Tomographie médiée par fluorescence pour la détection et la Quantification de l’Inflammation intestinale Murine axés sur les macrophages
15 décembre 2017
Spécifique à la cible sondes représentent un outil innovant pour l’analyse des mécanismes moléculaires, comme expression de la protéine dans divers types de maladie (p. ex., inflammation, infection et tumorigenèse). Dans cette étude, les auteurs décrivent une évaluation quantitative de tomographie tridimensionnelle d’infiltration de macrophages intestinaux dans un modèle murin de colite en utilisant la tomographie de F4/80-spécifique induite par fluorescence.
L’objectif global de cette approche d’imagerie in vivo spécifique à la cible est de visualiser les marqueurs moléculaires de l’activité de la maladie dans les maladies inflammatoires de l’intestin. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies inflammatoires de l’intestin et à la recherche thérapeutique connexe sur l’influence de thérapies expérimentales ou d’événements cellulaires spécifiques sur l’inflammation. Le principal avantage de cette technique est que l’activité de la maladie peut être surveillée longitudinalement et de manière non invasive.
Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des troubles inflammatoires, elle peut également être appliquée à l’étude d’autres maladies, telles que le cancer ou les maladies liées au système immunitaire. Pour induire la colite, remplissez l’approvisionnement en eau des souris expérimentales avec deux grammes de sulfate de sodium de dextran, ou DSS, dissous dans 100 millilitres d’eau potable autoclave, en estimant à cinq millilitres d’eau par souris et par jour. 24 heures avant l’examen, chargez le cocktail d’anticorps d’intérêt dans une seringue stérile à l’abri de la lumière et injectez les anticorps par voie intraveineuse dans les veines de la queue des animaux de laboratoire.
Le jour de l’expérience, utilisez un rasoir électrique pour raser la fourrure dans la région abdominale des animaux de laboratoire afin de minimiser la réflexion et l’absorption de la lumière. À l’aide d’un fantôme imitant les tissus d’une épaisseur et de caractéristiques d’absorption définies, remplissez le fantôme avec un volume spécifique de la solution d’anticorps d’intérêt et mesurez la fluorescence sur le dispositif FMT. Ensuite, sur un appareil de tomographie par fluorescence vétérinaire ou FMT pour petits animaux, cliquez sur Nouvelle étude et incluez les traceurs pertinents dans la description de l’étude, y compris les paramètres d’imagerie et les doses.
Créez des groupes d’étude selon le plan d’expérience, en équipant chaque groupe du nombre approprié d’animaux. Lorsque le système a été calibré pour les constructions du traceur, placez la première souris anesthésiée en position couchée dans une cassette d’examen chauffante à 42 degrés Celsius. Insérez la cassette dans le système d’imagerie et sélectionnez l’échantillon approprié dans le groupe d’étude correspondant.
Sélectionnez le traceur administré pour vous assurer que les valeurs de la concentration du traceur sont correctement calculées et acquérez l’image de réflectance de fluorescence à la longueur d’onde appropriée pour le balayage. Cliquez sur Acquérir l’image pour tracer le contour du champ de balayage et vérifier que le champ de balayage apparaît en superposition sur l’image de réflectance de fluorescence. Ajustez le champ de balayage jusqu’à ce qu’il entoure la région d’intérêt, en prenant soin d’éviter les erreurs ou les zones de fourrure restantes.
En fonction de la cible de l’image, sélectionnez la résolution d’un champ de balayage pour définir le nombre de points de données d’image dans le champ de balayage. Cliquez ensuite sur Scanner pour commencer l’acquisition de l’image à la longueur d’onde sélectionnée. À la fin du scan, retirez l’animal de la cassette pour lui permettre de se rétablir complètement grâce à la surveillance avant de retourner dans sa cage.
La FMT peut ensuite être répétée à différents moments si cela est approprié sur le plan expérimental. Pour analyser les images acquises, ouvrez le logiciel d’analyse d’image approprié et sélectionnez les données brutes pour le premier balayage. À l’aide de l’outil de reconstruction, créez des cartes 3D de la distribution de la fluorescence.
Une fois que tous les balayages ont été ajoutés à l’ensemble de données de reconstruction approprié, ouvrez le premier ensemble de données qui vous intéresse. Tous les scans effectués pour l’animal de laboratoire individuel sélectionné seront montrés. Sélectionnez l’analyse appropriée et cliquez sur Charger.
Une reconstruction 3D de la distribution du traceur apparaîtra sous la forme d’une superposition de l’image de réflectance de fluorescence initialement acquise. Ensuite, identifiez les foyers d’accumulation d’étiquettes non spécifiques sur les cartes 3D reconstruites et utilisez l’outil de mesure pour sélectionner la région d’intérêt. Le logiciel générera ensuite une intensité de fluorescence pour la région d’intérêt, ainsi que des mesures de quantité picomolaire du traceur pour lequel le balayage a été calibré.
Dans cette expérience, un anticorps conjugué à la fluorescence contre la souris F4/80 a été utilisé pour visualiser directement les macrophages activés. Une accumulation significativement élevée de traceur fluorescent a été mesurée par tomographie médiée par fluorescence dans les côlons des souris colitiques par rapport aux animaux témoins non colitiques, indiquant une augmentation de l’infiltration des monocytes et de la différenciation en macrophages actifs chez les animaux colitiques. À l’inverse, l’application d’un anticorps IgG conjugué à la fluorescence non spécifique n’a pas provoqué de réponse de fluorescence détectable dans l’abdomen ou l’intestin dans le groupe témoin colitique ou non colitique, démontrant la spécificité de l’interaction sonde-cible de l’anticorps F4/80.
Les mesures ex vivo de l’accumulation de traceurs dirigée F4/80 dans les côlons explantés vérifient davantage l’origine colique de l’accumulation de signaux traceurs F4/80 détectée in vivo. En effet, les quantités calculées d’anticorps liés sont bien corrélées avec les nombres histologiquement déterminés de macrophages infiltrants, ce qui confirme que l’imagerie in vivo avec des traceurs spécifiques peut être indicative de l’activité locale de la maladie. Une fois maîtrisé, cela peut être effectué et analysé en quelques minutes s’il est effectué correctement.
Les étapes de préparation, y compris la production de traceurs spécifiques à base d’anticorps, prennent généralement deux à trois jours. Lors de la planification d’une procédure expérimentale comme celle-ci, il est important d’inclure des contrôles appropriés et fiables, tant pour l’anticorps que pour le modèle de maladie animale. Suite à cette procédure, d’autres méthodes, comme la coloscopie ou la cytométrie en flux, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires et pour valider et quantifier les données.
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Aperçu
Cette étude présente une approche d'imagerie in vivo spécifique à la cible pour visualiser les marqueurs moléculaires de l'activité de la maladie dans la maladie inflammatoire de l'intestin. Utilisant une évaluation tomographique tridimensionnelle quantitative, la recherche se concentre sur l'infiltration des macrophages intestinaux dans un modèle murin de colite.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroscience
- Immunologie
- Maladie inflammatoire de l'intestin
Contexte
- Les sondes spécifiques à la cible sont des outils innovants pour analyser les mécanismes moléculaires.
- Elles peuvent être utilisées pour étudier l'expression des protéines dans diverses maladies.
- Cette méthode permet un suivi longitudinal et non invasif de l'activité de la maladie.
- Elle peut être appliquée aux troubles inflammatoires, au cancer et aux maladies liées au système immunitaire.
Objectif de l'étude
- Visualiser les marqueurs moléculaires de l'activité de la maladie dans la maladie inflammatoire de l'intestin.
- Répondre aux questions clés de la recherche thérapeutique liées à l'inflammation.
- Évaluer l'influence des thérapeutiques expérimentales sur l'inflammation.
Méthodes utilisées
- Induction de colite en utilisant du sulfate de dextran sodium (DSS).
- Administration d'un cocktail d'anticorps par voie intraveineuse chez les souris expérimentales.
- Tomographie à médiation de fluorescence pour imager l'infiltration des macrophages.
- Suivi longitudinal de l'activité de la maladie in vivo.
Principaux résultats
- Visualisation réussie de l'infiltration des macrophages intestinaux.
- Démonstration de la capacité à surveiller l'activité de la maladie de manière non invasive.
- Apport d'informations sur la dynamique de l'inflammation dans la colite.
- Identification de potentiels applications pour l'étude d'autres maladies.
Conclusions
- L'approche d'imagerie spécifique à la cible est efficace pour étudier la maladie inflammatoire de l'intestin.
- Cette méthode peut améliorer la compréhension des mécanismes de la maladie et des effets thérapeutiques.
- Les recherches futures peuvent élargir son application à d'autres maladies inflammatoires et liées au système immunitaire.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Non-invasive longitudinal imaging of macrophage infiltration enables early detection of inflammatory responses in preclinical models, reducing reliance on terminal endpoints and supporting mechanistic de-risking of anti-inflammatory therapeutics. Quantitative 3D fluorescence-mediated tomography provides predictive confidence in target engagement and disease-modifying effects, informing go/no-go decisions in IBD and immune-mediated disease programs. This approach enhances translational continuity by aligning in vivo imaging readouts with histopathological validation, improving portfolio triage and resource allocation in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing F4/80-positive macrophage accumulation as a functional readout of intestinal inflammation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through specific probe-target interactions, demonstrated by lack of signal with non-specific IgG controls.
- Predictive Value: Correlates in vivo tracer accumulation with ex vivo antibody binding and histologic macrophage counts, strengthening target confidence for immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative 3D fluorescence maps and picomolar tracer measurements, enabling reproducible compound screening in colitis models.
- Scalability: Facilitates longitudinal monitoring across time points, reducing animal use and increasing statistical power in therapeutic efficacy studies.
- Platform Reuse: Compatible with downstream validation via colonoscopy or flow cytometry, supporting integrated workflows for target validation and biomarker alignment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models intestinal inflammation through DSS-induced colitis, a widely used system for studying IBD pathogenesis and therapeutic response.
- Translational Continuity: Links non-invasive imaging to histologic endpoints, enabling risk-adjusted advancement decisions based on concordant in vivo and ex vivo data.
- Mechanistic De-risking: Tracks monocyte infiltration and macrophage differentiation dynamics, providing insight into cellular mechanisms of action for experimental therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
Fluorescence-mediated tomography fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for immune-modulating compounds in gastrointestinal inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying macrophage infiltration as a pharmacodynamic readout of pathway modulation in colitis models.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (fluorescence intensity, tracer concentration) that enable comparison across treatment groups and time points.
- Analytics: Provides reconstructable 3D datasets and region-of-interest measurements that facilitate statistical analysis of treatment effects on immune cell localization.
- Translational Research: Connects in vivo imaging to ex vivo validation, strengthening biomarker alignment and preclinical continuity for IBD-targeted candidates.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging capability applicable across immune cell tracking, stem cell studies, and oncology models beyond intestinal inflammation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through specific, quantifiable imaging of macrophage activity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via calibrated tracer quantification and longitudinal intra-individual tracking.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on non-invasive disease activity monitoring, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through concordant imaging and histologic data, refining advancement criteria in immunomodulator pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence imaging, tracer preparation, and small animal handling for intravenous injection and anesthesia protocols.
- Dependent on access to a small animal fluorescence-mediated tomography system with appropriate wavelength selection and reconstruction software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols, tracer dosing, and region-of-interest analysis for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations across model systems, including fur removal and abdominal imaging optimization to minimize signal interference.
- Includes practical limitations such as the 2–3 day tracer preparation timeline and the need for appropriate isotype and disease controls to ensure specificity.
