Tomographie médiée par fluorescence pour la détection et la Quantification de l’Inflammation intestinale Murine axés sur les macrophages

L’objectif global de cette approche d’imagerie in vivo spécifique à la cible est de visualiser les marqueurs moléculaires de l’activité de la maladie dans les maladies inflammatoires de l’intestin. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies inflammatoires de l’intestin et à la recherche thérapeutique connexe sur l’influence de thérapies expérimentales ou d’événements cellulaires spécifiques sur l’inflammation. Le principal avantage de cette technique est que l’activité de la maladie peut être surveillée longitudinalement et de manière non invasive.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des troubles inflammatoires, elle peut également être appliquée à l’étude d’autres maladies, telles que le cancer ou les maladies liées au système immunitaire. Pour induire la colite, remplissez l’approvisionnement en eau des souris expérimentales avec deux grammes de sulfate de sodium de dextran, ou DSS, dissous dans 100 millilitres d’eau potable autoclave, en estimant à cinq millilitres d’eau par souris et par jour. 24 heures avant l’examen, chargez le cocktail d’anticorps d’intérêt dans une seringue stérile à l’abri de la lumière et injectez les anticorps par voie intraveineuse dans les veines de la queue des animaux de laboratoire.

Le jour de l’expérience, utilisez un rasoir électrique pour raser la fourrure dans la région abdominale des animaux de laboratoire afin de minimiser la réflexion et l’absorption de la lumière. À l’aide d’un fantôme imitant les tissus d’une épaisseur et de caractéristiques d’absorption définies, remplissez le fantôme avec un volume spécifique de la solution d’anticorps d’intérêt et mesurez la fluorescence sur le dispositif FMT. Ensuite, sur un appareil de tomographie par fluorescence vétérinaire ou FMT pour petits animaux, cliquez sur Nouvelle étude et incluez les traceurs pertinents dans la description de l’étude, y compris les paramètres d’imagerie et les doses.

Créez des groupes d’étude selon le plan d’expérience, en équipant chaque groupe du nombre approprié d’animaux. Lorsque le système a été calibré pour les constructions du traceur, placez la première souris anesthésiée en position couchée dans une cassette d’examen chauffante à 42 degrés Celsius. Insérez la cassette dans le système d’imagerie et sélectionnez l’échantillon approprié dans le groupe d’étude correspondant.

Sélectionnez le traceur administré pour vous assurer que les valeurs de la concentration du traceur sont correctement calculées et acquérez l’image de réflectance de fluorescence à la longueur d’onde appropriée pour le balayage. Cliquez sur Acquérir l’image pour tracer le contour du champ de balayage et vérifier que le champ de balayage apparaît en superposition sur l’image de réflectance de fluorescence. Ajustez le champ de balayage jusqu’à ce qu’il entoure la région d’intérêt, en prenant soin d’éviter les erreurs ou les zones de fourrure restantes.

En fonction de la cible de l’image, sélectionnez la résolution d’un champ de balayage pour définir le nombre de points de données d’image dans le champ de balayage. Cliquez ensuite sur Scanner pour commencer l’acquisition de l’image à la longueur d’onde sélectionnée. À la fin du scan, retirez l’animal de la cassette pour lui permettre de se rétablir complètement grâce à la surveillance avant de retourner dans sa cage.

La FMT peut ensuite être répétée à différents moments si cela est approprié sur le plan expérimental. Pour analyser les images acquises, ouvrez le logiciel d’analyse d’image approprié et sélectionnez les données brutes pour le premier balayage. À l’aide de l’outil de reconstruction, créez des cartes 3D de la distribution de la fluorescence.

Une fois que tous les balayages ont été ajoutés à l’ensemble de données de reconstruction approprié, ouvrez le premier ensemble de données qui vous intéresse. Tous les scans effectués pour l’animal de laboratoire individuel sélectionné seront montrés. Sélectionnez l’analyse appropriée et cliquez sur Charger.

Une reconstruction 3D de la distribution du traceur apparaîtra sous la forme d’une superposition de l’image de réflectance de fluorescence initialement acquise. Ensuite, identifiez les foyers d’accumulation d’étiquettes non spécifiques sur les cartes 3D reconstruites et utilisez l’outil de mesure pour sélectionner la région d’intérêt. Le logiciel générera ensuite une intensité de fluorescence pour la région d’intérêt, ainsi que des mesures de quantité picomolaire du traceur pour lequel le balayage a été calibré.

Dans cette expérience, un anticorps conjugué à la fluorescence contre la souris F4/80 a été utilisé pour visualiser directement les macrophages activés. Une accumulation significativement élevée de traceur fluorescent a été mesurée par tomographie médiée par fluorescence dans les côlons des souris colitiques par rapport aux animaux témoins non colitiques, indiquant une augmentation de l’infiltration des monocytes et de la différenciation en macrophages actifs chez les animaux colitiques. À l’inverse, l’application d’un anticorps IgG conjugué à la fluorescence non spécifique n’a pas provoqué de réponse de fluorescence détectable dans l’abdomen ou l’intestin dans le groupe témoin colitique ou non colitique, démontrant la spécificité de l’interaction sonde-cible de l’anticorps F4/80.

Les mesures ex vivo de l’accumulation de traceurs dirigée F4/80 dans les côlons explantés vérifient davantage l’origine colique de l’accumulation de signaux traceurs F4/80 détectée in vivo. En effet, les quantités calculées d’anticorps liés sont bien corrélées avec les nombres histologiquement déterminés de macrophages infiltrants, ce qui confirme que l’imagerie in vivo avec des traceurs spécifiques peut être indicative de l’activité locale de la maladie. Une fois maîtrisé, cela peut être effectué et analysé en quelques minutes s’il est effectué correctement.

Les étapes de préparation, y compris la production de traceurs spécifiques à base d’anticorps, prennent généralement deux à trois jours. Lors de la planification d’une procédure expérimentale comme celle-ci, il est important d’inclure des contrôles appropriés et fiables, tant pour l’anticorps que pour le modèle de maladie animale. Suite à cette procédure, d’autres méthodes, comme la coloscopie ou la cytométrie en flux, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires et pour valider et quantifier les données.