Name: Computed Tomography-guidée tomographie diffuse Time-Domain Fluorescence chez les petits animaux pour la localisation de biomarqueurs du cancer (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Découvrez la tomographie de fluorescence diffuse guidée par tomodensitométrie pour imager l'expression du récepteur du facteur de croissance épidermique dans un modèle de gliome chez la souris. Cette méthode combine imagerie optique et rayons X pour améliorer la visualisation tumorale et surveiller les thérapies moléculaires.

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Ce travail a été financé par des subventions du National Cancer Institute R01 CA120368, R01 CA109558 (KMT, CEP, FEG, BWP), RO1 CA132750 (MJ, BWP) et K25 CA138578 (FL), et les Instituts canadiens de recherche en santé bourse postdoctorale (KMT ). Le développement du système de tomographie par fluorescence a été partiellement financé par Recherches et Technologies Avancées (Montréal, QC).

1. Préparation des animaux <ol><li> Anesthésier souris nude (Charles River, Wilmington, MA) avec injection intra-péritonéale de la kétamine-xylazine (100 mg / kg: 10 mg / kg ip). </li><li> Placez la souris dans un cadre stéréotaxique, faire une incision dans le cuir chevelu sur le côté gauche du crâne et, à l&#39;aide d&#39;une aiguille de calibre 18, de créer un 1 mm-diamètre du trou dans le crâne de 2 mm de la ligne centrale et 2 mm en arrière de la bregma. </li><li> Injecter 5 × 10 5 cellules de glioblastome humain U251 neuronales (aimablement fourni par le Dr Mark Israël au Dartmouth College, Hanover, NH) dans 5 pi d&#39;une solution de tampon phosphate dans l&#39;hémisphère cérébral gauche, à une profondeur d&#39;environ 2 mm en dessous de la surface de la cerveau. Utiliser un micro-seringue Hamilton 18 et une extrémité franche aiguille de calibre 27 pour l&#39;implantation de cellules et d&#39;insérer la pointe de l&#39;aiguille de 3 mm de la surface extérieure du crâne, puis retirer 1 mm pour créer une poche pour les cellules. </li><li> Site de l&#39;incision de la suture et permettre la réutilisationdécouverte de la chirurgie. </li><li> Attendre environ 14 jours pour permettre à la tumeur pour se développer avant d&#39;imagerie. </li></ol> 2. Fluorescence étalonnage système de tomographie <ol><li> Le jour de l&#39;imagerie de la souris, ouvrir le système et permettre des lasers et des détecteurs de lumière pour réchauffer pendant environ 20 minutes pour éviter les dérives dans la sensibilité du système. </li><li> Placez un 100 ° par 4 ° ligne d&#39;ingénierie diffuseur (Thorlabs, Newton, NJ) au centre directe du portique d&#39;imagerie, normale au laser d&#39;excitation: un ordre de la picoseconde pulsé de 80 MHz multimode diode laser 635 nm (PicoQuant Photonics North America Inc, Westfield, MA). Ajustez l&#39;angle du diffuseur afin de maximiser la quantité de signal détecté par les cinq canaux de collecte de lumière. Une description complète de la géométrie de l&#39;image est fournie ailleurs 11,14,15. </li><li> Placez OD 2 filtres de densité neutre (Thorlabs, Newton, NJ) en face de tous les tubes photomultiplicateurs de détection de fluorescence (PMT) et OD 1 filtres de densité neutre (Thorlabs, Newton, NJ) en face de tous les PMT de détection de transmission. Recueillir 100 profils temporels de propagation d&#39;impulsions (TPSF) du laser, chacune avec un temps d&#39;intégration 1-s. </li><li> Normaliser chaque TPSF par le laser de référence, corriger la dérive temporelle dans le laser de référence, et en moyenne sur toutes les itérations pour chaque détecteur. Ces TPSFs moyennées sont des fonctions spécifiques de réponse de détecteur-instruments (FRI) utilisés dans la reconstruction d&#39;image optique. </li></ol> 3. Imaging Protocol <ol><li> Anesthésier la souris avec 2% d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène (1 L / min). </li><li> Injecter 1 nanomole de IRDye 800CW-EGF et 1 nanomole de Alexa Fluor 647 dans 100 pi de solution de tampon phosphate, par voie intrapéritonéale, 12 h avant à l&#39;imagerie de cibler épidermique surexpression du récepteur du facteur de croissance de la tumeur. </li><li> Placez la souris sur la fibre de verre prend en charge du lit d&#39;imagerie, l&#39;organisation de la souris de sorte que son nez reste dans un cône de livrer anesthésie à l&#39;isoflurane. </li><li> Ensorte que la souris est placée de façon appropriée sur le lit: à savoir que, lorsque le lit est fixé dans le système de tomographie par fluorescence de la souris est au centre approximatif du portique imagerie. Ce positionnement peut être guidé par la rotation du laser d&#39;excitation de 180 ° autour de la souris, en sorte que le point focal du laser éclaire un point à peu près sur le centre de la souris du point de vue du laser à tous les angles. </li><li> Une fois positionné, transférer soigneusement le lit d&#39;imagerie et de la souris à l&#39;microCT (eXplore Locus, GE Healthcare, London, ON) du scanner et de recueillir des informations anatomiques à une résolution de 93-um isotrope pour toute la tête de la souris. </li><li> Visualiser la pile d&#39;images CT et sélectionner la tranche (s) à imager avec le système de tomographie par fluorescence. </li><li> Transférer soigneusement le lit d&#39;imagerie et de la souris vers le système de tomographie par fluorescence. Choisissez le nombre de postes sources pour recueillir des données sur la souris pour chaque slic imageriee (32), le temps d&#39;intégration pour chaque mesure TPSF (1 s), le nombre d&#39;itérations pour chaque position de source (10), et la position et le nombre de tranches d&#39;imagerie souhaitées de la pile d&#39;images CT à l&#39;étape 3.6. Les chiffres entre parenthèses sont des valeurs typiques pour chaque paramètre d&#39;imagerie qui donne environ 5 minutes d&#39;acquisition de données par tranche d&#39;imagerie. </li><li> Placer les filtres notch triples (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT) devant des PMT de détection par fluorescence, pour limiter toute la lumière laser d&#39;atteindre les détecteurs de fluorescence, et OD 2 filtres de densité neutre devant des PMT de détection de transmission pour éviter la saturation de ces détecteurs. </li><li> Exécuter le logiciel d&#39;acquisition de données, la collecte de fluorescence et de transmittance TPSFs à chaque position de détection de source définie et pour chaque longueur d&#39;onde d&#39;excitation (635 nm et 755 nm pour exciter l&#39;Alexa Fluor 647 et IRDye 800CW-EGF traceurs, respectivement). Pour chaque ensemble de TPSFs collectés, surveiller et enregistrer l&#39;intensité du laseravec un canal de PMT de référence. </li></ol> 4. La reconstruction d&#39;image <ol><li> Déterminer la surface extérieure de la souris et l&#39;emplacement des barres d&#39;imagerie du support de lit à partir des images CT et de créer des masques qui couvrent les confins de la souris et les tiges d&#39;imagerie séparément. </li><li> Utilisez le masque de souris pour produire un maillage éléments finis de l&#39;animal en utilisant le logiciel NIRFAST 19. </li><li> Localiser les positions de source et le détecteur de fluorescence du système de tomographie à la surface de la maille sur la base de la fluorescence et microCT enregistrement de coordonnées spatiales 20. </li><li> Retirer optiques points de données associés à des positions de source ou détecteur qui interagissent avec l&#39;emplacement de tiges de support de lit d&#39;imagerie les. </li><li> Normaliser les données recueillies à chaque position du détecteur de source par le laser de référence, de corriger la dérive temporelle dans le laser de référence, et de corriger les sensibilités des filtres qui ont été déterminés par des essais expérimentaux<html> au moment de l&#39;achat 15. </li><li> Prenez le ratio Né des données (fluorescence divisé par transmission) pour chaque position de la source-détecteur et se multiplient avec un modèle de simulation avant de transmission basée sur le maillage des animaux par éléments finis pour les uniformes des propriétés optiques. Ceci est fait pour atténuer les erreurs associées à couplage source-détecteur ou des tissus 21, de calibrer les données au modèle 22, et pour ajuster les données pour d&#39;autres aspects du modèle de données inadéquation 23,24. </li><li> Construire un vecteur de données composée de la différence mise à l&#39;échelle des données recueillies au rapport nés deux longueurs d&#39;onde. Le facteur d&#39;échelle est choisi pour maximiser le contraste EGFR contraignant. Effectuer la reconstruction d&#39;image dans le domaine temporel avec les données de différence en utilisant le calibrés TPSF pour chaque canal de détection en tant qu&#39;entrée, et créer des cartes de fluorescence du traceur de renforcement du contraste cible 15. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs &quot;&gt; Un exemple d&#39;une reconstruction de fluorescence superposée à une image de co-social anatomique CT de la tête d&#39;une souris avec une tumeur U251 de gliome orthotopique est présenté dans la figure 1b. Le centre de masse du gliome déterminée par la reconstruction fluorescente (figure 1b ) était à moins de 1 mm du centre de la tumeur de la masse déterminée par contraste améliorer l&#39;imagerie par résonance magnétique (figure 1a). Les images TDM et d&#39;IRM ont été co-enregistré sur la base d&#39;une transformation mutuelle de l&#39;information. <img src="/files/ftp_upload/4050/4050fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Rehaussement du contraste (gadolinium) image par résonance magnétique de la tête de la souris (a). La souris a été inoculé avec un U251 orthotopique ligne gliome cellule humaine. L&#39;emplacement de la tumeur, qui absorbe plus de contraste que l&#39;agent le cerveau normal, on peut le voir dans l&#39;hémisphère cérébral gauche (à droite sur l&#39;image) et a indiqué par la flèche blanche. Le corresponding tomodensitométrie d&#39;image (partir du même emplacement sur la tête de la souris) est représenté (b) avec le facteur de croissance épidermique cible de fluorescence moins le superposée de reconstruction non ciblée de fluorescence. Les unités de fluorescence sont en mm inverse et se rapportent au coefficient d&#39;absorption de la fluorescence ciblée liée multiplié par son efficacité quantique et par sa concentration.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Fluorescence tomographie (FT) est une question sensible, les rayonnements ionisants sans modalité d&#39;imagerie moléculaire basée sur le transport de la lumière visible et le proche infrarouge à travers le tissu biologique. La plupart de l&#39;intérêt de FT a été porté sur son potentiel afin d&#39;accélérer la découverte de médicaments et le développement dans de petits animaux modèles expérimentaux 1 et une région clé de la recherche a été l&#39;étude de l&#39;expression des biomarqueurs du cancer et la réponse aux thérapies moléculaires 26. À l&#39;heure actuelle, il existe deux approches concurrentes à la conception du système FT. La conception la plus courante est basée sur refroidis Charge-Coupled Device (CCD) pour la détection par fluorescence 4-9. Ce motif fournit une haute densité de mesures, pour prélever des tissus depuis maximiser chaque pixel dans la caméra CCD peut détecter la lumière qui a parcouru un trajet unique à travers le tissu. Cependant, les caméras CCD ont une gamme dynamique limitée et la lecture de bruit limite leur sensibilité ultime. La deuxième conception évite le potentiel limitation<html> tions de détection caméra CCD en employant la technologie de comptage très sensible à photon unique sur la base de l&#39;utilisation de détecteurs de tels que des tubes photomultiplicateurs ou des photodiodes à avalanche 10-13. L&#39;inconvénient de ces méthodes de détection plus sensibles, c&#39;est que chaque détecteur ne peut recueillir la lumière en un point unique, par conséquent, parvenir à un échantillonnage des tissus denses, soit de nombreux détecteurs doivent être utilisés (ce qui est très cher), ou de nombreuses projections doivent être imagé avec le même détecteur (qui peut prendre beaucoup de temps). Alors que le niveau optimal de prélèvement de tissu pour FT petit animal n&#39;a pas été convenu, et peuvent varier au cas par cas, il est convenu que l&#39;instrumentation de comptage de photon unique est mieux adaptée à explorer les limites de sensibilité de FT en termes de sa capacité à détecter de faibles concentrations de marqueurs moléculaires. Dans cette étude, nous fournissons une méthodologie pour la réalisation de FT en utilisant un seul photon instruments de détection de comptage pour localiser des tumeurs chez la souris. ent &quot;&gt; Il ya quatre étapes essentielles pour produire des ensembles de données impliqués robustes avec le temps-corrélée à photon unique FT comptage. La première est l&#39;application d&#39;une procédure de calibrage approprié et simple. Dans la méthodologie présentée, les sensibilités respectives de chaque canal de détection sont comptabilisés par la collecte de mesures de référence de la lumière d&#39;excitation transmis par le biais d&#39;une ligne-diffuseur destiné à diriger des fractions égales de lumière à chaque détecteur 15. outre, la lumière détectée au cours d&#39;une expérience en continu calibré pour l&#39;laser de référence, en termes de l&#39;intensité et la moyenne . temps, ce qui pourrait fluctuer au fil du temps, par l&#39;opération d&#39;un canal de laser de référence 11,15 La deuxième étape critique est la collecte précise et la co-registration de l&#39;imagerie anatomique pour les reconstructions guidées fluorescence Les données FT offre à lui seul aucune information anatomique.; Par conséquent, afin de créer un modèle de transport de la lumière qui peut être utilisé pour reconstruire le lodes sources de cations fluorescentes dans un échantillon de la fluorescence détectée à la surface de l&#39;échantillon, l&#39;anatomie de l&#39;échantillon par rapport au système FT doit être connue avec précision. Dans notre système, l&#39;information anatomique est acquise par un système de tomographie micro-calculée avec des coordonnées spatiales qui ont été enregistrés dans l&#39;espace avec ceux du système FT 15,20. La troisième étape critique consiste à veiller à ce qu&#39;une exposition optimale (c.-à-temps total de la détection de photons pour chaque projection par laser) est utilisé à chaque position de la source-détecteur. Ceci est important pour deux raisons: premièrement, faire en sorte qu&#39;il y ait suffisamment de signal-bruit à chaque détection de la position et la seconde pour éviter la saturation du détecteur, ce qui pourrait endommager les unités de détection. Pour obtenir une exposition optimale à chaque position du détecteur, un contrôle d&#39;exposition automatique est utilisé, ce qui triangule essentiellement l&#39;exposition optimale à partir de deux, à faible signal de l&#39;exposition 14. La critique quatrièmel&#39;étape de la méthode est référençant les données collectées à fluorescence la quantité de lumière d&#39;excitation émise. Ce référencement est souvent appelé le rapport Né, et offre de nombreux avantages pour FT, dont le principal étant une atténuation des erreurs d&#39;incompatibilité des données du modèle 23,24. Le système présenté a été conçu pour détecter la lumière d&#39;excitation à la fois par fluorescence et transmis simultanément en canalisant la lumière dans chaque canal de détection en 2 tubes photomultiplicateurs distincts. En faisant cela, nous évitons les effets du mouvement sur l&#39;exactitude du ratio de Born. Avec un ensemble de données robuste, il part, la reconstruction d&#39;image de temps-domaine de données implique la résolution du problème inverse de la maillage d&#39;éléments finis ayant l&#39;expression: d = Jx où d est un vecteur de n éléments x m pour n source-détecteur et les projections m TPSF temps barrières; J est un n x m-par-l sensibilité matrice (ou jacobienne), pour les noeuds du maillage l, et x est le vecteur de fluorescence des propriétés optiques dans chaque noeud, ayant une taille L d est les données étalonnées collectées au cours du test et J est simulé en utilisant la solution d&#39;éléments finis. à l&#39;approximation de la diffusion dans le domaine temporel de transport de fluorescence 25. La dimension temps de J est également convolution avec les détecteurs spécifiques fonctions de réponse de l&#39;instrument. X est une représentation de la carte de fluorescence d&#39;intérêt et est résolu pour l&#39;aide d&#39;un Levenberg-Marqardt non négatif au approche carrés avec Tikhonov régularisation 15. La méthodologie présentée ici, qui décrit une procédure capable de localiser les tumeurs marquées par fluorescence dans des souris en utilisant très sensibles à comptage de photons détection par fluorescence, a le potentiel de repousser les limites de FT. Dans une étude précédente, le potentiel de l&#39;utilisation de cetteapproche plus grands que les souris modèles animaux, tels que les rats, ainsi que la sensibilité améliorée par rapport à la conception des systèmes existants chez la souris de la taille des spécimens, a été démontrée 17. L&#39;application immédiate de cette approche serait pour le suivi de l&#39;expression des biomarqueurs in vivo dans des modèles tumoraux de petits animaux pour évaluer l&#39;efficacité des médicaments dans un moyen à haut débit. La capacité du système pour exciter et détecter la fluorescence à des longueurs d&#39;onde multiples permet la détection simultanée de marqueurs fluorescents multiples. D&#39;autres marqueurs fluorescents fournir un moyen d&#39;interroger les multiples aspects d&#39;une pathologie, simultanément, ou pourraient être utilisées, comme dans cette étude, d&#39;employer des méthodes d&#39;imagerie plus quantitatives telles que la double-journaliste méthodes de mesure du potentiel de liaison in vivo, un marqueur de la densité des récepteurs 26,27.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> IRDye 800CW-EGF </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-08446 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647, succinimidyl ester </td><td> Life Technologies </td><td> A20106 </td><td> Mis à réagir avec de l&#39;eau pour minimiser non spécifiques de liaison </td></tr></tbody></table>

computed tomography-guidée tomographie diffuse time-domain fluorescence chez les petits animaux pour la localisation de biomarqueurs du cancer

Computed Tomography-guided Time-domain Diffuse Fluorescence Tomography in Small Animals for Localization of Cancer Biomarkers

Petit animal de fluorescence imagerie moléculaire (FMI) peut être un outil puissant pour la découverte de médicaments précliniques et des études de développement 1. Cependant, l&#39;absorption de lumière par les chromophores tissu (par exemple, l&#39;hémoglobine, l&#39;eau, les lipides, la mélanine) limite généralement de propagation de signal optique à travers des épaisseurs plus grandes que quelques millimètres 2. Comparé à d&#39;autres longueurs d&#39;onde visibles, l&#39;absorption des tissus pour le rouge et le proche infrarouge (IR proche) absorption de la lumière diminue de façon spectaculaire et non-diffusion élastique devient le mécanisme d&#39;interaction dominante lumière des tissus. Le développement relativement récent des agents fluorescents qui absorbent et émettent de la lumière dans le proche-IR (600-1000 nm), a entraîné le développement de systèmes d&#39;imagerie et des modèles de propagation de lumière qui peut atteindre tout le corps en trois dimensions d&#39;imagerie du petit animal 3. Malgré de grands progrès dans ce domaine, la nature mal posé de la tomographie par fluorescence diffuse reste un importantproblème pour la stabilité, la récupération de contraste et la résolution spatiale des techniques de reconstruction d&#39;image et de l&#39;approche optimale pour l&#39;IGF chez les petits animaux doit encore être convenue. La majorité des groupes de recherche ont investi en charge-coupled device (CCD) à base de systèmes qui fournissent en abondance la sensibilité des tissus-échantillonnage, mais sous-optimale 4-9, tandis que notre groupe et quelques autres ont poursuivi 10-13 systèmes basés sur les détecteurs de très haute sensibilité , qui à cette époque permettre l&#39;échantillonnage des tissus denses pour être atteint qu&#39;au prix d&#39;un débit d&#39;imagerie à faible. Ici, nous démontrons la méthodologie pour l&#39;application de la technologie de détection de photon unique dans un système de tomographie de fluorescence pour localiser une lésion cancéreuse au cerveau dans un modèle murin. La fluorescence de positons (FT) système employé comptage de photons uniques utilisant des tubes photomultiplicateurs (PMT) et riche en informations de détection de lumière dans le domaine temporel dans une conformation non-contact 11. Cela fournit un col simultanéelection de l&#39;excitation transmise et l&#39;émission de lumière, et comprend de contrôle automatique de l&#39;exposition d&#39;excitation de fluorescence 14, référencement laser, et co-inscription auprès d&#39;un petit animal calculé la tomographie (microCT) système 15. Un modèle de souris nude a été utilisé pour l&#39;imagerie. L&#39;animal a été inoculé orthotopique avec une lignée cellulaire de gliome humain (U251) dans l&#39;hémisphère cérébral gauche et imagée 2 semaines plus tard. La tumeur a été faite à la fluorescence par injection d&#39;un traceur fluorescent, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) ciblés sur des récepteurs du facteur de croissance épidermique, une protéine de membrane cellulaire connue pour être surexprimé dans la ligne U251 tumeur et de nombreux autres cancers 18. Une seconde, non ciblée traceur fluorescent, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) a également été injecté pour tenir compte des effets induits non-récepteurs sur l&#39;absorption des traceurs ciblés pour fournir un moyen de quantifier liaison traceur et le récepteur de disponibilité / densité 27. Un CT-guidée, time-domaine algorithme a été utilisé pour reconstruire l&#39;emplacement des deux traceurs fluorescents (c.-à-la localisation de la tumeur) dans le cerveau de souris et de leur capacité à localiser la tumeur a été vérifiée par contraste amélioré l&#39;imagerie par résonance magnétique. Bien en évidence pour l&#39;imagerie de fluorescence dans un modèle murin de gliome, la méthodologie présentée dans cette vidéo peut être étendue à différents modèles de tumeurs dans divers modèles animaux de petite taille potentiellement jusqu&#39;à la taille d&#39;un rat 17.

Diffuse la tomographie par fluorescence offre une approche relativement peu coûteux et potentiellement à haut tout au long de préclinique<em&gt; In vivo</emImagerie&gt; tumeur. La méthodologie de la collecte de données optiques, d&#39;étalonnage et de reconstruction d&#39;image est présentée pour une tomodensitométrie-guidée sans contact dans le domaine temporel à l&#39;aide du système de ciblage fluorescente du biomarqueur récepteur épidermique de facteur de croissance tumorale dans un modèle de gliome de la souris.

Computed Tomography-guidée tomographie diffuse Time-Domain Fluorescence chez les petits animaux pour la localisation de biomarqueurs du cancer

L'imagerie moléculaire par fluorescence (FMI) chez les petits animaux peut être un outil puissant pour les études de découverte et de développement de médicaments précliniques1. Cependant, la lumière...

L'objectif général de l'expérience suivante est de produire des images de fluorescence de l'expression du récepteur du facteur de croissance épidermique dans un modèle murin de gliome orthotopique. Cela est réalisé en inoculant l'hémisphère cérébral gauche d'une souris A IIC avec des cellules de gliome humain U2 51 exprimant la protéine verte fluorescente. Après deux semaines de croissance tumorale, la souris reçoit une injection d'un mélange de deux traceurs fluorescents.La souris est ensuite imagée à l’aide d’un système de radiographie pour petits animaux afin de recueillir les données anatomiques nécessaires à une reconstruction précise des images. Ces données servent à positionner anatomiquement la source et à déterminer les emplacements des détecteurs du système de tomographie optique, tandis qu’un logiciel personnalisé est utilisé pour acquérir les données de fluorescence et reconstruire l’image finale. En définitive, cette méthode permet de générer une image d’une tumeur en fonction de sa surexpression du facteur de croissance épidermique, en combinant l’imagerie par fluorescence et l’imagerie radiographique, dont la précision peut être comparée à celle de l’imagerie par résonance magnétique avec produit de contraste.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la tomographie de fluorescence chez les petits animaux basée sur des dispositifs à couplage de charge, réside dans le fait que la détection par comptage de photons uniques à l'aide de tubes photomultiplicateurs offre une sensibilité et une plage dynamique bien plus élevées pour la détection de la lumière. Cette méthode peut en définitive être utilisée pour surveiller et évaluer l'efficacité de thérapies moléculaires en mesurant l'expression de leurs cibles. Bien que les tumeurs sous-cutanées puissent facilement être imagées par des méthodes non tomographiques utilisant l'imagerie de surface, ce système est conçu pour réaliser des images à travers des tissus d'une épaisseur de plusieurs centimètres, ce qui le rend particulièrement adapté à l'imagerie, au contraste, à la délivrance d'agents et à la détection de fuites dans les tumeurs cérébrales.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'expression des biomarqueurs du cancer, elle peut également être appliquée à d'autres études de maladies telles que les infections, l'obésité ou les aspects du vieillissement comme la maladie d'Alzheimer. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés en raison de la nature diffuse de la propagation de la lumière dans les tissus biologiques et de la complexité d'utilisation de la tomographie aux rayons X pour la reconstruction de la lumière diffuse. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle.Étant donné que les étapes de collecte de données et de reconstruction d'images peuvent être difficiles à maîtriser, il est important de s'assurer que les données recueillies à partir du système fluorescent sont correctement étalonnées. Le logiciel quasi rapide a été conçu pour lire les données optiques et utiliser les images de tomographie aux rayons X afin de créer un maillage par éléments finis, qui sert de modèle spatial pour la reconstruction de la fluorescence. Pour commencer, placez une souris nue athymique anesthésiée sur un champ opératoire stérile et vérifiez la profondeur de l'anesthésie avant de procéder ; nettoyez puis désinfectez la peau recouvrant la zone d'incision.À l'aide de Bétadine, placez un champ opératoire stérile sur le site de l'incision. À l'aide d'un scalpel, pratiquez une petite incision légèrement à gauche de la ligne médiane et à 0,5 centimètre en arrière de la ligne intraoculaire. Nettoyez la surface du crâne en éliminant tout tissu conjonctif afin d'identifier les repères anatomiques. Une fois le crâne exposé, utilisez une fraise chirurgicale à grande vitesse équipée d'une mèche stérile d'un millimètre de diamètre pour percer un trou situé à deux millimètres à gauche de la ligne médiane et à deux millimètres en arrière du bgma.Charger une seringue Hamilton Micros munie d'une aiguille 27G à extrémité émoussée avec les cellules à implanter. Ensuite, placer la souris sur un cadre stéréotaxique. Puis confirmer un plan chirurgical et anesthésique profond par une pincée du orteil et remplacer le champ opératoire sur l'animal.Ensuite, fixez la seringue chargée sur le cadre stéréotaxique. Positionnez la seringue au-dessus du trou dans le crâne et insérez la pointe de l'aiguille à trois millimètres sous la surface du crâne. Ensuite, retirez légèrement l'aiguille d'un millimètre afin de créer une poche.L'étape suivante consiste à injecter lentement les cellules dans l'hémisphère cérébral gauche sur une période de cinq minutes. Une fois l'injection terminée, retirer l'aiguille et désinfecter le trou avec de la Bétadine. Afin d'empêcher les cellules de se développer à l'extérieur du site d'injection, retirer la souris du cadre stéréotaxique et combler le trou exposé avec de la cire osseuse préchauffée.Enfin, fermer le site de l'incision avec un fil de suture en nylon stérile 5-0. Retourner la souris dans une cage chauffée et la surveiller jusqu'à son réveil ; après récupération, injecter à la souris 130 microlitres de buprénorphine à 0,1 milligramme par kilogramme par voie intrapéritonéale et laisser la tumeur croître pendant 14 jours avant l'imagerie. Le jour de l'imagerie de la souris, démarrer le système pour permettre aux lasers et aux détecteurs de lumière de chauffer pendant environ 20 minutes.Pour éviter les dérives et la sensibilité du système, placez un diffuseur linéaire conçu de 100 degrés par 4 degrés exactement au centre du portique d'imagerie afin de répartir les lasers d'excitation entre les canaux de détection du système avec une intensité égale. Ajustez manuellement l'angle du diffuseur pour maximiser la quantité de signal détectée par les cinq canaux de collecte de lumière. Placez ensuite la densité optique.Deux filtres de densité neutre placés devant tous les tubes photomultiplicateurs, appelés PMT, destinés à la détection de fluorescence et à la densité optique. Un filtre de densité neutre placé devant toutes les détections de transmission. Les PMT collectent 100 fonctions d'étalement temporel d'impulsion, ou T psfs, du laser, chacune avec un temps d'intégration d'une seconde pour chaque laser successivement, normalisent chaque TPSF par rapport au signal de référence du laser, corrigent la dérive temporelle du signal de référence du laser, puis effectuent une moyenne sur toutes les itérations pour chaque détecteur et chaque laser séparément.Ces TPS moyens sont les fonctions de réponse instrumentale spécifiques au détecteur utilisées dans la reconstruction d'images optiques 12 heures avant la procédure d'imagerie. Injecter au souris témoin un mélange de traceurs fluorescents. L'étalonnage précis du système de tomographie fluorescente et la limitation des mouvements de l'animal sont les aspects les plus difficiles de cette procédure.La reconstruction des images est si mal posée que de légères erreurs lors de la collecte des données peuvent entraîner des erreurs importantes dans l'image reconstruite. Pour garantir une collecte de données précise, nous immobilisons au maximum la souris et répétons l'étalonnage avant et après le balayage afin d'augmenter les chances d'obtenir un étalonnage précis. Lorsque vous êtes prêt, placez l'animal anesthésié sur les supports en fibre de verre du lit d'imagerie.Après avoir positionné la tête dans le cône nasal pour l'anesthésie gazeuse continue, fixez les dents sur la barre de morsure et immobilisez l'animal avec du ruban adhésif. La souris doit être placée approximativement au centre du portique d'imagerie. Ce positionnement peut être guidé en faisant pivoter le laser d'excitation de 180 degrés autour de la souris, en veillant à ce que le point focal du laser éclaire un point situé approximativement au centre de la souris, vu depuis le laser, quel que soit l'angle.Une fois correctement positionné, transférez délicatement le lit d’imagerie et la souris vers le scanner micro-CT et acquérez les informations anatomiques avec une résolution isotrope de 93 micromètres pour l’ensemble de la tête de la souris. Visualisez la série d’images CT et sélectionnez les coupes à imager avec le système de tomographie de fluorescence. Re transférez soigneusement le lit d’imagerie et la souris vers le système de tomographie de fluorescence.Choisissez le nombre de positions de source pour chaque coupe d'imagerie, le temps d'intégration pour chaque mesure de TPSF, le nombre d'itérations pour chaque position de source, ainsi que la position et le nombre de coupes d'imagerie souhaitées à partir de la pile d'images CT créée précédemment. Ensuite, placez des filtres devant les PMT de détection de fluorescence afin de bloquer toute la lumière d'excitation, et utilisez des filtres de densité neutre devant les PMT de détection de transmission. Pour éviter la saturation de ces détecteurs, exécutez le logiciel d'acquisition de données afin d'enregistrer les TPSF de fluorescence et de transmission à chaque position définie entre la source et le détecteur, et ce pour les deux longueurs d'onde d'excitation.Pour chaque série de T psfs collectées, surveillez et enregistrez l'intensité du laser à l'aide d'un canal PMT de référence. Déterminez la surface extérieure de la souris et la position du plateau d'imagerie. Utilisez les tiges de support provenant des images de CT et créez des masques recouvrant les limites de la souris et de la tige d'imagerie.Indépendamment, utilisez le masque de souris pour produire un maillage par éléments finis de l'animal à l'aide du logiciel near fast. Localisez les positions de la source et des détecteurs du système de tomographie de fluorescence à la surface du maillage, selon les coordonnées d'enregistrement spatial issues de la micro-TDM et de la fluorescence. Supprimez les points de données optiques associés aux positions de la source ou des détecteurs qui interagissent avec l'emplacement du plateau d'imagerie.Les tiges de support normalisent les données recueillies à chaque position source-détecteur à l’aide de la référence laser, corrigent la dérive temporelle de la référence laser et tiennent compte des sensibilités des filtres, qui ont été déterminées par des tests expérimentaux au moment de l’achat. Prenez le rapport de Born des données pour chaque position source-détecteur et multipliez-le par une simulation de modèle direct de la transmission, basée sur le maillage animal par éléments finis pour des propriétés optiques uniformes. Ceci permet d’atténuer les erreurs liées au couplage tissulaire de la source ou du détecteur afin de calibrer les données au modèle, d’ajuster les données en fonction d’autres aspects de la discordance entre le modèle et les données, puis de construire un vecteur de données composé de la différence normalisée des données du rapport de Born recueillies aux deux longueurs d’onde.Le facteur d'échelle est choisi afin de maximiser le contraste de liaison de l'EGFR, puis une reconstruction d'image dans le domaine temporel est effectuée à l'aide des données différentielles calibrées en utilisant la TPSF pour chaque canal de détection comme entrée, permettant ainsi de créer des cartes de fluorescence du traceur ciblé rehaussé par contraste observé. Voici un exemple de reconstruction de fluorescence superposée à une image anatomique CT coréenregistrée provenant d'une souris porteuse d'une tumeur orthotopique de gliome U251. Le centre de masse du gliome, déterminé par la reconstruction de fluorescence, se trouvait à moins d'un millimètre du centre de masse de la tumeur déterminé par imagerie par résonance magnétique avec contraste rehaussé.Le logiciel d'acquisition de données est conçu sur mesure pour cet appareil, mais la plupart des techniques de traitement d'images peuvent être effectuées à l'aide du logiciel près fasts disponible sur @nearfasts.org. Ainsi, lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de s'assurer que le système et les données sont correctement étalonnés avant la reconstruction de l'image. Cet étalonnage exige que les différences de sensibilité et temporelles entre les détecteurs soient prises en compte après la reconstruction de l'image d'un traceur ciblant un biomarqueur.L'imagerie similaire d'un traceur non ciblé fournit un moyen de corriger la prise en charge non médiée par les récepteurs. Cela permet de quantifier la quantité de liaison du traceur ainsi que la densité des récepteurs in vivo après son développement. Cette technique a inspiré d'autres chercheurs à concevoir des systèmes d'imagerie tomodensitométrique guidés par fluorescence, ouvrant ainsi la voie à l'imagerie corporelle entière d'animaux de plus grande taille.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une expérience de tomographie de fluorescence diffuse, qui associe un système d'imagerie anatomique par rayons X et un système d'imagerie optique pour l'imagerie de biomarqueurs du cancer.

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Computed Tomography-guidée tomographie diffuse Time-Domain Fluorescence chez les petits animaux pour la localisation de biomarqueurs du cancer (Vidéo) | JoVE Journal

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