Profilage de la pré-micro ARNs et micro-ARN en utilisant quantitative PCR en temps réel (qPCR) Arrays

L’objectif global de cette procédure est de permettre une configuration automatisée rapide et fiable des matrices basées sur QPCR. Pour ce faire, il faut d’abord préparer les jeux d’amorces pour le réseau et configurer les mixages maîtres d’échantillons à cribler. Ensuite, une configuration PCR robotisée automatisée ou un système de pipette électronique matricielle est utilisé pour échantillonner avec précision le mélange principal et les ensembles d’amorces Eloqua dans chaque puits d’une plaque de 384 puits.

Une fois préparées, les réactions PCR à 384 puits sont exécutées avec le programme PCR basé sur le cycle léger quatre 80 basé sur le cyber. La dernière étape de la procédure consiste à analyser les données de la QPCR et à déterminer les niveaux d’expression relatifs pour chaque paire d’amorces testée, chacune ciblant un ARNm spécifique. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent des changements dans l’expression de grands ensembles d’ARNm.

Des puces spécifiquement développées peuvent donc cibler des profils pré-micro ARN entiers, des voies spécifiques ou des molécules clés de l’infection virale grâce au profilage basé sur la QPCR. Bonjour, je suis Dirk DMA du Département de microbiologie et d’immunologie de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill. Aujourd’hui, nous allons vous montrer comment configurer QQPC rra en temps réel et nous allons vous montrer deux méthodes.

L’une à l’aide d’une pipette irrégulière et l’autre à l’aide d’un robot. Nous utilisons cette technologie pour mesurer les pré-microARN et les microARN matures dans les tumeurs humaines. La démonstration d’aujourd’hui sera faite par Pauline Chu et Kristen bu.

Alors commençons. Pour commencer cette procédure, récupérez des plaques d’amorces contenant 186 paires d’amorces dans un 96. Format puits à 0,5 picaMoles stockées à moins 20 degrés Celsius.

Après avoir décongelé les plaques à température ambiante, vortex et centrifugez-les brièvement. Décongelez également le cyber-vert deux fois le mélange PCR à température ambiante pour la configuration de chaque plaque d’amorce de 96 puits, quatre tubes de mélange maître seront nécessaires. Préparez le mélange maître en combinant quatre microlitres de mélange cyber vert, trois microlitres d’eau de qualité PCR et 10 à 20 nanogrammes d’ADN d’échantillon ou d’ADNC par réaction dans chacun des quatre tubes einor de deux millilitres.

Chaque tube doit contenir suffisamment de mélange maître pour environ 100 réactions, ce qui permet d’en extraire les déchets de pipetage. Vortex les tubes einor à mélanger. Début de la configuration du test de micro-ARN précurseur à l’aide du robot freedom Tecan EVO avec initialisation du robot et chargement du programme d’usure EVO.

Ensuite, rincez le robot trois fois avec 30 millilitres de liquide système pour éliminer les bulles d’air qui interféreront avec la précision du pipetage. Ensuite, configurez la plate-forme du robot pour qu’elle comprenne une plaque de 384 puits et une plaque d’amorce de 96 puits. Le master mélange une auge contenant 2 % d’eau de Javel, un système rempli, un récipient de fluide et un conteneur à déchets vide.

Commencez l’exécution du robot automatisé en sélectionnant exécuter deux fois à la fin du programme. Retirez la plaque à 384 puits et scellez-la avec un cycle léger quatre feuilles de plafond 80. Ensuite, centrifugez la plaque.

Placez brièvement la plaque scellée du puits 384 en position un de l’hôtel. Répétez ensuite ce processus pour la deuxième plaque d’amorce avec de nouveaux mélanges maîtres et une nouvelle plaque à 384 puits. Placez la plaque scellée 384 monde résultante en position deux de l’hôtel.

Ouvrez un nouveau programme d’usure EVO pour charger le cycleur léger depuis l’hôtel et réglez les paramètres de cyclage. Sélectionnez ensuite exécuter deux fois. Freedom Evo chargera automatiquement chaque plaque dans le cycleur léger et exécutera le programme de cyclisme cyber green one HRM.

Une fois terminé. Examinez et analysez les résultats tels que décrits dans le protocole écrit comme alternative à l’utilisation du robot. Une pipette électronique multicanaux matricielle peut être utilisée pour commencer à placer le contenu du tube de mélange principal dans un réservoir.

Réglez la pipette électronique pour aspirer 16 microlitres de mélange principal avec deux étapes de distribution de huit microlitres suivies d’une étape de purge. Après avoir réglé la pipette, aspirez 16 microlitres de mélange principal et commencez à distribuer dans une plaque de roue 384. Répartissez les huit premiers microlitres dans une rangée sur deux de la première colonne en utilisant les rangées A à O, en laissant la colonne suivante vide.

Distribuez les huit microlitres suivants dans les mêmes rangées de la troisième colonne. Ensuite, purgez au-dessus d’un conteneur à déchets et jetez les pointes en suivant ce schéma en laissant des rangées et des colonnes alternées. Répartissez la plaque pendant cinq cycles supplémentaires pour pipeter le mélange principal deux.

Utilisez les mêmes rangées que le mixage principal, mais commencez par la deuxième colonne. Répétez cette procédure pour les mélanges maîtres trois et quatre, en commençant respectivement par les colonnes un et deux, mais cette fois en utilisant la rose B à P.Her en citant la plaque d’amorce. Réglez une pipette électronique pour aspirer deux microlitres et distribuer deux microlitres avec une étape de purge à suivre.

Transférez deux microlitres d’amorces de la colonne A à H d’une plaque d’amorce à 96 puits à chaque autre colonne d’aviron, l’une des 384 plaques, purgez sur un conteneur à déchets et jetez les pointes. Répétez ce modèle pour l’amorce quatt pour les trois mélanges maîtres restants des colonnes un et deux. Poursuivez ensuite ce processus pour les colonnes deux à 12 de la plaque d’amorce à 96 puits en se déplaçant sur toutes les deux colonnes de la plaque à 384 puits pour chaque colonne d’amorce.

Ensuite, scellez les plaques avec un plafond cycleur léger, une feuille et une centrifugeuse. Brièvement après la centrifugation. Placez les plaques dans un cycleur léger quatre 80 et faites fonctionner les plaques en utilisant le format de détection cyber green one HRM.

En utilisant les mêmes conditions de cycle que précédemment, répétez cette procédure à l’aide de la plaque d’amorce deux Eloqua dans une plaque fraîche à 384 puits à l’aide de mélanges maîtres fraîchement préparés. Les signatures de micro-ARN précurseurs émergent par profilage à l’aide d’un nouveau réseau basé sur la QPCR. Le delta CT moyen normalisé à U six a été calculé et les valeurs normalisées ont été chargées dans le réseau.

Logiciel mineur produisant trois groupes distincts affichés sous forme de cartes thermiques. L’expression relative de chaque micro-ARN précurseur est indiquée : le rouge et le bleu représentent respectivement une augmentation et une diminution de l’expression relative. L’intensité de la couleur indique le degré de changement d’expression.

La majorité des microARN précurseurs ont subi de petits changements insignifiants, comme prévu. Cependant, une petite partie des microARN précurseurs a considérablement augmenté tout au long de l’expérience au cours de l’expérience. De plus, le niveau relatif de certains microARN précurseurs a diminué de façon spectaculaire.

Dans certains cas. Ils se regroupent également dans l’analyse de la carte thermique. Selon l’expérience, des grappes peuvent émerger qui dépendent d’une infection virale, d’une expression spécifique du type cellulaire de microARN précurseurs ou de microARN précurseurs qui sont régulés par une molécule commune ou une voie de signalisation.

Les seuils de cycle moyens ou cts d’un échantillon négatif associé au virus de l’herpès associé au sarcome de Posey en cours d’exécution quadruple dupliqué sont indiqués. Il est important de noter que l’antigène nucléaire associé à la latence du virus de l’herpès associé au sarcome de Kaposi ou KSHV Lana n’a pas été détecté dans cet échantillon par la puce QPCR très sensible. Cependant, le contrôle interne U six et le let sept un micro-ARN précurseur humain fortement exprimé, ont été exprimés à des niveaux détectables.

Enfin, comme prévu, le contrôle négatif de l’eau de qualité PCR n’a pas donné de produit A-Q-P-C-R. Une analyse de la courbe de fusion pour deux amorces différentes. En utilisant le même échantillonnage, la copie est illustrée.

Il est clair que la température de fusion est différente pour les deux paires d’amorces, mais que l’échantillon fond exactement à la même température pour chaque répétition. Les signes d’un échantillon de mauvaise qualité ou potentiellement contaminé peuvent inclure plusieurs pics de fusion suggérant la présence de deux sources d’entrée différentes. Nous venons de vous montrer comment mettre en place des expériences de QPCR en temps réel à l’aide d’un robot.

Il est important que vous incluiez tous les contrôles et autant de gènes d’entretien que possible. Alors merci de nous avoir regardés et bonne chance dans vos expériences.