Computed Tomography-guidée tomographie diffuse Time-Domain Fluorescence chez les petits animaux pour la localisation de biomarqueurs du cancer

L'objectif général de l'expérience suivante est de produire des images de fluorescence de l'expression du récepteur du facteur de croissance épidermique dans un modèle murin de gliome orthotopique. Cela est réalisé en inoculant l'hémisphère cérébral gauche d'une souris A IIC avec des cellules de gliome humain U2 51 exprimant la protéine verte fluorescente. Après deux semaines de croissance tumorale, la souris reçoit une injection d'un mélange de deux traceurs fluorescents.

La souris est ensuite imagée à l’aide d’un système de radiographie pour petits animaux afin de recueillir les données anatomiques nécessaires à une reconstruction précise des images. Ces données servent à positionner anatomiquement la source et à déterminer les emplacements des détecteurs du système de tomographie optique, tandis qu’un logiciel personnalisé est utilisé pour acquérir les données de fluorescence et reconstruire l’image finale. En définitive, cette méthode permet de générer une image d’une tumeur en fonction de sa surexpression du facteur de croissance épidermique, en combinant l’imagerie par fluorescence et l’imagerie radiographique, dont la précision peut être comparée à celle de l’imagerie par résonance magnétique avec produit de contraste.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la tomographie de fluorescence chez les petits animaux basée sur des dispositifs à couplage de charge, réside dans le fait que la détection par comptage de photons uniques à l'aide de tubes photomultiplicateurs offre une sensibilité et une plage dynamique bien plus élevées pour la détection de la lumière. Cette méthode peut en définitive être utilisée pour surveiller et évaluer l'efficacité de thérapies moléculaires en mesurant l'expression de leurs cibles. Bien que les tumeurs sous-cutanées puissent facilement être imagées par des méthodes non tomographiques utilisant l'imagerie de surface, ce système est conçu pour réaliser des images à travers des tissus d'une épaisseur de plusieurs centimètres, ce qui le rend particulièrement adapté à l'imagerie, au contraste, à la délivrance d'agents et à la détection de fuites dans les tumeurs cérébrales.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'expression des biomarqueurs du cancer, elle peut également être appliquée à d'autres études de maladies telles que les infections, l'obésité ou les aspects du vieillissement comme la maladie d'Alzheimer. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés en raison de la nature diffuse de la propagation de la lumière dans les tissus biologiques et de la complexité d'utilisation de la tomographie aux rayons X pour la reconstruction de la lumière diffuse. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle.

Étant donné que les étapes de collecte de données et de reconstruction d'images peuvent être difficiles à maîtriser, il est important de s'assurer que les données recueillies à partir du système fluorescent sont correctement étalonnées. Le logiciel quasi rapide a été conçu pour lire les données optiques et utiliser les images de tomographie aux rayons X afin de créer un maillage par éléments finis, qui sert de modèle spatial pour la reconstruction de la fluorescence. Pour commencer, placez une souris nue athymique anesthésiée sur un champ opératoire stérile et vérifiez la profondeur de l'anesthésie avant de procéder ; nettoyez puis désinfectez la peau recouvrant la zone d'incision.

À l'aide de Bétadine, placez un champ opératoire stérile sur le site de l'incision. À l'aide d'un scalpel, pratiquez une petite incision légèrement à gauche de la ligne médiane et à 0,5 centimètre en arrière de la ligne intraoculaire. Nettoyez la surface du crâne en éliminant tout tissu conjonctif afin d'identifier les repères anatomiques. Une fois le crâne exposé, utilisez une fraise chirurgicale à grande vitesse équipée d'une mèche stérile d'un millimètre de diamètre pour percer un trou situé à deux millimètres à gauche de la ligne médiane et à deux millimètres en arrière du bgma.

Charger une seringue Hamilton Micros munie d'une aiguille 27G à extrémité émoussée avec les cellules à implanter. Ensuite, placer la souris sur un cadre stéréotaxique. Puis confirmer un plan chirurgical et anesthésique profond par une pincée du orteil et remplacer le champ opératoire sur l'animal.

Ensuite, fixez la seringue chargée sur le cadre stéréotaxique. Positionnez la seringue au-dessus du trou dans le crâne et insérez la pointe de l'aiguille à trois millimètres sous la surface du crâne. Ensuite, retirez légèrement l'aiguille d'un millimètre afin de créer une poche.

L'étape suivante consiste à injecter lentement les cellules dans l'hémisphère cérébral gauche sur une période de cinq minutes. Une fois l'injection terminée, retirer l'aiguille et désinfecter le trou avec de la Bétadine. Afin d'empêcher les cellules de se développer à l'extérieur du site d'injection, retirer la souris du cadre stéréotaxique et combler le trou exposé avec de la cire osseuse préchauffée.

Enfin, fermer le site de l'incision avec un fil de suture en nylon stérile 5-0. Retourner la souris dans une cage chauffée et la surveiller jusqu'à son réveil ; après récupération, injecter à la souris 130 microlitres de buprénorphine à 0,1 milligramme par kilogramme par voie intrapéritonéale et laisser la tumeur croître pendant 14 jours avant l'imagerie. Le jour de l'imagerie de la souris, démarrer le système pour permettre aux lasers et aux détecteurs de lumière de chauffer pendant environ 20 minutes.

Pour éviter les dérives et la sensibilité du système, placez un diffuseur linéaire conçu de 100 degrés par 4 degrés exactement au centre du portique d'imagerie afin de répartir les lasers d'excitation entre les canaux de détection du système avec une intensité égale. Ajustez manuellement l'angle du diffuseur pour maximiser la quantité de signal détectée par les cinq canaux de collecte de lumière. Placez ensuite la densité optique.

Deux filtres de densité neutre placés devant tous les tubes photomultiplicateurs, appelés PMT, destinés à la détection de fluorescence et à la densité optique. Un filtre de densité neutre placé devant toutes les détections de transmission. Les PMT collectent 100 fonctions d'étalement temporel d'impulsion, ou T psfs, du laser, chacune avec un temps d'intégration d'une seconde pour chaque laser successivement, normalisent chaque TPSF par rapport au signal de référence du laser, corrigent la dérive temporelle du signal de référence du laser, puis effectuent une moyenne sur toutes les itérations pour chaque détecteur et chaque laser séparément.

Ces TPS moyens sont les fonctions de réponse instrumentale spécifiques au détecteur utilisées dans la reconstruction d'images optiques 12 heures avant la procédure d'imagerie. Injecter au souris témoin un mélange de traceurs fluorescents. L'étalonnage précis du système de tomographie fluorescente et la limitation des mouvements de l'animal sont les aspects les plus difficiles de cette procédure.

La reconstruction des images est si mal posée que de légères erreurs lors de la collecte des données peuvent entraîner des erreurs importantes dans l'image reconstruite. Pour garantir une collecte de données précise, nous immobilisons au maximum la souris et répétons l'étalonnage avant et après le balayage afin d'augmenter les chances d'obtenir un étalonnage précis. Lorsque vous êtes prêt, placez l'animal anesthésié sur les supports en fibre de verre du lit d'imagerie.

Après avoir positionné la tête dans le cône nasal pour l'anesthésie gazeuse continue, fixez les dents sur la barre de morsure et immobilisez l'animal avec du ruban adhésif. La souris doit être placée approximativement au centre du portique d'imagerie. Ce positionnement peut être guidé en faisant pivoter le laser d'excitation de 180 degrés autour de la souris, en veillant à ce que le point focal du laser éclaire un point situé approximativement au centre de la souris, vu depuis le laser, quel que soit l'angle.

Une fois correctement positionné, transférez délicatement le lit d’imagerie et la souris vers le scanner micro-CT et acquérez les informations anatomiques avec une résolution isotrope de 93 micromètres pour l’ensemble de la tête de la souris. Visualisez la série d’images CT et sélectionnez les coupes à imager avec le système de tomographie de fluorescence. Re transférez soigneusement le lit d’imagerie et la souris vers le système de tomographie de fluorescence.

Choisissez le nombre de positions de source pour chaque coupe d'imagerie, le temps d'intégration pour chaque mesure de TPSF, le nombre d'itérations pour chaque position de source, ainsi que la position et le nombre de coupes d'imagerie souhaitées à partir de la pile d'images CT créée précédemment. Ensuite, placez des filtres devant les PMT de détection de fluorescence afin de bloquer toute la lumière d'excitation, et utilisez des filtres de densité neutre devant les PMT de détection de transmission. Pour éviter la saturation de ces détecteurs, exécutez le logiciel d'acquisition de données afin d'enregistrer les TPSF de fluorescence et de transmission à chaque position définie entre la source et le détecteur, et ce pour les deux longueurs d'onde d'excitation.

Pour chaque série de T psfs collectées, surveillez et enregistrez l'intensité du laser à l'aide d'un canal PMT de référence. Déterminez la surface extérieure de la souris et la position du plateau d'imagerie. Utilisez les tiges de support provenant des images de CT et créez des masques recouvrant les limites de la souris et de la tige d'imagerie.

Indépendamment, utilisez le masque de souris pour produire un maillage par éléments finis de l'animal à l'aide du logiciel near fast. Localisez les positions de la source et des détecteurs du système de tomographie de fluorescence à la surface du maillage, selon les coordonnées d'enregistrement spatial issues de la micro-TDM et de la fluorescence. Supprimez les points de données optiques associés aux positions de la source ou des détecteurs qui interagissent avec l'emplacement du plateau d'imagerie.

Les tiges de support normalisent les données recueillies à chaque position source-détecteur à l’aide de la référence laser, corrigent la dérive temporelle de la référence laser et tiennent compte des sensibilités des filtres, qui ont été déterminées par des tests expérimentaux au moment de l’achat. Prenez le rapport de Born des données pour chaque position source-détecteur et multipliez-le par une simulation de modèle direct de la transmission, basée sur le maillage animal par éléments finis pour des propriétés optiques uniformes. Ceci permet d’atténuer les erreurs liées au couplage tissulaire de la source ou du détecteur afin de calibrer les données au modèle, d’ajuster les données en fonction d’autres aspects de la discordance entre le modèle et les données, puis de construire un vecteur de données composé de la différence normalisée des données du rapport de Born recueillies aux deux longueurs d’onde.

Le facteur d'échelle est choisi afin de maximiser le contraste de liaison de l'EGFR, puis une reconstruction d'image dans le domaine temporel est effectuée à l'aide des données différentielles calibrées en utilisant la TPSF pour chaque canal de détection comme entrée, permettant ainsi de créer des cartes de fluorescence du traceur ciblé rehaussé par contraste observé. Voici un exemple de reconstruction de fluorescence superposée à une image anatomique CT coréenregistrée provenant d'une souris porteuse d'une tumeur orthotopique de gliome U251. Le centre de masse du gliome, déterminé par la reconstruction de fluorescence, se trouvait à moins d'un millimètre du centre de masse de la tumeur déterminé par imagerie par résonance magnétique avec contraste rehaussé.

Le logiciel d'acquisition de données est conçu sur mesure pour cet appareil, mais la plupart des techniques de traitement d'images peuvent être effectuées à l'aide du logiciel près fasts disponible sur @nearfasts.org. Ainsi, lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de s'assurer que le système et les données sont correctement étalonnés avant la reconstruction de l'image. Cet étalonnage exige que les différences de sensibilité et temporelles entre les détecteurs soient prises en compte après la reconstruction de l'image d'un traceur ciblant un biomarqueur.

L'imagerie similaire d'un traceur non ciblé fournit un moyen de corriger la prise en charge non médiée par les récepteurs. Cela permet de quantifier la quantité de liaison du traceur ainsi que la densité des récepteurs in vivo après son développement. Cette technique a inspiré d'autres chercheurs à concevoir des systèmes d'imagerie tomodensitométrique guidés par fluorescence, ouvrant ainsi la voie à l'imagerie corporelle entière d'animaux de plus grande taille.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une expérience de tomographie de fluorescence diffuse, qui associe un système d'imagerie anatomique par rayons X et un système d'imagerie optique pour l'imagerie de biomarqueurs du cancer.