master mix 3 (à partir de puits B1, D1, F1, etc); master mix 4 (à partir de B2, D2, F2, etc .). </li><li> Pour aliquotting de plaque d'amorce, mettre une pipette pour aspirer 2UL électroniques et dispenser 2UL avec une étape de purge suivante. Distribuer 2UL d'amorces de la colonne 1 de la plaque de 96 puits d'amorces (AH) dans la plaque de 384 puits, puits A1, C1, E1, etc purge sur un conteneur à déchets et des conseils céder. Répétez l'opération pour puits A2, C2, E2, B1, D1, F1, et B2, D2, F2, etc </li><li> Répétez l'opération pour les lignes 2-12 du amorces de 96 puits, se déplaçant sur tous les 2 colonnes pour chaque colonne d'apprêt, jusqu'à plein 384 puits ont été aliquotes. </li><li> Sceau plaques avec un film d'étanchéité LightCycler et centrifuger brièvement. </li><li> Plaques Placer dans un LightCycler 480 et le cycle des plaques en fonction des paramètres suivants en utilisant le SYBR Green I / format de détection de la GRH: Pré (1 cycle): 50 ° pendant 5 minutes à vitesse de rampe de 4,8 ° / sec 95 ° pendant 5 minutes à vitesse de rampe de 4,8 ° / sec Amp (45 cycles): 95 ° pendant 15 secondes au taux de rampede 4,8 ° / sec 62 ° pendant 30 sec à vitesse de rampe de 2,5 ° / sec (Simple d'acquisition de données au cours de cette étape) Courbe de fusion: 95 ° pendant 5 sec à vitesse de rampe de 4,8 ° / sec 60 ° pendant 1 minute à taux de rampe de 2,5 ° / sec 95 ° en continu au taux de rampe de 0,11 ° / sec avec 5 acquisitions par ° C Cool: 50 ° pendant 30 sec à vitesse de rampe de 25 ° / sec </li><li> Répétez l'aide de 2 plaque d'amorce, aliquotting dans une plaque fraîche de 384 puits en utilisant des mélanges maîtres fraîchement préparés. </li></ol> Secrets de la réussite: Une caractéristique importante lors de la conception des tableaux de PCR est que tous les 186 paires d'amorces ont la même température de recuit, donc la plaque peut être exécuté avec les mêmes paramètres de PCR optimales programme exécuté. Chaque nouveau tableau doit être vérifiée en utilisant trois contrôles avant les échantillons. Ces contrôles sont: 1 piste de toutes les amorces fonctionner avec de l'eau ou 0,1 x TE d'exclure la contamination primaire. 1 piste de l'alternance eau / TE et de contrôle positif, afin de s'assurer qu'aucun report. 3 pistes en utilisant le même contrôle positif, afin d'assurer la reproductibilité entre les courses. Master Mix doit être fraîchement préparée, et les plaques doivent être exécutés dans les 24 heures pour des résultats optimaux Feuille plaque d'amorce doit être retiré lentement pour réduire le risque de contamination entre les puits. Lors de l'utilisation d'un robot avec des conseils fixes, laver l'eau de Javel à 2% est nécessaire de laver les bouts entre chaque étape de pipetage, suivie d'un rinçage à l'eau. Cela évite et élimine le report, ce qui pourrait contaminer les autres données et conduire à des résultats concluants. Après une plaque est géré par le LightCycler, il ne devrait pas être ouverte à nouveau dans la salle de configuration PCR. Cela permet d'éviter la contamination PCR. Les résultats représentatifs: résultats de qPCR sont généralement représentés par des valeurs de CT tel que déterminé par le logiciel d'analyse LightCycler. Une course réussie se compose généralement d'une gamme de TC pour les échantillons, généralement entre 20 à 35 pour les échantillons qui sont positifs. Les échantillons d'eau dans une bonne course sont toujours à un CT&gt; 40 et tous les échantillons ou de puits spécifique avec un CT de plus de 37 sont considérés comme négatifs ou non détecté. En règle générale, les échantillons donnant une CT de &lt;10 sont également peu fiables et sont exclus de l'analyse. Il ya plusieurs façons d'analyser les données qPCR et l'inclusion de contrôles internes dans notre test permet de contrôler les variations de l'entrée de l'échantillon. Le tableau pré-miR comprend un apprêt de contrôle U6, qui est souvent utilisé comme un gène de référence pour normaliser les valeurs CT à partir d'échantillons différents. Cette valeur normalisée est appelée la valeur delta CT (DCT). Les résultats sont souvent représentées comme le CT premières, la valeur DCT ou peut encore être analysés pour des valeurs normalisées. Dans la figure 1, l'analyse de la pleine pré-microARN tableau de quatre échantillons différents d'une expérience timecourse est présenté en format carte de chaleur. L'expression relative de chaque pré-microARN est montré et trois majeurs, les clusters distincts ont émergé. La majorité des pré-mirs analysé subi de petites modifications insignifiantes comme prévu (figure 1A). Cependant, une petite portion de pré-microARN ont été significativement diminué (figure 1B) ou augmenté de façon spectaculaire (figure 1C) à travers l'expérience timecourse. Les niveaux d'expression de chacun de pré-microARN ont été normalisées à l'timepoint 0h (échantillon 1) comme un niveau de référence. Dans certains cas, vous pouvez noter que certains des clusters pré-microARN également se regrouper dans l'analyse heatmap (ex: laissez-7a Figure 1B,). Selon l'expérience, les clusters peuvent émerger qui dépendent de l'infection virale, l'expression type de cellule spécifique de pré-microARN ou pré-mirs qui sont réglementés par une molécule commune ou la voie de signalisation. Le test pré-microARN que nous avons développé comprend également un certain nombre de pré-viraux connus microARN codés par des gènes et le sarcome de Kaposi herpèsvirus associé (KSHV) et le virus Epstein Barr (EBV), en plus de l'homme pré-mirs. Ceux-ci peuvent être utilisés comme contrôles positifs ou négatifs, selon la lignée cellulaire et statut viral des échantillons utilisés. Dans la figure 2, la CTS en moyenne à partir d'un échantillon de KSHV négatif exécuté en quatre exemplaires sont présentés. Surtout, KSHV LANA n'a pas été détectée dans cet échantillon par le tableau qPCR hautement sensible. Toutefois, U6 - notre contrôle interne et laissez-7a - hautement exprimé humaines pré-microARN, ont été exprimées à des niveaux détectables. Enfin, comme prévu, le contrôle négatif de la PCR-grade de l'eau n'a pas le rendement d'un produit qPCR. Un autre indicateur d'une exécution réussie qPCR est une analyse fondre une bonne courbe, ce qui peut donner un aperçu de la contamination potentielle dans les échantillons. Pour établir une température de fusion, la plaque est chauffée lentement après la PCR est terminée. Comme les brins d'ADN séparés, SYBR green est libéré, et le signal de fluorescence diminue. La température à laquelle ce drop se produit est tracée, et est connue comme la température de fusion de l'échantillon. Selon la séquence d'ADN, les échantillons fondent à des températures différentes les unes des autres et de la maîtrise de l'eau négative, ce qui ne devrait pas avoir une température de fusion puisque aucun ADN est présent. Les produits de PCR de chaque paire d'amorces devraient fondre à des températures similaires. Par exemple, la figure 3 montre une analyse de la courbe de fusion de deux amorces différentes utilisant le même échantillon en double exemplaire. Il est clair que la température de fusion est différente pour les deux paires d'amorces, mais l'échantillon est fondant à la température exactement le même pour chaque réplique. Les signes d'un mauvais échantillon ou potentiellement contaminés peut inclure plusieurs pics de fusion, ce qui suggère la présence de deux sources différentes de l'entrée. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Pré-microARN signatures émerger à travers l'aide d'un profilage basé sur roman de qPCR tableau. Le deltaCTU6 moyenne a été calculée et les valeurs standardisées ont été chargés dans le logiciel ArrayMinerTM, produisant trois groupes distincts affiché comme heatmaps. (A) pré-microARN avec de petits changements dans l'expression sont affichées. Pré-microARN dont les niveaux étaient significativement diminué (B) ou augmenté (C) sont également représentées. Le bleu correspond à des niveaux inférieurs d'expression tandis que le rouge représente augmenté les niveaux d'expression. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Inclusion des contrôles internes dans le qPCR à base de pré-microARN tableau. Les valeurs brutes CT pour 3 gènes différents et un contrôle de modèle ne sont affichés. U6 est utilisé comme un contrôle positif interne tandis PCR H2O nous sert de contrôle négatif. Laissez-7a-1-1 est un microARN normalement exprimé dans de nombreux types cellulaires différents tout KSHV LANA peut être utilisé soit comme un contrôle positif ou négatif, fondée sur le statut viral de la lignée cellulaire ou tissu utilisé. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Fusion d'analyse de pointe de pré-microARN amorces et l'absence de contamination des échantillons. Courbes de fusion ont été obtenues en utilisant l'analyse appelant Tm dans le logiciel LightCycler. Deux amorces différentes (Primer A et B) pour le même échantillon analysés en double sont affichés. La température de fusion pour chaque amorce est distincte. Toutefois, l'échantillon a une seule pointe, démontrant l'absence de contamination des échantillons.

<ol><li>Bustin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chem%22%5BJournal%5D)">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Frégeau, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Processing+of+Forensic+Casework+Samples+using+Robotic+Workstations+Equipped+with+Nondisposable+Tips+-+Contamination+Prevention%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention.</a> J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).</li>
<li>O'hara, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-micro+RNA+Signatures+Delineate+Stages+of+Endothelial+Cell+Transformation+in+Kaposi+Sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).</li>
</ol>

QPCR est un test très sensible qui peuvent être utilisés pour comparer les niveaux d&#39;expression génique entre les échantillons dans une étude, ainsi que pour déterminer la positivité dans le cas des virus. L&#39;avantage d&#39;utiliser des tableaux qPCR est la capacité d&#39;exécuter de nombreuses amorces (dans notre cas, 186 paires d&#39;amorces) pour chaque échantillon dans un court laps de temps. L&#39;utilisation d&#39;un robot de pipetage tels que l&#39;Evo Tecan Freedom, le montant de temps requis pour mettre ...

<table><tbody><tr><td>Freedom Evo 150</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30017587</td><td></td></tr><tr><td>Pipette multipipette électronique Matrix</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>2001-MTX</td><td>(ou tout multipipette Thermo Scientific comparable pouvant pipeter les volumes décrits ci-dessus)</td></tr><tr><td>Boutons filtrants Matrix Integrity, stériles</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>7435</td><td>(ou bouton comparable pour le multipipette utilisé)</td></tr><tr><td>Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master</td><td>Roche Group</td><td>04 707 516 001</td><td></td></tr><tr><td>Instrument Lightcycler 480 II</td><td>Roche Group</td><td>05015243001</td><td>version 384 puits</td></tr><tr><td>Plaque multipuits Lightcycler 480 384, blanche</td><td>Roche Group</td><td>04729749001</td><td></td></tr><tr><td>Feuille de scellage LightCycler 480</td><td>Roche Group</td><td>04729757001</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d'analyse multiplaque LightCycler 480</td><td>Roche Group</td><td>05075122001</td><td></td></tr><tr><td>Décontaminant Eliminase</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-31</td><td></td></tr></tbody></table>

profilage de la pré-micro arns et micro-arn en utilisant quantitative pcr en temps réel (qpcr) arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative PCR en temps réel (QPCR) a émergé comme un outil précis et précieux dans le profilage des niveaux d&#39;expression génique. Un de ses nombreux avantages est une limite inférieure de détection par rapport à d&#39;autres méthodes de profilage de l&#39;expression des gènes en utilisant de petites quantités d&#39;entrée pour chaque dosage. Automatisé de configuration qPCR a amélioré ce domaine en permettant une plus grande reproductibilité. Sa mise en pratique et rapide permet d&#39;expériences à haut débit, permettant le profilage de nombreux gènes différents simultanément dans chaque expérience. Cette méthode avec des contrôles plaque interne réduit également les variables expérimentales communes à d&#39;autres techniques. Nous avons récemment développé un test de PCR quantitative pour le profilage de la pré-microARN (pré-miARN) en utilisant un ensemble de 186 paires d&#39;amorces. Les microARN sont apparus comme une nouvelle classe de petits ARN non-codants avec la capacité de réguler les cibles ARNm nombreuses au niveau post-transcriptionnel. Ces petits ARN sont d&#39;abord transcrit par l&#39;ARN polymérase II comme un miARN primaires (PRI-miARN) transcription, qui est ensuite clivé dans le miARN précurseur (pré-miARN). Pré-miARN sont exportés vers le cytoplasme où Dicer clive la boucle en épingle à cheveux à céder miARN matures. L&#39;augmentation des niveaux de miARN peuvent être observées à la fois le précurseur et le niveau miARN matures et de profilage de ces deux formes peuvent être utiles. Il existe plusieurs dosages disponibles commercialement pour miARN matures, mais leur coût élevé peut dissuader les chercheurs de cette technique de profilage. Ici, nous discutons d&#39;un bon rapport coût-efficacité, la fiabilité, la méthode qPCR SYBR à base de profilage de pré-miARN. Les changements dans les niveaux de pré-miARN sont souvent le reflet des changements miARN mature et peut être un indicateur utile de l&#39;expression du miARN mature. Toutefois, le profilage simultané des deux pré-miARN et miARN mature peut être optimale, car ils peuvent apporter des informations non redondantes et de donner un aperçu du traitement de microARN. Par ailleurs, la technique décrite ici peut être étendu pour englober le profilage des ensembles d&#39;autres bibliothèques pour les voies spécifiques ou des agents pathogènes.

Nous allons démontrer la configuration et l&#39;analyse des pré-microARN de 96 puits pour les tableaux QPCR aide d&#39;un robot ainsi que par la main avec une pipette multicanaux Thermo Scientific Matrix.

Profilage de la pré-micro ARNs et micro-ARN en utilisant quantitative PCR en temps réel (qPCR) Arrays

La PCR quantitative en temps réel (qPCR) s'est imposée comme un outil précis et précieux pour l'établissement du profil des niveaux d'expression génique. L'un de ses nombreux avantages est un seuil plus bas...

L'objectif général de cette procédure est de permettre une mise en place rapide et fiable, de manière automatisée, de puces basées sur la PCR quantitative. Cela est réalisé en préparant d'abord les jeux d'amorces pour la puce et en préparant les mélanges maîtres d'échantillons à analyser. Ensuite, soit un système robotisé automatisé de préparation de PCR, soit un système de pipette électronique matricielle est utilisé pour distribuer avec précision le mélange maître d'échantillon et les jeux d'amorces dans chaque puits d'une plaque de 384 puits.Une fois préparées, les réactions PCR en plaques de 384 puits sont effectuées selon le programme PCR basé sur le Light Cycler 480. La dernière étape de la procédure consiste à analyser les données de QPCR et à déterminer les niveaux d'expression relative pour chaque paire d'amorces testée, chacune ciblant un ARNm spécifique. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant des variations de l'expression de vastes ensembles d'ARNm.Des puces spécifiquement conçues peuvent donc cibler l'ensemble des profils de microARN précurseurs, ou des voies spécifiques ou des molécules clés dans l'infection virale, grâce à un profilage basé sur la PCR quantitative. Bonjour, je suis Dirk DMA du Département de microbiologie et d'immunologie de l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment mettre en place une PCR quantitative en temps réel, et nous vous présenterons deux méthodes.Une méthode utilisant une pipette irrégulière et une autre utilisant un robot. Nous utilisons cette technologie pour mesurer les pré-microARN et les microARN matures dans les tumeurs humaines. La démonstration d'aujourd'hui sera réalisée par Pauline Chu et Kristen bu.Commençons. Pour commencer cette procédure, récupérez les plaques d'amorces contenant 186 paires d'amorces dans un format 96 puits à 0,5 picaMoles, stockées à moins 20 degrés Celsius.Après avoir décongelé les plaques à température ambiante, vortexez-les et centrifugez-les brièvement. Décongelez également par deux fois le mélange PCR au vert cyber à température ambiante. Pour la préparation de chaque plaque de 96 puits avec amorces, quatre tubes de mélange maître seront nécessaires. Préparez le mélange maître en combinant quatre microlitres de mélange vert cyber, trois microlitres d'eau de qualité PCR et 10 à 20 nanogrammes d'ADN ou d'ADNc échantillon par réaction dans chacun des quatre tubes Eppendorf de deux millilitres.Chaque tube doit contenir suffisamment de mélange maître pour environ 100 réactions, en prévoyant un excès pour compenser les pertes lors du pipetage. Vortexer les tubes einor pour homogénéiser. Commencer la mise en place du test de microARN précurseur en utilisant le robot Tecan EVO, en initialisant le robot et en chargeant le programme EVO wear.Ensuite, rincez le robot trois fois avec 30 millilitres de liquide système afin d'éliminer les bulles d'air qui pourraient nuire à la précision du pipetage. Puis, configurez la plateforme robotisée pour inclure une plaque de 384 puits et une plaque de 96 puits contenant les amorces. Les mélanges maîtres se trouvent dans un réservoir contenant 2 % de javel, un contenant de liquide système rempli, et un contenant de déchets vide.Lancez l'exécution automatisée du robot en sélectionnant deux fois « exécuter » à la fin du programme. Retirez la plaque 384 puits et scellez-la avec du film d'étanchéité Light Cycler quatre 80 pour plafond. Ensuite, centrifugez la plaque.Placer brièvement la plaque scellée de 384 puits en position un de l'hôtel. Répéter ensuite ce processus pour la plaque d'amorces deux avec de nouveaux mélanges maîtres et une nouvelle plaque de 384 puits. Placer la plaque de 384 puits scellée résultante en position deux de l'hôtel.Ouvrez un nouveau programme EVO Wear pour le chargement du cycliseur lumineux à partir de l'hôtel et définissez les paramètres de cyclage. Ensuite, sélectionnez « exécuter deux fois ». Le Freedom Evo chargera automatiquement chaque plaque dans le cycliseur lumineux et exécutera le programme de cyclage HRM au vert cyber.Une fois terminé, examiner et analyser les résultats comme décrit dans le protocole écrit, en alternative à l'utilisation du robot. Une pipette multipipette électronique matricielle peut être utilisée pour commencer à transférer le contenu du tube de mélange maître dans un réservoir.Régler la pipette électronique pour aspirer 16 microlitres de mélange maître avec deux étapes de distribution de huit microlitres suivies d'une étape de purge. Après avoir réglé la pipette, aspirer 16 microlitres de mélange maître et commencer à distribuer dans une plaque en forme de roue 384. Distribuer les premiers huit microlitres dans chaque autre rangée de la colonne un en utilisant les rangées A à O, en laissant la colonne suivante vide.Dispensez les huit microlitres suivants dans les mêmes lignes de la colonne trois. Ensuite, purgez au-dessus d'un récipient de déchets et jetez les pointes en suivant ce schéma laissant des lignes alternées et des colonnes alternées. Effectuez la distribution sur la plaque pour cinq cycles supplémentaires afin de pipeter le mélange maître deux.Utilisez les mêmes rangées que pour le mélange maître un, mais commencez par la colonne deux. Répétez cette procédure pour les mélanges maîtres trois et quatre, en commençant respectivement par les colonnes un et deux, mais cette fois en utilisant la rose B jusqu’à P.Her en citant la plaque d’amorces. Réglez une pipette électronique pour aspirer deux microlitres et distribuer deux microlitres, suivis d’une étape de purge.Transférez deux microlitres d'amorces de la colonne un, ligne A à H d'une plaque d'amorces de 96 puits vers chaque autre colonne un des lignes de la plaque de 384 puits ; purgez au-dessus d'un récipient de déchets et jetez les pointes. Répétez ce schéma pour chaque amorce avec les trois mélanges maîtres restants des colonnes un et deux. Puis poursuivez ce processus pour les colonnes deux à douze de la plaque d'amorces de 96 puits, en avançant de deux colonnes à chaque fois dans la plaque de 384 puits pour chaque colonne d'amorces.Ensuite, scellez les plaques avec un couvercle de cycler léger, du papier d'aluminium et centrifugez. Après une brève centrifugation, placez les plaques dans un light cycler four 80 et effectuez les cycles des plaques en utilisant le format de détection HRM cyber green one.En utilisant les mêmes conditions de cyclage qu’auparavant, répétez cette procédure en employant la plaque d’amorces deux Eloqua dans une nouvelle plaque de 384 puits, avec des mélanges maîtres fraîchement préparés. Les signatures des microARN précurseurs émergent grâce au profilage à l’aide d’un nouveau tableau basé sur la PCR quantitative. La valeur moyenne du delta CT, normalisée par rapport à U six, a été calculée et les valeurs standardisées ont été chargées dans le tableau.Logiciel mineur produisant trois groupes distincts affichés sous forme de cartes thermiques. L'expression relative de chaque microARN précurseur est indiquée, le rouge et le bleu représentant respectivement une augmentation et une diminution de l'expression relative. L'intensité de la couleur indique le degré de changement d'expression.La majorité des microARN précurseurs ont subi de légers changements non significatifs, comme prévu. Toutefois, une petite fraction des microARN précurseurs a augmenté significativement au cours de l'expérience temporelle. De plus, le niveau relatif de certains microARN précurseurs a diminué de façon spectaculaire.Dans certains cas, ils forment également des groupes regroupés lors de l'analyse de la carte thermique. Selon l'expérience, des groupes peuvent apparaître en fonction de l'infection virale, de l'expression spécifique au type cellulaire des microARN précurseurs ou des microARN précurseurs régulés par une molécule commune ou une voie de signalisation.Les seuils de cycle moyens ou CT d'un échantillon négatif au virus d'herpès associé au sarcome de Kaposi, analysé en quadruple duplication, sont indiqués. Il est important de noter que l'antigène nucléaire associé à la latence du virus d'herpès associé au sarcome de Kaposi, ou KSHV LANA, n'a pas été détecté dans cet échantillon par la matrice QPCR hautement sensible. En revanche, le contrôle interne U six et let seven a, un précurseur d'ARN micro-ARN humain fortement exprimé, étaient tous deux exprimés à des niveaux détectables.Enfin, comme prévu, le témoin négatif constitué d'eau de qualité PCR n'a pas produit de produit A-Q-P-C-R. Analyse de courbe de fusion pour deux amorces différentes. Le même échantillon en double est présenté.Il est clair que la température de fusion est différente pour les deux paires d'amorces, mais l'échantillon fond à la même température exacte pour chaque réplicat. Des signes d'un mauvais échantillon ou potentiellement contaminé peuvent inclure plusieurs pics de fusion suggérant la présence de deux sources différentes d'ADN d'entrée. Nous venons de vous montrer comment configurer une expérience de PCR quantitative en temps réel en utilisant un robot.Il est important que vous incluiez toutes les conditions témoins et un nombre aussi élevé que possible de gènes de référence. Nous vous remercions donc d'avoir regardé cette vidéo et vous souhaitons bonne chance dans vos expériences.

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Nous décrivons ici une inversion optimisé multiplexe transcriptase PCR quantitative (qRT-PCR) en combinaison avec le protocole d'une plateforme microfluidique comme un coût et le temps moyen efficace de dépistage à haut débit pour microARN (miARN) les niveaux d'expression, surtout quand on travaille avec des quantités limitées de l'échantillon.

Haute profilage de microARN Débit: Multiplex Optimisé qRT-PCR à l&#39;échelle nanolitres sur l&#39;IFC de Fluidigm ArrayTM dynamique

Une procédure simple d'effectuer des expériences de micropuces personnalisées microARN est décrite. Les étapes comprennent isoler l'ARN, l'étiquetage ARN et l'ADN de référence, l'hybridation des échantillons à puces, la numérisation des microarrays, quantifier et analyser les signaux d'hybridation.

Exécution personnalisée expériences de micropuces MicroRNA

Quantitative de réaction en chaîne polymérase en temps réel (qPCR) est une méthode rapide et sensible pour enquêter sur les niveaux d'expression de microARN (miARN différents) des molécules dans des échantillons tumoraux. En utilisant cette expression méthode de centaines de molécules différentes miARN peuvent être amplifiés, quantifiés, analysés et partir du même modèle d'ADNc.

Détection MicroRNA dans les tumeurs prostatiques par quantitative PCR en temps réel (qPCR)

La présence de microARN (miARN stables) dans exosomes a généré un immense intérêt comme un nouveau mode de communication intercellulaire, pour leur utilité potentielle en tant que biomarqueurs et comme une voie pour l'intervention thérapeutique. Ici, nous démontrons purification d'exosomes à partir de supports de sang et de culture, suivie par PCR quantitative pour identifier les miARN transportés.

Purification et profilage de microARN des exosomes dérivés du sang et de la culture des médias

Nous décrivons un protocole de PCR en temps réel pour le profil de microARN dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). A l'exception des protocoles d'extraction d'ARN, la procédure peut être étendue à l'ARN extrait à partir d'autres fluides corporels, des cellules en culture, ou des échantillons de tissus.

Liquide céphalo-rachidien profilage de microARN Utilisation quantitative PCR en temps réel

Moléculaire de signalisation par des œstrogènes et les microARN sont essentiels dans le développement du cancer du sein et de la croissance. L'œstrogène active les récepteurs d'oestrogène, qui sont des facteurs de transcription. De nombreux facteurs de transcription peuvent réguler l'expression de microARN, et microARN régulés par les œstrogènes peuvent être profilée en utilisant différentes techniques de grande envergure.

Profilage de microARN œstrogène réglementés dans les cellules du cancer du sein

MicroARN qui circulent ont récemment émergé comme biomarqueurs prometteurs et novateurs en vue de divers cancers et d'autres maladies. Le but de cet article est de discuter de trois plateformes de PCR différents basés sonde en temps réel et les méthodes qui sont disponibles pour quantifier et déterminer l'abondance des microARN circulation.

PCR en temps réel basée sur une sonde Approches de mesure quantitative des microARN

Une méthode sensible et précise de quantification des microARN acellulaires à l’aide d’une chimie à base de colorants et d’une technologie de PCR numérique en gouttelettes est décrite.

Circulant microARN Quantification Utilisation DNA-binding Dye Chemistry and Droplet PCR numérique

Ce rapport décrit un protocole de mesure des niveaux absolus de miRNA plasma, à l’aide de la transcription inverse en temps réel quantitative PCR avec ou sans pré amplification. Ce protocole permet de mieux comprendre la quantité de plasma miARN et permet une évaluation qualitative des données correspondantes de différentes études ou laboratoires.

Quantification absolue des micro-ARN plasmatique chez les singes Macaques, à l’aide de la Transcription inverse en temps réel Quantitative PCR

Nous décrivons ici une méthode pour évaluer l’expression de poumon des miARN qui est prévus pour réguler les gènes inflammatoires utilisant des souris exposées à l’ozone ou de l’air filtré à différents stades du cycle oestral.

Poumon microARN profilage à travers le œstrus chez les souris exposées à l’Ozone

Ici, un protocole quantitatif en temps réel basé sur la réaction en chaîne de la polymérase est présenté pour la détermination de la teneur en micro-ARN native (absolue/relative) des particules de lipoprotéines. En outre, une méthode pour augmenter le niveau de micro-ARN, ainsi qu’une méthode pour déterminer le taux d’absorption cellulaire des particules de lipoprotéines, est démontrée.

Enrichissement de particules de lipoprotéines indigènes avec microRNA et détermination subséquente de leur teneur absolue/relative de microRNA et de leur taux de transfert cellulaire

Découvrez la configuration automatisée de réseaux qPCR pour le profilage de pré-microARNs et microARNs. Cette méthode permet une préparation rapide et fiable des échantillons pour l'analyse d'expression génique.

Profilage de la pré-micro ARNs et micro-ARN en utilisant quantitative PCR en temps réel (qPCR) Arrays

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