Computed Tomography-guidée tomographie diffuse Time-Domain Fluorescence chez les petits animaux pour la localisation de biomarqueurs du cancer

L’objectif général de l’expérience suivante est de produire des images de fluorescence de l’expression du récepteur du facteur de croissance épidermique dans un modèle murin de gliome orthotopique. Ceci est réalisé en inoculant l’hémisphère cérébral gauche d’une souris A IIC avec une protéine fluorescente verte exprimant des cellules de gliome humain U2 51. Après que la tumeur se soit développée pendant deux semaines, la souris est injectée avec un cocktail de deux traceurs fluorescents.

La souris est ensuite imagée sur un système de radiographie de petits animaux afin de recueillir les données anatomiques nécessaires à la reconstruction précise de l’image. Les données sont utilisées pour positionner anatomiquement la source et détecter les emplacements du système de tomographie optique, et un logiciel personnalisé est utilisé pour collecter les données de fluorescence et construire l’image finale. En fin de compte, cette méthode peut construire une image d’une tumeur basée sur sa surexpression du facteur de croissance épidermique en utilisant à la fois l’imagerie par fluorescence et par rayons X, dont la précision peut être comparée à l’imagerie par résonance magnétique avec contraste amélioré.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la tomographie par fluorescence de petits animaux à couple de charge est que la détection par comptage de photons uniques à l’aide de tubes photomultiplicateurs photo offre une sensibilité et une plage dynamique beaucoup plus élevées pour la détection de la lumière. Cette méthode peut finalement être utilisée pour surveiller, évaluer le succès des thérapies moléculaires en mesurant l’expression de leurs cibles, tandis que les tumeurs sous-cutanées sont facilement imagées avec des méthodes non tomographiques utilisant l’imagerie de surface. Ce système est conçu pour imager à travers des tissus jusqu’à plusieurs centimètres d’épaisseur, ce qui le rend particulièrement bien adapté à l’image, au contraste, à l’administration d’agents et aux fuites dans les tumeurs cérébrales.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’expression des biomarqueurs du cancer, elle peut également être appliquée à d’autres études de maladies telles que l’infection, l’obésité ou des éléments du vieillissement tels que la maladie d’Alzheimer. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à se frayer un chemin en raison de la nature diffuse de la propagation de la lumière dans les tissus biologiques et de la difficulté d’utiliser la tomographie à rayons X pour la reconstruction de la lumière diffuse. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle.

Comme les étapes de collecte de données et de reconstruction d’images peuvent être difficiles à apprendre, il est important de s’assurer que les données collectées à partir du système fluorescent sont bien calibrées. Le progiciel presque rapide avait été conçu pour lire les données optiques et utiliser les images de tomographie à rayons X pour créer un maillage d’éléments finis, qui est utilisé comme modèle spatial pour la reconstruction de la fluorescence. Pour commencer, placez une souris nue athymique anesthésiée sur un champ chirurgical stérile et confirmez la profondeur de l’anesthésie avant de procéder au nettoyage et à la désinfection de la peau sur la zone d’incision.

À l’aide de la bétadine, placez un champ chirurgical stérile sur le site d’incision à l’aide d’un scalpel, faites une petite incision légèrement à gauche de la ligne médiane et à 0,5 centimètre en arrière de la ligne intraoculaire. Nettoyez la surface du crâne en enlevant tout tissu conjonctif afin que les points de repère puissent être identifiés. Une fois le crâne exposé, utilisez une perceuse à grande vitesse avec un embout stérile d’un millimètre pour faire un trou à deux millimètres à gauche de la ligne centrale et à deux millimètres derrière le bgma.

Chargez une seringue Hamilton Micros avec une aiguille de calibre 27 à extrémité émoussée avec les cellules à implanter. Ensuite, placez la souris sur un cadre stéréotaxique. Confirmez ensuite un plan chirurgical et esthétique profond avec un pincement de l’orteil et replacez le champ chirurgical sur l’animal.

Ensuite, fixez la seringue chargée sur le cadre stéréotaxique. Placez la seringue sur le trou du crâne et insérez la pointe de l’aiguille à trois millimètres sous la surface du crâne. Ensuite, retirez l’aiguille d’un millimètre pour créer une poche.

L’étape suivante consiste à injecter lentement les cellules dans l’hémisphère cérébral gauche sur une période de cinq minutes. Une fois l’injection terminée, retirez l’aiguille et tamponnez le trou avec de la bétadine. Pour empêcher les cellules de se développer à l’extérieur du site d’injection, retirez la souris du cadre stéréotaxique et remplissez le trou exposé avec de la cire osseuse préchauffée.

Enfin, fermez le site d’incision avec une suture stérile en nylon. Remettez la souris dans une cage chauffée et surveillez-la jusqu’à ce qu’elle soit récupérée après la récupération, injectez à la souris 130 microlitres de buprénorphine IP de 0,1 milligramme par kilogramme et laissez la tumeur se développer pendant 14 jours avant l’imagerie. Le jour de l’imagerie de la souris, lancez le système pour permettre aux lasers et aux détecteurs de lumière de se réchauffer pendant environ 20 minutes.

Pour éviter les dérives et la sensibilité du système, placez un diffuseur de lignes de 100 degrés sur quatre degrés au centre direct du portique d’imagerie pour disperser les lasers d’excitation entre les canaux de détection du système avec une intensité égale. Ajustez l’angle du diffuseur à la main pour maximiser la quantité de signal détectée par les cinq canaux de collecte de lumière. Vient ensuite la densité optique.

Deux filtres de densité neutre devant tous les tubes photomultiplicateurs de détection de fluorescence appelés PMT et densité optique. Un filtre de densité neutre devant toutes les détections de transmittance. Les PMT collectent 100 fonctions de propagation d’impulsion temporelle ou T psfs du laser, chacune avec un temps d’intégration d’une seconde pour chaque laser de manière séquentielle, normalisent chaque TPSF par la référence laser, corrigent la dérive temporelle de la référence laser et font la moyenne de toutes les itérations pour chaque détecteur et chaque laser séparément.

Ces TPS moyens sont les fonctions de réponse de l’instrument spécifiques au détecteur utilisées dans la reconstruction optique de l’image 12 heures avant la procédure d’imagerie. Injectez à la souris de test un cocktail de traceurs fluorescents. L’étalonnage précis du système de tomographie fluorescente et la limitation des mouvements des animaux sont les aspects les plus difficiles de cette procédure.

La reconstruction de l’imagerie est si mal posée que même de légères erreurs dans la collecte des données peuvent entraîner des erreurs importantes dans l’image reconstruite. Pour garantir la collecte de données précises, nous immobilisons la souris du mieux possible et répétons l’étalonnage avant et après le balayage pour améliorer les chances d’obtenir un étalonnage précis lorsque vous êtes prêt. Placez l’animal anesthésié sur les supports en fibre de verre du lit d’imagerie.

Après avoir positionné la tête dans le cône nasal pour une anesthésie gazeuse continue, fixez les dents sur la barre de morsure et collez l’animal. La souris doit être placée à peu près au centre du portique d’imagerie. Ce positionnement peut être guidé en faisant pivoter le laser d’excitation de 180 degrés autour de la souris, en veillant à ce que le point focal du laser éclaire un point à peu près au centre de la souris du point de vue du laser sous tous les angles.

Une fois correctement positionné, transférez soigneusement le lit d’imagerie et la souris dans le scanner micro CT et collectez des informations anatomiques à une résolution isotrope de 93 micromètres pour toute la tête de la souris. Visualisez la pile d’images CT et choisissez les coupes à imager avec le système de tomographie à fluorescence. Transférez avec précaution le lit d’imagerie et la souris dans le système de tomographie à fluorescence.

Choisissez le nombre de positions de source pour chaque tranche d’imagerie, le temps d’intégration pour chaque mesure TPSF, le nombre d’itérations pour chaque position de source, ainsi que la position et le nombre de tranches d’imagerie souhaitées à partir de la pile d’images CT créée précédemment. Ensuite, placez les filtres devant les PMT de détection de fluorescence pour bloquer toute la lumière d’excitation et la densité optique des filtres de densité neutre devant les PMT de détection de transmittance. Pour éviter la saturation de ces détecteurs, exécutez le logiciel d’acquisition de données collectant la fluorescence et la transmittance t psfs à chaque position définie du détecteur de source aux deux longueurs d’onde d’excitation.

Pour chaque ensemble de T psfs collecté, surveillez et enregistrez l’intensité laser avec un canal PMT de référence. Déterminez la surface extérieure de la souris et l’emplacement du lit d’imagerie. Soutenez les tiges des images CT et créez des masques qui couvrent les limites de la souris et de la tige d’imagerie.

Séparément, utilisez le masque de souris pour produire un maillage d’éléments finis de l’animal à l’aide du logiciel presque rapide. Localisez les positions de la source et du détecteur à partir du système de tomographie à fluorescence à la surface du maillage sur la base des coordonnées de recalage spatial micro CT et fluorescent. Supprimez les points de données optiques associés aux positions de la source ou du détecteur qui interagissent avec l’emplacement du lit d’imagerie.

Les tiges de support normalisent les données recueillies à chaque position du détecteur source par la référence laser, corrigent la dérive temporelle de la référence laser et corrigent les sensibilités des filtres, qui ont été déterminées par des essais expérimentaux au moment de l’achat. Prenez le rapport de naissance des données pour chaque position du détecteur de source et multipliez-le par une simulation de modèle direct de transmittance basée sur le maillage animal par éléments finis pour des propriétés optiques uniformes. Ceci est fait pour atténuer les erreurs associées au couplage tissulaire source ou détecteur afin d’étalonner les données au modèle et d’ajuster les données pour d’autres aspects de l’inadéquation des données du modèle Construire un vecteur de données composé de la différence d’échelle des données de rapport de naissance collectées aux deux longueurs d’onde.

Le facteur d’échelle est choisi pour maximiser le contraste de liaison EGFR, effectuer la reconstruction d’images dans le domaine temporel avec les données de différence calibrées en utilisant le TPSF pour chaque canal de détection en entrée et créer des cartes de fluorescence du traceur ciblé à contraste amélioré observé. Voici un exemple de reconstruction par fluorescence superposée à une image anatomique CT co-enregistrée d’une souris atteinte d’une tumeur de gliome orthotopique U2 51. Le centre de masse du gliome déterminé par la reconstruction par fluorescence se trouvait à moins d’un millimètre du centre de masse de la tumeur, déterminé par imagerie par résonance magnétique assistée par contraste.

Le logiciel d’acquisition de données est conçu sur mesure pour cet appareil, mais la plupart des techniques de traitement d’images peuvent être effectuées à l’aide du logiciel Near Fasts available@nearfasts.org. Ainsi, lors de la tentative de cette procédure, il est important de s’assurer que le système et les données sont calibrés avec précision avant la reconstruction de l’image. Cet étalonnage nécessite que la sensibilité et les différences temporelles entre les détecteurs soient prises en compte Suite à la reconstruction de l’image d’un traceur ciblé biomarqueur.

Une imagerie similaire d’un traceur non ciblé fournit un moyen de corriger l’absorption non médiée par le récepteur. Cela permet de quantifier la quantité de liaison au traceur ainsi que la densité du récepteur in vivo après son développement. Cette technique a inspiré d’autres chercheurs à concevoir des systèmes de tomographie à fluorescence guidée par imagerie par rayons X et a ouvert la voie à l’imagerie du corps entier d’animaux plus grands.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la réalisation d’une expérience de tomographie à fluorescence diffuse, qui combine l’imagerie anatomique par rayons X et les systèmes d’imagerie optique pour l’imagerie des biomarqueurs du cancer.