Configuration d'une nappe de lumière Microscope simple pour En Toto Imagerie de C. elegans Développement

L’objectif global de cette procédure est d’imager le développement de C Allergan à l’aide de la microscopie à feuillet de lumière à fluorescence. Pour ce faire, il suffit d’abord de mettre en place le microscope à feuillet de lumière composé d’un microscope vertical et d’un petit ensemble d’éléments optomécaniques pour générer un feuillet de lumière. La deuxième étape de la procédure consiste à monter l’embryon.

Les dernières étapes consistent à ajuster la feuille de lumière sur l’embryon et à enregistrer son développement. Les résultats permettent de montrer la dynamique des protéines marquées par fluorescence au cours du développement de CL egan via l’analyse de vidéos 3D et time lapse. Le principal avantage de la microscopie à faisceau léger par rapport à d’autres méthodes existantes, telles que la microscopie confocale, est qu’elle permet une imagerie plus rapide avec une phototoxicité plus faible.

Troisièmement, cette méthode peut donner un aperçu de l’étanchéité contre le développement. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que le roil ou le poisson zèbre. La démonstration de la procédure sera claire.

Shales un ingénieur de mon laboratoire et Pauline Linac, une ingénieure du laboratoire de van. Cette section décrit l’assemblage de la configuration, et il peut être laissé assemblé pour toutes les expériences. Une fois que les lasers, les filtres, le télescope et le périscope ont tous été positionnés sur la table optique, fixez la lentille cylindrique pour générer la feuille de lumière.

Un objectif différent est ajusté pour la mise au point. Le foyer de l’objectif d’éclairage doit coïncider avec le point focal de l’objet de l’objectif de détection. Maintenant, projetez le faisceau sur le mur ou l’écran et déplacez l’objectif d’éclairage le long de l’axe du faisceau jusqu’à ce que les contours de la projection soient nets.

Incluez un filtre d’émission à quatre lignes et une caméra E-M-C-C-D dans la configuration du microscope. Fixez la deuxième étape de translation manuelle à la première de manière perpendiculaire. Vissez l’ensemble sur la platine de microscope existante.

Après avoir retiré l’objectif d’éclairage à lentille cylindrique réglé, positionnez l’ensemble sur le microscope et remettez le réglage d’éclairage sur les platines. Fixez le support qve à l’intersection perpendiculaire de la trajectoire d’éclairage et de la trajectoire de détection. Maintenant, vérifiez la feuille de lumière.

Remplissez un verre de solution de fluorescéine et placez-le dans le support sur les platines. La feuille de lumière doit être visible. Il doit être horizontal et centré par rapport à l’objectif de détection.

Ensuite, retirez la lentille cylindrique. Optimisez la feuille de lumière avec la traduction 3D de l’objectif d’éclairage, et acquérez une image pour mesurer l’épaisseur de la feuille de lumière. Cela dépend de l’ouverture de l’objectif.

Assurez-vous ensuite de remplacer la lentille cylindrique. Tout d’abord, coupez un morceau de verre d’un millimètre d’épaisseur, 10 millimètres sur 20 millimètres. Utilisez un marqueur diamant.

Ensuite, ajoutez 20 microlitres de poly L lysine d’un côté et, une fois sec, juxtaposez-le à une deuxième lame. Dans une position fixe, ajoutez une goutte de 5 % d’agar et lissez-la avec le poids d’une troisième glissière posée sur le dessus. Une fois que la gélose a séché, retirez la troisième lame et coupez le tampon gélosé à trois millimètres du bord des deux lames restantes sur la lame sans poly L lysine.

Retirez ensuite la lame fixe en laissant un surplomb d’agar. Enduisez l’agar de 20 microlitres de poly L lysine et laissez-le sécher. Placez maintenant des vers GR dans un verre de montre rempli de milieu M nine sous un microscope de dissection.

Coupez les vers avec un scalpel au niveau de la vulve, libérant ainsi les œufs. Identifiez ensuite les embryons qui sont du stade d’intérêt et collectez-les à l’aide d’une micropipette capillaire. Transférez les embryons sur le surplomb de gélose de la lame préparée juste à côté du bord de la lame, et non sur le bord de la gélose.

Alignez ensuite les embryons à l’aide d’une micro pipette capillaire tout en retirant le liquide. Par aspiration, les embryons vont adhérer au polyol lysine. Il est très important de bien positionner les embryons pour obtenir un bon enregistrement, et cela nécessite un capillaire avec la bonne apture.

S’ils sont trop petits, il sera difficile de libérer les embryons. S’il est trop grand, il sera difficile de contrôler étroitement le flux qui s’échappe et d’aligner les embryons, de couvrir la lame avec du milieu M neuf dans une boîte de Pétri et de confirmer que les embryons sont toujours attachés à la gélose à l’aide d’un grossissement. Maintenant, fixez la lame préparée avec des embryons au porte-échantillon qui s’adapte à un vétérinaire.

Le support est un engin fabriqué en interne qui est conçu pour s’adapter à un vétérinaire. Ensuite, fixez le vétérinaire à un étage électrique Pizo et, sous un éclairage en fond clair, localisez un embryon. Démarrez maintenant le progiciel de contrôle de l’optique acoustique accordable.

Filtrez la caméra et la scène. Ce logiciel a été écrit en interne, mais le logiciel gratuit micromanager peut également être utilisé. Tout d’abord, sélectionnez la ligne laser.

Ensuite, ajustez la platine le long de l’axe des x jusqu’à ce que la feuille de lumière soit à son plus brillant. Ajustez ensuite les deux autres dimensions, Y et Z, jusqu’à ce que le rapport signal/bruit soit à son meilleur. Il peut être nécessaire de répéter cette opération pour chaque embryon.

Cette clé permet d’optimiser le rapport signal/rapport pour obtenir un bon enregistrement traduisant le d’un stade libre, le soutien de l’objectif et l’élimination lorsque je n’ai qu’une relation pour obtenir une simulation globale de l’embryon et le meilleur contraste. Maintenant, acquérez des images en accéléré, réglez la puissance d’exposition laser, le gain de temps et l’intervalle d’imagerie en fonction du niveau de fluorescence de l’embryon et de la vitesse du processus biologique analysé. Pour Zack.

L’imagerie définit la distance entre les coupes et leurs positions de début et de fin dans c elgan exprimant une construction GFP d’histones. Une imagerie time-lapse de deux heures a été réalisée avec 20 piles de tranches prises toutes les 37 secondes. Les divisions cellulaires étaient clairement visibles chez une souche exprimant la tubuline fusionnée à la GFP et sa pierre fusionnée à la cerisier. Les enregistrements ont été pris pendant 16 minutes toutes les 105 secondes.

Les rendus 3D sont affichés à trois moments chronologiques. Les fuseaux mitotiques et les chromosomes condensés sont clairement visibles et facilement suivis à travers les divisions cellulaires. Dans une troisième souche, la lipoprotéine APO vit two fusionnée à la GFP a été imagée avec le marquage mCherry de la membrane cellulaire.

Pendant 13 minutes, 10 piles de tranches ont été prises toutes les 27 secondes. Les particules de lipoprotéines se déplaçant rapidement étaient faciles à suivre. Ici, nous utilisons la feuille légère formée par des méthodes plus complexes pour produire.

La feuille de lumière pourrait être mise en œuvre pour améliorer encore la résolution spatiale.