Analyses comportementales automatisés à haut débit dans les embryons de poisson zèbre

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les défauts de comportement chez les larves de poisson-zèbre après un traitement avec des toxiques ou des produits pharmaceutiques. Pour ce faire, on recueille et traite d’abord les embryons ou les larves avec des produits chimiques jusqu’aux sept premiers jours de développement. La deuxième étape consiste à fabriquer des couloirs de nage agricoles à l’aide de moules spécialement conçus.

Ensuite, les larves traitées sont placées dans les couloirs agricoles pour une analyse comportementale à l’aide de photographies en accéléré. La dernière étape consiste à importer les images dans l’image J et à utiliser une macro spécifique écrite en interne afin de recueillir les données de coordonnées XY des larves dans les couloirs. En fin de compte, le test comportemental à haut débit est utilisé pour trouver des différences dans l’évitement et le comportement de l’axe figma, ainsi que dans la vitesse de nage et le repos entre les groupes de traitement.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme celles disponibles dans le commerce est que nous pouvons utiliser notre méthode pour observer des comportements plus complexes. Il est également peu coûteux à construire et facile à installer. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences comportementales, telles que la façon dont les toxiques affectent le développement du cerveau et le comportement lors d’une exposition embryonnaire précoce.

Il peut également donner un aperçu de défauts cérébraux subtils chez l’homme, qui ne peuvent pas être trouvés par d’autres dépistages de toxicité actuels. En général, les individus qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il peut être difficile d’attraper les larves. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes ont une courbe d’apprentissage puisque le protocole implique des systèmes personnalisés.

Pour commencer cette procédure, insérez dans les réservoirs des plats en verre Pyrex avec de la fausse herbe en fil vert. À l’aube, laissez la vaisselle dans les bassins pendant deux heures afin de recueillir les embryons de poisson-zèbre. Versez les plats en verre contenant les embryons sur une passoire à main avec de l’eau déminéralisée.

Ensuite, faites pousser les embryons dans de l’eau d’œuf contenant 60 milligrammes par litre d’océan instantané dans de l’eau déminéralisée et 0,25 milligramme par litre de bleu de méthylène, qui est utilisé comme inhibiteur de moisissure. Les embryons peuvent être logés à raison de 50 à 60 larves par 50 millilitres ou dans des bassins d’élevage plus grands jusqu’à ce que les embryons soient prêts à être traités avec des substances toxiques. Selon l’hypothèse de l’expérience individuelle, les embryons peuvent être traités immédiatement ou à des stades spécifiques du développement à l’aide de substances toxiques ou de produits pharmaceutiques, qui sont généralement dissous dans du DMSO, puis dilués directement dans le milieu aqueux de l’œuf.

La couleur bleue est utilisée à des fins de démonstration vidéo pendant le traitement des embryons et des larves. Les larves et les embryons peuvent être logés dans des boîtes de Pétri profondes à une densité d’environ 50 à 60 larves par 50 millilitres jusqu’à ce que l’analyse comportementale sept jours après la fécondation modifie la solution d’eau de l’œuf au moins tous les deux jours pour éviter la croissance fongique ou bactérienne des embryons morts. Des moules en plastique ont été fabriqués pour créer des voies à l’aide d’aros, qui est versé dans des plaques en plastique à puits unique de Thermos Scientific.

Les moules contiennent cinq voies dans lesquelles les côtés sont inclinés à 60 degrés. Voir le protocole textuel accompagnant cette vidéo pour les dimensions des moules et des plaques ? Tout d’abord, préparez les aros en faisant fondre 0,8 % d’aros dans de l’eau déminéralisée avec 60 milligrammes par litre d’océan instantané.

Ensuite, générez les voies en versant 50 millilitres d’aros fondus dans une seule plaque de puits. Ensuite, placez très lentement le moule sur les aros de liquide qui éliminent toute formation de bulles. Retirez le moule lorsque l’aros a refroidi.

Les voies aros peuvent être conservées à température ambiante avec les couvercles sur la vaisselle jusqu’à 36 heures. Pour l’analyse comportementale à haut débit, les armoires d’imagerie sont préparées à l’aide d’une caméra numérique de 15 mégapixels fixée en haut de l’armoire vers le bas et vers le bas au bas de l’armoire. Un ordinateur portable à écran de 15,6 pouces est placé avec l’écran vers le haut.

Afin d’éviter de surchauffer les larves, il est préférable d’utiliser un ordinateur portable dont la température de l’écran ne dépasse pas 28 degrés Celsius. Placez un diffuseur en plastique sur l’écran de l’ordinateur portable sur lequel seront placées les plaques agros. Le diffuseur empêchera plus de motifs dans les images collectées.

Pour commencer la capture d’image, déplacez soigneusement les larves de la boîte de Pétri vers la voie agros pour aider à réduire le stress des larves. Jusqu’à 20 larves peuvent être placées dans chaque couloir, mais cinq larves par couloir sont généralement utilisées pour faciliter le suivi le plus précis de la vitesse de nage et pour réduire le nombre de larves nécessaires par expérience, remplissez les couloirs avec de l’eau d’œuf, avec ou sans produits pharmaceutiques ou toxiques selon l’expérience. Ne remplissez pas complètement les voies avant qu’elles ne soient placées dans les armoires d’imagerie pour éviter tout débordement.

Attendez 10 minutes pour que les larves s’acclimatent après la période d’acclimatation. Placez quatre plaques à la main directement sur l’écran de l’ordinateur portable. À ce moment, les voies peuvent être complétées avec des œufs, de l’eau ou un traitement chimique afin qu’elles soient au niveau du haut de la voie pour éliminer les ombres sur les bords des voies.

Dans les images, programmez l’ordinateur pour la photographie en accéléré, en prenant des photos toutes les six secondes pour un total de 300 images par expérience. Réglez l’appareil photo à une résolution inférieure pour l’imagerie à la vitesse de la vidéo. Alors que la résolution inférieure limite les enregistrements à une seule plaque multi-puits.

Les enregistrements vidéo sont appropriés pour l’imagerie d’événements de natation rapide. Utilisez une présentation PowerPoint comme stimulus aversif pour les larves dans cette démonstration. Le PowerPoint commence avec un fond blanc vierge pendant 15 minutes, suivi de 15 d’une barre rouge mobile sur la moitié supérieure de l’assiette.

Pour éviter l’évaporation du liquide à l’intérieur des voies d’accès, maintenez le temps d’imagerie maximal à moins d’une heure. Ouvrez les images avec l’image J dans cette démonstration. Une macro interne pour l’analyse des larves à cinq voies est utilisée et peut être mise à la disposition de n’importe quel utilisateur.

Utilisez les invites de la macro pour définir les paramètres, tels que le nombre d’images et la couleur à soustraire. La macro divise ensuite automatiquement le canal de couleur afin que la couleur rouge puisse être supprimée. Soustrait l’arrière-plan, applique un seuil et identifie les larves par analyse de particules.

Une fois que toutes les images ont été analysées dans l’image J Macro, un fichier de résultats s’affichera et contiendra les coordonnées XY des larves individuelles pour chaque image, ainsi que le numéro de l’image et le numéro de voie. Enregistrez le fichier de résultats au format Excel et triez-le en fonction de l’arrière-plan vide par rapport à l’arrière-plan de la barre mobile, puis du numéro du puits. Utilisez un modèle Excel qui comporte des équations intégrées pour déterminer automatiquement l’emplacement des larves dans les puits, la distance entre les larves, la vitesse de déplacement et la quantité de repos.

Le modèle Excel le plus récent créé dans le laboratoire Cretin est disponible sur demande, des graphiques de construction montrant divers groupes de traitement dans la feuille Excel, ainsi que le test T pour la comparaison entre les groupes de traitement et les témoins. D’autres analyses statistiques peuvent être effectuées à l’aide du programme de statistiques SPSS. Les résultats sont présentés pour des larves traitées avec de l’eau d’œuf et du DMSO comme témoins et à des concentrations variables d’un pesticide organophosphoré que l’on trouve couramment dans les aliments non biologiques.

Ici, les barres blanches montrent les données des larves exposées à un arrière-plan vierge, et les barres rouges montrent les données des larves exposées à la barre mobile rouge. Contrôle. Les larves élevées dans l’eau des œufs montrent une préférence accrue pour être dans le plat après avoir été présentées avec la barre rouge en mouvement. Des résultats similaires sont obtenus lorsque les larves sont élevées dans de l’eau d’œuf contenant un microgramme par millilitre de DMSO, un solvant couramment utilisé pour dissoudre divers produits pharmaceutiques et toxiques sous forme de solutions mères 1000 fois.

Les graphiques indiquent les mesures qui peuvent être obtenues à partir de l’analyse comportementale, y compris le pourcentage de larves dans le couloir, le pourcentage de larves au bout du couloir, le pourcentage de larves sur le bord du couloir, la distance entre les poissons, la vitesse de nage des larves et le pourcentage de temps pendant lequel les larves sont au repos. Les résultats présentés sont un échantillon d’une expérience. Cependant, lorsqu’ils sont répétés, les résultats indiquent que la vitesse de nage et le comportement des figues sont altérés par de faibles concentrations de pesticides organophosphorés, qui imitent les niveaux dans l’alimentation humaine Une fois maîtrisés, l’imagerie et l’analyse d’imagerie peuvent être effectuées en une heure et demie si elles sont effectuées correctement.

L’aspect le plus important de cette procédure est de se rappeler de garder le support culturel propre en le remplaçant quotidiennement par un nouveau support.