Préparation d’échantillons pour la visualisation tridimensionnelle basée sur la tomodensitométrie des vaisseaux murins des membres postérieurs
7 octobre 2021
Nous décrivons ici une méthode de visualisation et de quantification des vaisseaux murins des membres postérieurs à l’aide de la tomodensitométrie par micro-rayons X.
Il est possible de prendre des images CT des vaisseaux sanguins dans les membres inférieurs et les organes abdominaux en utilisant le protocole de pas. La méthode permet d’évaluer l’ensemble des vaisseaux sanguins de manière exhaustive. De plus, il est possible d’évaluer uniquement les artères ou en même temps, les artères et les veines.
Il est très important de prévenir les caillots sanguins, les fuites ou le sang bien, et d’éviter les bulles d’air. Avant l’opération, injecter 1 unité/gramme d’héparine dans le PBS dans la cavité intrapéritonéale de la souris. Après 30 minutes, faites une incision médiane dans le sternum de la souris euthanasiée et fixez le thorax ouvert avec des épingles.
Coupez l’aorte ascendante avant d’enlever le cœur, puis retirez le poumon pour exposer l’aorte descendante. Coupez l’aorte descendante en diagonale pour révéler la section transversale du vaisseau. Ensuite, insérez un cathéter de calibre 22 dans l’aorte descendante tout en exécutant le tampon de vasodilatation.
Épinglez la racine du cathéter et faites un nœud pour éviter les fuites dues au refoulement. Une fois cela fait, commencez la perfusion avec une solution vasodilatatrice chauffée à une pression fixe comprise entre 13 et 15 kilopascals. Après trois minutes, perfuser une solution de paraformaldéhyde à 4% dans du PBS pendant 3 min.
Arrêtez la perfusion et remplissez le tube d’extension relié au cathéter avec 2 mL de produit de contraste fraîchement préparé dilué dans le rapport 1:1 pour perfuser à une température fixée entre 13 et 15 kilopascals. Pour visualiser les artères, vérifiez l’ongle de la bouche pour confirmer que le produit de contraste a atteint l’artère. De la même manière, vérifiez la veine cave inférieure du diaphragme pour confirmer la circulation complète du produit de contraste et visualisez tous les vaisseaux.
Si la circulation du produit de contraste est terminée, fermez le robinet d’arrêt à trois voies et retirez le tube. Incuber l’échantillon pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Dans ce protocole, tous les vaisseaux des membres inférieurs de la souris ont été visualisés.
Les résultats d’un modèle d’ischémie des membres postérieurs ont confirmé que l’artère fémorale non ligaturée était parallèle à la veine fémorale. En outre, l’interruption des produits de contraste a permis de visualiser facilement une artère fémorale ligaturée et le développement de vaisseaux collatéraux. Quelques récipients remplis du produit de contraste pouvaient être vus.
D’autre part, la perturbation des produits de contraste due au mélange de milieux non contretrastes ou à une perfusion insuffisante a également été remarquée. Il était impossible de voir les artères à la surface du corps par observation microscopique ou stérémicroscopique du produit de contraste, ce qui facilitait l’évaluation des défauts du système vasculaire. Il est très important d’éviter les bulles d’air lors de l’insertion du cathéter.
Étant donné que leurs organes abdominaux sont également détendus, il est possible de sortir des organes et de passer un scanner. En utilisant cette méthode, nous avons pu identifier un nouveau quart de saturation.
Aperçu
Cet article décrit une méthode de visualisation et de quantification des vaisseaux des membres postérieurs de souris en utilisant la tomographie par rayons X microscopique. Cette technique permet une évaluation complète des vaisseaux sanguins dans les membres inférieurs et les organes abdominaux.
Composantes clés de l'étude
Domaine de la science
- Neuroscience
- Biologie vasculaire
- Techniques d'imagerie
Contexte
- La tomographie par rayons X microscopique est un outil d'imagerie puissant.
- Comprendre la structure des vaisseaux sanguins est crucial pour diverses études biologiques.
- Les méthodes précédentes ne permettaient pas une visualisation complète.
- Cette étude vise à améliorer les techniques de visualisation pour les modèles murins.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour visualiser les vaisseaux des membres postérieurs.
- Permettre la quantification des structures vasculaires dans les modèles murins.
- Évaluer l'impact des interventions sur la santé vasculaire.
Méthodes utilisées
- Injection d'héparine pour prévenir les caillots sanguins.
- Perfusion de produit de contraste pour visualiser les vaisseaux sanguins.
- Imagerie CT pour capturer des structures vasculaires détaillées.
- Évaluation des artères et des veines dans les membres postérieurs.
Principaux résultats
- Visualisation réussie de tous les vaisseaux dans les membres inférieurs.
- Identification des vaisseaux collatéraux dans un modèle d'ischémie des membres postérieurs.
- Défis notés avec les bulles d'air et la perfusion incomplète.
- La méthode a permis l'évaluation des défauts vasculaires.
Conclusions
- La méthode fournit une approche complète de l'imagerie vasculaire.
- Elle peut améliorer la compréhension des conditions vasculaires dans les modèles murins.
- Les applications futures peuvent inclure des études sur la santé et les maladies vasculaires.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This method enables comprehensive 3D visualization of murine vascular networks, supporting preclinical assessment of angiogenic responses and vascular pathology. By providing quantitative structural data from hind-limb and abdominal organ vasculature, it enhances target validation in vascular biology and ischemic disease models. The technique improves predictive confidence in lead identification by reducing reliance on 2D sectioning and enabling direct observation of vascular architecture and collateral formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to angiogenesis and vascular remodeling in ischemic models.
- Operational Value: Provides functional validation of vascular targets through direct 3D imaging of perfusion defects and collateral development.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying vascular responses to pharmacological or genetic interventions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized biological systems for downstream compound screening by establishing baseline vascular morphology.
- Quantitative Output: Delivers measurable vascular parameters such as vessel density, branching patterns, and perfusion completeness for assay standardization.
- Scalability: Compatible with micro-CT platforms, enabling reproducible imaging across laboratories and study sites.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models physiological and pathological angiogenesis in hind-limb ischemia, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery findings with preclinical validation by enabling longitudinal vascular assessment.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria by visualizing vascular defects and compensatory mechanisms that influence drug efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, particularly in target validation and lead optimization stages where vascular phenotypes are critical readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of angiogenic pathways and vascular integrity in disease models.
- Screening: Enables assay-ready vascular models with reproducible, quantitative imaging outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides structural and perfusion-based readouts that allow comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to vascular outcomes in preclinical models, supporting biomarker-linked efficacy assessment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for vascular phenotyping across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in vascular responses.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through standardized perfusion and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of vascular liabilities and reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative vascular morphology and perfusion data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical vascular perfusion and contrast agent handling.
- Dependent on micro-CT imaging infrastructure and contrast medium preparation capabilities.
- Necessitates cross-team standardization of perfusion pressure, timing, and contrast dilution for reproducible results.
- Adaptation across model systems may require adjustments in cannulation technique and perfusion parameters.
- Practical limitations include sensitivity to air bubbles, incomplete perfusion, and contrast mixing, which can impair visualization quality.
