Tomographie médiée par fluorescence pour la détection et la Quantification de l’Inflammation intestinale Murine axés sur les macrophages
15 décembre 2017
Spécifique à la cible sondes représentent un outil innovant pour l’analyse des mécanismes moléculaires, comme expression de la protéine dans divers types de maladie (p. ex., inflammation, infection et tumorigenèse). Dans cette étude, les auteurs décrivent une évaluation quantitative de tomographie tridimensionnelle d’infiltration de macrophages intestinaux dans un modèle murin de colite en utilisant la tomographie de F4/80-spécifique induite par fluorescence.
L'objectif général de cette approche d'imagerie in vivo ciblée est de visualiser les marqueurs moléculaires de l'activité de la maladie dans la maladie inflammatoire de l'intestin. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la maladie inflammatoire de l'intestin et à la recherche thérapeutique associée, notamment concernant l'influence de traitements expérimentaux ou d'événements cellulaires spécifiques sur l'inflammation. Le principal avantage de cette technique est que l'activité de la maladie peut être surveillée de manière longitudinale et non invasive.
Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les troubles inflammatoires, elle peut également être appliquée à l'étude d'autres maladies, telles que le cancer ou les maladies liées au système immunitaire. Pour induire une colite, remplissez la réserve d'eau potable des souris expérimentales avec deux grammes de sulfate de dextrane sodique, ou DSS, dissous dans 100 millilitres d'eau potable stérilisée par autoclavage, en estimant cinq millilitres d'eau par souris et par jour. 24 heures avant l'analyse, chargez le cocktail d'anticorps d'intérêt dans une seringue stérile protégée de la lumière et injectez les anticorps par voie intraveineuse dans les veines de la queue des animaux expérimentaux.
Le jour de l'expérience, utilisez un rasoir électrique pour raser le pelage dans la région abdominale des animaux expérimentaux afin de minimiser la réflexion et l'absorption de la lumière. À l'aide d'un fantôme imitant les tissus, de taille définie et aux caractéristiques d'absorption connues, remplissez le fantôme avec un volume précis de la solution d'anticorps d'intérêt et mesurez la fluorescence sur l'appareil de tomographie à fluorescence. Ensuite, sur un appareil de tomographie à fluorescence vétérinaire, ou appareil FMT pour petits animaux, cliquez sur Nouvelle étude et incluez les traceurs pertinents dans la description de l'étude, y compris les paramètres d'imagerie et les doses.
Créez des groupes d'étude conformément au plan expérimental, en équipant chaque groupe du nombre approprié d'animaux. Une fois le système calibré pour les constructions marqueurs, placez la première souris anesthésiée en position dorsale dans une cassette d'examen chauffante réglée à 42 degrés Celsius. Insérez la cassette dans le système d'imagerie et sélectionnez l'échantillon approprié dans le groupe d'étude correspondant.
Sélectionnez le traceur administré afin de garantir un calcul correct des valeurs de concentration du traceur, puis acquérez l'image de réflectance de fluorescence à la longueur d'onde appropriée pour le balayage. Cliquez sur Acquérir l'image pour délimiter le champ de balayage et vérifiez que ce champ apparaît en superposition sur l'image de réflectance de fluorescence. Ajustez le champ de balayage jusqu'à ce qu'il entoure la région d'intérêt, en prenant soin d'éviter toute erreur ou les zones où subsiste du poil.
En fonction de la cible de l'image, sélectionnez une résolution du champ de balayage afin de définir le nombre de points de données d'image dans ce champ. Cliquez ensuite sur Balayer pour commencer l'acquisition d'image à la longueur d'onde sélectionnée. À la fin du balayage, retirez l'animal de la cassette afin de permettre à l'animal de se rétablir complètement sous surveillance avant de le ramener à sa cage.
Le TFM peut ensuite être répété à différents moments selon les besoins expérimentaux. Pour analyser les images acquises, ouvrez le logiciel d'analyse d'images approprié et sélectionnez les données brutes du premier balayage. À l'aide de l'outil de reconstruction, créez des cartes 3D de la distribution de la fluorescence.
Lorsque tous les scans ont été ajoutés au jeu de données de reconstruction approprié, ouvrez le premier jeu de données d'intérêt. Tous les scans effectués pour l'animal expérimental sélectionné seront affichés. Sélectionnez le scan approprié et cliquez sur Charger.
Une reconstruction 3D de la distribution du traceur apparaîtra en superposition de l'image de réflectance de fluorescence initialement acquise. Ensuite, identifiez les foyers d'accumulation non spécifique du marqueur sur les cartes 3D reconstruites et utilisez l'outil de mesure pour sélectionner la région d'intérêt. Le logiciel générera alors l'intensité de fluorescence pour la région d'intérêt, ainsi que des mesures en picomoles du traceur pour lequel le balayage a été calibré.
Dans cette expérience, un anticorps marqué par un fluorochrome dirigé contre la protéine murine F4/80 a été utilisé afin de visualiser directement les macrophages activés. Une accumulation significativement accrue de traceur fluorescent a été mesurée par tomographie à fluorescence dans les côlons de souris colitiques par rapport aux animaux contrôles non colitiques, indiquant une augmentation de l'infiltration de monocytes et de leur différenciation en macrophages actifs chez les animaux colitiques. En revanche, l'application d'un anticorps IgG marqué par un fluorochrome non spécifique n'a pas provoqué de réponse fluorescente détectable dans l'abdomen ou l'intestin, ni dans le groupe colitique ni dans le groupe contrôle non colitique, démontrant ainsi la spécificité de l'interaction sonde-cible de l'anticorps anti-F4/80.
Les mesures ex vivo de l'accumulation du traceur dirigé contre F4/80 dans les côlons prélevés confirment davantage l'origine colique de l'accumulation du signal du traceur F4/80 détectée in vivo. En effet, les quantités calculées d'anticorps liés corrélaient bien avec le nombre de macrophages infiltrants déterminé histologiquement, confirmant ainsi que l'imagerie in vivo avec des traceurs spécifiques peut être indicative de l'activité locale de la maladie. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée et analysée en quelques minutes si elle est effectuée correctement.
Les étapes de préparation, y compris la production de traceurs spécifiques à base d'anticorps, prennent généralement deux à trois jours. Lors de la planification d'une procédure expérimentale telle que celle-ci, il est important d'inclure des contrôles appropriés et fiables, tant pour l'anticorps que pour le modèle animal de maladie. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme la coloscopie ou la cytométrie en flux, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires et de valider ainsi que de quantifier les données.
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Aperçu
Cette étude présente une approche d'imagerie in vivo ciblée permettant de visualiser les marqueurs moléculaires de l'activité de la maladie dans la maladie inflammatoire de l'intestin. En utilisant une évaluation tomographique quantitative en trois dimensions, la recherche se concentre sur l'infiltration des macrophages intestinaux dans un modèle murin de colite.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Immunologie
- Maladie inflammatoire de l'intestin
Contexte
- Les sondes spécifiques à la cible sont des outils innovants pour analyser les mécanismes moléculaires.
- Elles peuvent être utilisées pour étudier l'expression des protéines dans diverses maladies.
- Cette méthode permet une surveillance longitudinale et non invasive de l'activité de la maladie.
- Elle peut être appliquée aux troubles inflammatoires, au cancer et aux maladies liées au système immunitaire.
Objectif de l'étude
- Visualiser les marqueurs moléculaires de l'activité de la maladie dans les maladies inflammatoires de l'intestin.
- Répondre à des questions clés en recherche thérapeutique liées à l'inflammation.
- Évaluer l'influence de thérapeutiques expérimentales sur l'inflammation.
Méthodes utilisées
- Induction de la colite à l'aide de sulfate de dextrane sodique (DSS).
- Administration intraveineuse d'un cocktail d'anticorps chez des souris expérimentales.
- Tomographie par fluorescence pour l'imagerie de l'infiltration des macrophages.
- Surveillance longitudinale de l'activité de la maladie in vivo.
Résultats principaux
- Visualisation réussie de l'infiltration des macrophages intestinaux.
- Démonstration de la capacité à surveiller l'activité de la maladie de manière non invasive.
- Apport de connaissances sur la dynamique de l'inflammation dans la colite.
- Identification de potentialités d'applications pour l'étude d'autres maladies.
Conclusions
- L'approche d'imagerie spécifique à la cible est efficace pour l'étude de la maladie inflammatoire de l'intestin.
- Cette méthode peut améliorer la compréhension des mécanismes de la maladie et des effets thérapeutiques.
- De futures recherches pourraient étendre son application à d'autres maladies inflammatoires et liées au système immunitaire.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'imagerie longitudinale non invasive de l'infiltration des macrophages permet une détection précoce des réponses inflammatoires dans les modèles précliniques, réduisant ainsi la dépendance aux points terminaux et soutenant l'évaluation mécanistique des thérapeutiques anti-inflammatoires. La tomographie quantitative en fluorescence 3D offre une confiance prédictive quant à l'engagement de la cible et aux effets modificateurs de la maladie, guidant les décisions d'aller ou de ne pas aller de l'avant dans les programmes relatifs aux maladies inflammatoires de l'intestin (IBD) et aux affections immuno-médiées. Cette approche améliore la continuité translationnelle en alignant les résultats d'imagerie in vivo avec la validation histopathologique, optimisant ainsi le tri des projets et l'allocation des ressources au sein des voies de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en visualisant l'accumulation de macrophages positifs pour F4/80 comme indicateur fonctionnel de l'inflammation intestinale.
- Valeur opérationnelle : Favorise la détection biologique des risques grâce à des interactions spécifiques entre la sonde et sa cible, comme en témoigne l'absence de signal avec des contrôles d'IgG non spécifiques.
- Valeur prédictive : Corrèle l'accumulation du traceur in vivo avec la liaison de l'anticorps ex vivo et les décomptes histologiques de macrophages, renforçant ainsi la confiance dans la cible pour le criblage d'immunomodulateurs.
Développement de criblages et de tests
- Préparation du test : Génère des cartes de fluorescence 3D standardisées et quantitatives ainsi que des mesures de traceurs au niveau picomolaire, permettant un criblage reproductible de composés dans des modèles de colite.
- Extensibilité : Facilite la surveillance longitudinale à différents points temporels, réduisant l'utilisation d'animaux et augmentant la puissance statistique dans les études d'efficacité thérapeutique.
- Réutilisation de la plateforme : Compatible avec une validation ultérieure par coloscopie ou cytométrie en flux, soutenant des flux de travail intégrés pour la validation ciblée et l'alignement des biomarqueurs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Modélise l'inflammation intestinale par une colite induite par le DSS, un système largement utilisé pour étudier la pathogenèse de la maladie inflammatoire de l'intestin (IBD) et la réponse thérapeutique.
- Continuité translationnelle : Associe l'imagerie non invasive à des critères histologiques, permettant de prendre des décisions d'essor basées sur des données concordantes in vivo et ex vivo, ajustées au risque.
- Réduction des risques mécanistiques : Suit l'infiltration des monocytes et la dynamique de différenciation des macrophages, fournissant des informations sur les mécanismes cellulaires d'action des thérapeutiques expérimentaux.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La tomographie par fluorescence s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de cibles jusqu'à l'identification de composés prometteurs et aux tests d'efficacité préclinique, en particulier pour les composés immunomodulateurs dans l'inflammation gastro-intestinale.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en quantifiant l'infiltration des macrophages comme indicateur pharmacodynamique de la modulation de voies dans les modèles de colite.
- Écrans : Fournit des résultats quantitatifs prêts à l'analyse (intensité de fluorescence, concentration du traceur) permettant la comparaison entre groupes de traitement et points temporels.
- Analytique : Fournit des jeux de données 3D reconstruisibles et des mesures de régions d'intérêt qui facilitent l'analyse statistique des effets du traitement sur la localisation des cellules immunitaires.
- Recherche translationnelle : Associe l'imagerie in vivo à la validation ex vivo, renforçant l'alignement des biomarqueurs et la continuité préclinique pour les candidats ciblant les MICI.
- Réutilisation institutionnelle : Représente une capacité d'imagerie réutilisable, applicable à des études de suivi des cellules immunitaires, des cellules souches et des modèles en oncologie, au-delà de l'inflammation intestinale.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à une imagerie spécifique et quantifiable de l'activité des macrophages.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation par une quantification calibrée du traceur et un suivi longitudinal intra-individuel.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en permettant des décisions précoces d'aller ou de ne pas aller de l'avant, fondées sur une surveillance non invasive de l'activité de la maladie, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une priorisation ajustée au risque grâce à des données concordantes d'imagerie et d'histologie, affinant les critères de progression dans les pipelines d'immunomodulateurs.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en imagerie par fluorescence, en préparation de traceurs et en manipulation d'animaux de petite taille pour les protocoles d'injection intraveineuse et d'anesthésie.
- Dépend de l'accès à un système d'imagerie tomodensitométrique par fluorescence pour petits animaux doté d'une sélection appropriée de longueurs d'onde et d'un logiciel de reconstruction.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles d'imagerie, des doses de traceur et des analyses de régions d'intérêt afin d'assurer une interprétation cohérente des données.
- Implique des adaptations selon les systèmes modèles, notamment la suppression du pelage et l'optimisation de l'imagerie abdominale pour minimiser les interférences du signal.
- Comprend des limites pratiques telles que la durée de préparation du traceur, qui s'étend sur 2 à 3 jours, ainsi que la nécessité d'utiliser des contrôles appropriés d'isotype et de maladie pour garantir la spécificité.
