Polymerase Chain Reaction: Protocole Basic Plus Stratégies de dépannage et d'optimisation

L’objectif général de cette procédure est de démontrer les étapes impliquées dans la réaction en chaîne par polymérase ou PCR, qui est utilisée pour produire un approvisionnement abondant d’un segment spécifique d’ADN à partir d’une petite quantité de matériel de départ. Tout d’abord, assemblez les réactifs et les matériaux à utiliser dans la réaction PCR, puis mettez en place le mélange réactionnel, y compris les quatre désoxy-ribonucléotides, la matrice d’ADN, les amorces et l’ADN polymérase. Ensuite, programmez, les conditions de cyclage thermique et exécutez la réaction PCR.

Suite à cela. Vérifiez les résultats pour déterminer si la réaction a réussi. En fin de compte, une réaction en chaîne par polymérase devrait produire un amplicon spécifique de la taille de produit souhaitée.

En général, les personnes qui ne connaissent pas ce protocole auront un peu de mal à configurer les calculs de chacun des réactifs variables, et parfois elles ont des problèmes avec le pipetage, les volumes corrects, en particulier avec la polymérase qui contient du glycérol. Commencez l’expérience avec un seau à glace fraîchement rempli. Portez des gants pour éviter de contaminer la réaction.

Mélange et réactifs. Disposez les composants PCR sur de la glace pour qu’ils dégèlent complètement. Il s’agit notamment des amorces de matrice d’ADN, de l’ADN polymérase 10 x tampon de réaction avec ou sans chlorure de magnésium, de désoxynucléotides, d’eau stérile et de chlorure de magnésium.

Le chlorure de magnésium est nécessaire si vous utilisez le tampon sans chlorure de magnésium. Placez une plaque à 96 puits dans un seau à glace comme support pour les tubes PCR à paroi mince de 0,2 millilitre. Equipez maintenant l’établi de tubes et de bouchons PCR.

Un support de tubes PCR, un marqueur résistant à l’éthanol et un ensemble de micro-pipettes. Créez toujours un tableau de réactifs détaillant le mélange réactionnel avec de l’eau distillée stérile quantique pour obtenir un volume final de 50 microlitres. Par exemple, en utilisant cinq microlitres d’un tampon sans magnésium, un microlitre de 10 DN NTP millimolaires et un magnésium optimisé de 4,0 millimolaires.

Un microlitre de chaque 20 amorces micromolaires, 0,5 microlitre d’un modèle de deux nanogrammes par microlitre. Et 0,5 microlitre de polymérase nécessiterait seulement 33 microlitres d’eau stérile. Ajoutez du chlorure de magnésium s’il n’est pas présent dans le tampon 10 x ou si nécessaire pour l’optimisation de la PCR.

Procédez à l’étiquetage des tubes PCR avec un marqueur résistant à l’éthanol sur chaque tube de réaction. Tout d’abord, ajoutez les quantités calculées d’eau stérile, puis ajoutez 10 x tampon et 10 NTP DN millimolaires. Pour cette réaction, nous effectuons un titrage avec du chlorure de magnésium.

Étant donné que la concentration de magnésium ne sera pas constante, le chlorure de magnésium est ajouté individuellement aux tubes PCR et le volume est normalisé à 10 microlitres avec de l’eau stérile, de sorte que 40 microlitres du mélange principal final sont ajoutés à chaque tube PCR. Pour terminer la réaction de 50 microlitres et le chlorure de magnésium, continuez à ajouter le modèle d’ADN et les amorces. Enfin, ajoutez 0,5 à 2,5 unités d’ADN polymérase par réaction de 50 microlitres dans un tube de micro-fuge de 1,8 millilitre.

Préparez une solution de mélange maître suffisante pour tenir compte des contrôles ainsi que des pertes de transfert de pipette. Réglez un micro-pipeteur à environ la moitié du volume total de la solution et mélangez doucement par pipetage. Pour chaque échantillon de test, un mélange maître éloquent dans un tube PCR.

Maintenant, pour le contrôle négatif sans ADN matrice, ajoutez tous les réactifs et utilisez de l’eau stérile pour compenser le volume d’ADN manquant. Ensuite, pour le contrôle positif, utilisez un ensemble d’ADN matrice et d’amorces qui amplifient un fragment connu dans les mêmes conditions que les échantillons PCR expérimentaux. Les thermocycleurs PCR chauffent et refroidissent rapidement le mélange réactionnel, ce qui permet la dénaturation induite par la chaleur du duplex, l’agenouillage de l’ADN des amorces sur les brins positifs et négatifs de la matrice d’ADN et l’allongement du produit PCR.

Les temps de cyclisme sont basés sur la taille du modèle et le contenu en CG de l’ADN pour la formule générale. Commencez par une dénaturation initiale du modèle, puis lancez 25 à 35 cycles d’un programme de cycle de température en trois étapes. La première étape de ces cycles pour dénaturer le modèle d’ADN.

Ensuite, programmez pour optimal, un agenouillement des amorces à environ cinq degrés Celsius en dessous de la température de fusion apparente des amorces, suivi de l’étape d’allongement pour amener la polymérase à la matrice d’ADN et synthétiser le produit PCR. Entrez maintenant le nombre de cycles. Prochain programme.

Une étape d’allongement prolongée pour la réalisation de la synthèse des amplicons. Enfin, incluez une étape de terminaison, refroidissant le mélange à quatre degrés Celsius. Si les conditions standard de PCR ne donnent pas l’amplicon souhaité, l’optimisation de la PCR est nécessaire pour obtenir de meilleurs résultats.

Donc, si les réactions n’ont pas fonctionné la première fois, vous voulez essayer de résoudre la réaction. Et donc, tout d’abord, vous voulez vous assurer que le problème n’était pas une erreur humaine. Et cela pourrait arriver si vous avez une erreur de pipetage ou si, si vous avez oublié d’ajouter un réactif au test, l’un des tubes à essai.

Ensuite, vous pouvez essayer de modifier certaines des rigueurs de la condition afin de pouvoir modifier la configuration du thermocycleur, ou vous pouvez modifier la concentration de magnésium est une autre méthode alternative. Vous pouvez également essayer d’ajouter des additifs au réactif pour résoudre les problèmes. Alternativement, considérez la PCR à chaud comme une modification polyvalente dans laquelle le temps de dénaturation initial est considérablement augmenté.

L’électrophorèse sur gel AROS est ensuite utilisée pour résoudre la PCR du gène GAL trois à partir de l’ADN génomique de S seia afin de déterminer la concentration optimale d’ions magnésium pour cet ensemble de réactifs, notez, Un produit PCR de la taille attendue. 2098 paires de bases apparaissent à partir d’une concentration de magnésium de 2,5 millimolaires avec une concentration optimale à quatre millimolaires sur différentes matrices d’ADN amplification du produit PCR souhaité car une bande discrète nécessite deux Magnésium millimolaire. La réduction de la rigueur de la réaction à des conditions d’amplification effectivement sous-optimales produit un frottis de produits non spécifiques.

De plus, avec la rigueur globale de la réduction de la réaction, une quantité plus faible d’ion magnésium est nécessaire pour former une icône d’amplicon. Ainsi, l’optimisation de la PCR tout en tenant compte des variables peut produire le produit souhaité discret. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la mise en place et de la préparation d’une réaction en chaîne par polymérase.

L’objectif est de comprendre les variables de chaque PCR et comment elles peuvent être manipulées pour créer l’amplicon souhaité.