Configuration d'une nappe de lumière Microscope simple pour
5 mai 2014
Ce protocole décrit la configuration d'une feuille microscope optique et sa mise en œuvre pour l'imagerie in vivo de C. elegans embryons.
L'objectif général de cette procédure est d'observer le développement de C Allergan par microscopie à feuillet lumineux en fluorescence. Cela est réalisé en configurant d'abord un microscope à feuillet lumineux composé d'un microscope droit et d'un petit ensemble d'éléments optomécaniques permettant de générer un feuillet lumineux. La deuxième étape de la procédure consiste à monter l'embryon.
Les dernières étapes consistent à ajuster la feuille de lumière sur l'embryon et à enregistrer son développement. Les résultats peuvent montrer la dynamique de protéines marquées de façon fluorescente au cours du développement de l'CL egan, grâce à l'analyse de vidéos 3D et en accéléré temporel. Les principaux avantages de la microscopie lightsheet par rapport à d'autres méthodes existantes, telles que la microscopie confocale, sont qu'elle permet une imagerie plus rapide avec une phototoxicité réduite.
Troisièmement, cette méthode peut fournir des informations sur l'herméticité face au développement. Elle peut également être appliquée à d'autres systèmes tels que la roil ou le poisson zèbre. La démonstration de la procédure sera claire.
Shales, un ingénieur de mon laboratoire, et Pauline Linac, une ingénieure du laboratoire de van. Cette section décrit le montage de l'assemblage, qui peut rester monté pour toutes les expériences. Une fois que les lasers, les filtres, la lunette et le périscope ont tous été positionnés sur la table optique, fixez la lentille cylindrique afin de générer la feuille de lumière.
Un objectif différent est ajusté pour la mise au point. Le point focal de l'objectif d'éclairage doit coïncider avec le point focal objet de l'objectif de détection. Ensuite, projetez le faisceau sur le mur ou sur un écran et déplacez l'objectif d'éclairage le long de l'axe du faisceau jusqu'à ce que les contours de la projection soient nets.
Inclure un filtre d'émission à quatre lignes et une caméra E-M-C-C-D dans la configuration du microscope. Fixer la seconde platine de translation manuelle à la première de manière perpendiculaire. Visser l'ensemble sur la platine existante du microscope.
Après avoir retiré l'objectif d'éclairage cylindrique réglé, positionnez l'ensemble sur le microscope et remettez le jeu d'éclairage sur les supports. Fixez le support de qve à l'intersection perpendiculaire du trajet d'éclairage et du trajet de détection. Vérifiez maintenant le feuillet lumineux.
Remplissez un verre en pyrex avec la solution de fluorescéine et placez-le dans le support sur les plateaux. La feuille de lumière doit être visible. Elle doit être horizontale et centrée par rapport à l'objectif de détection.
Ensuite, retirez la lentille cylindrique. Optimisez la feuille de lumière à l'aide d'une translation 3D de l'objectif d'illumination, puis acquérez une image pour mesurer l'épaisseur de la feuille de lumière. Celle-ci dépend de l'ouverture de l'objectif.
Ensuite, veillez à remplacer la lentille cylindrique. Commencez par couper un morceau de verre d'un millimètre d'épaisseur, de 10 millimètres sur 20 millimètres. Utilisez un stylo marqueur au diamant.
Ensuite, ajoutez 20 microlitres de poly-L-lysine sur un côté, puis, une fois sec, placez-le en regard d'une deuxième lame. En position fixe, ajoutez une goutte d'agar à 5 % et lissez-la à l’aide du poids d’une troisième lame posée par-dessus. Une fois l'agar sec, retirez la troisième lame et découpez le tampon d'agar à trois millimètres du bord des deux lames restantes, au-dessus de la lame ne contenant pas de poly-L-lysine.
Ensuite, retirez la lame fixée, en laissant un surplomb d'agar. Recouvrez l'agar de 20 microlitres de poly-L-lysine et laissez sécher. Placez maintenant les vers GR dans une coupelle en verre de montre remplie de milieu M nine sous un microscope stéréoscopique.
Couper les vers avec un scalpel au niveau de la vulve, libérant ainsi les œufs. Identifier ensuite les embryons au stade d'intérêt et les recueillir à l’aide d’une micropipette capillaire. Transférer les embryons vers le surplomb d’agar sur la lame préparée, juste à côté du bord de la lame, mais pas en bordure de l’agar.
Alignez ensuite les embryons à l’aide d’une pipette capillaire microscopique tout en éliminant le liquide. Par aspiration, les embryons adhéreront à la polyolysine. Il est très important de bien positionner les embryons afin d'obtenir un bon enregistrement, ce qui nécessite un capillaire doté de l'ouverture adéquate.
S’il est trop petit, il sera difficile de libérer les embryons. S’il est trop grand, il sera difficile de contrôler précisément l’écoulement et d’aligner les embryons. Recouvrez la lame avec du milieu M neuf dans une boîte de Pétri et vérifiez, à l’aide d’un grossissement, que les embryons sont toujours fixés à l’agar. Fixez ensuite la lame préparée avec les embryons au porte-échantillon adapté à un vete.
Le support est un dispositif fabriqué en interne, conçu pour s'adapter à un vete. Ensuite, fixez le vete sur une platine piézoélectrique et, en éclairage en champ clair, localisez un embryon. Lancez maintenant le logiciel de commande du filtre acousto-optique accordable.
Filtrez la caméra et la platine. Ce logiciel a été développé en interne, mais le logiciel libre micromanager peut également être utilisé. Commencez par sélectionner la ligne laser.
Ensuite, ajustez la platine le long de l'axe des x jusqu'à ce que la feuille de lumière atteigne son intensité maximale. Puis, ajustez les deux autres dimensions, Y et Z, jusqu'à obtenir le meilleur rapport signal sur bruit. Cette procédure peut devoir être répétée pour chaque embryon.
Cette étape est essentielle pour optimiser le rapport signal sur bruit afin d'obtenir un bon enregistrement, en ajustant la position d'une platine libre, en maintenant l'objectif et en éliminant les artefacts lorsque la relation adéquate est atteinte, permettant ainsi une observation stable de l'embryon et un contraste optimal. Acquérir maintenant des images en lapse de temps en réglant la puissance du laser, le temps d'exposition, le gain et l'intervalle d'acquisition en fonction du niveau de fluorescence de l'embryon et de la vitesse du processus biologique analysé. Pour Zack.
Imagerie réglant la distance entre les tranches et leurs positions de départ et d'arrivée chez C. elgan exprimant une construction d'histone GFP. Une imagerie en laps de temps de deux heures a été réalisée avec 20 ensembles de tranches pris toutes les 37 secondes. Les divisions cellulaires étaient clairement visibles chez une souche exprimant la tubuline fusionnée à GFP et l'histone fusionnée à mCherry. Des enregistrements ont été effectués pendant 16 minutes toutes les 105 secondes.
Des rendus 3D sont présentés à trois points de temps. Les fuseaux mitotiques et les chromosomes condensés sont clairement visibles et facilement traçables au cours des divisions cellulaires. Chez une troisième souche, une lipoprotéine APO vit deux fusionnée à la GFP a été observée avec une étiquette mCherry de la membrane cellulaire.
Au cours de 13 minutes, 10 séries de tranches ont été acquises toutes les 27 secondes. Les particules de lipoprotéines en mouvement rapide étaient faciles à suivre. Ici, nous utilisons le plan lumineux produit par des méthodes plus complexes.
La feuille lumineuse pourrait être mise en œuvre pour améliorer davantage la résolution spatiale.
Aperçu
Ce protocole décrit la mise en place d'un microscope à feuillet lumineux et son utilisation pour l'imagerie in vivo d'embryons de C. elegans. La méthode permet une imagerie plus rapide avec une phototoxicité réduite par rapport à la microscopie confocale.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biophysique
- Microscopie
Contexte
- La microscopie à feuillet lumineux offre une approche unique pour l'imagerie d'échantillons biologiques.
- Cette technique est particulièrement utile pour l'observation d'embryons vivants.
- Elle minimise les dommages phototoxiques tout en permettant une imagerie rapide.
- Les applications s'étendent à divers organismes modèles autres que C. elegans.
Objectif de l'étude
- Visualiser le développement des embryons de C. elegans à l'aide de la microscopie à feuillet lumineux en fluorescence.
- Analyser la dynamique des protéines marquées par fluorescence au cours du développement.
- Mettre en évidence les avantages de la microscopie à feuillet lumineux par rapport aux méthodes traditionnelles.
Méthodes utilisées
- Installation d'un microscope à feuillet lumineux avec des éléments optomécaniques.
- Montage d'embryons sur des lames préparées munies de tampons en agar.
- Optimisation de l'alignement du feuillet lumineux pour l'acquisition d'images.
- Acquisition d'images en lapse de temps pour capturer les processus de développement.
Résultats principaux
- Imagerie réussie des divisions cellulaires et de la dynamique des protéines dans les embryons de C. elegans.
- Des reconstructions 3D des fuseaux mitotiques et des chromosomes ont été obtenues.
- Démonstration de la capacité à suivre des protéines en mouvement rapide.
- A permis d'obtenir des informations sur les processus de développement de l'organisme.
Conclusions
- La microscopie à feuillet lumineux est un outil puissant pour l'imagerie in vivo.
- Cette méthode améliore la compréhension du développement embryonnaire.
- Elle peut être adaptée pour être utilisée avec d'autres organismes modèles.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La microscopie à feuillet lumineux permet une imagerie à haute résolution et faible phototoxicité du développement d'organismes entiers, soutenant la validation de cibles en phase de découverte précoce grâce à des données phénotypiques dynamiques et quantitatives. Cette approche réduit l'incertitude biologique dans les modèles précliniques en permettant le suivi longitudinal des processus cellulaires et de la dynamique des protéines dans des systèmes vivants. La méthode améliore la confiance prédictive dans l'identification de composés candidats en fournissant des résultats d'imagerie reproductibles et évolutifs, compatibles avec des flux de travail de criblage à contenu élevé.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à une visualisation à résolution subcellulaire des dynamiques protéiques et des divisions cellulaires dans les embryons en développement.
- Valeur opérationnelle : Soutient la détection biologique des risques en fournissant des mesures reproductibles et quantitatives des phénotypes développementaux dans des conditions de faible phototoxicité.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des portefeuilles en générant des jeux de données longitudinaux et multiparamétriques qui corréleront les perturbations moléculaires aux résultats du développement.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit une imagerie en 3D et en temps réel normalisée avec une résolution subcellulaire, permettant une évaluation fiable des effets des composés dans un contexte d'organisme entier.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité des tests grâce à un alignement et une stabilisation précis des feuilles de lumière, réduisant ainsi la variabilité lors des séances d'imagerie longitudinales.
- Extensibilité : Compatible avec des chambres d'observation multipuits et une commande automatisée de la platine, prenant en charge des campagnes de criblage à débit moyen.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Fait le lien entre la découverte et la validation préclinique en permettant une évaluation phénotypique cohérente à travers différents systèmes modèles grâce à des protocoles d'imagerie standardisés.
- Déminimisation des risques mécanistiques : Permet l'observation directe des effets de l'interaction avec la cible sur les processus de développement, réduisant ainsi l'ambiguïté dans les études sur le mécanisme d'action.
- Progression ajustée au risque : Fournit des seuils quantitatifs pour les décisions d'avancement ou d'arrêt basées sur des métriques de toxicité développementale et de normalisation phénotypique.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, depuis la validation précoce de cibles jusqu'à l'optimisation des candidats, offrant une modalité d'imagerie quantitative non destructive pour le criblage phénotypique et les études mécanistiques dans des modèles d'organismes entiers.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en permettant le suivi en temps réel de protéines marquées par fluorescence et de structures cellulaires au cours de l'embryogenèse.
- Écrans (screening) : Assure la préparation des tests grâce à des protocoles standardisés de préparation des lames, de caractérisation du feuillet lumineux et de montage des embryons, garantissant une cohérence dans l'imagerie.
- Analytique : Produit des données quantitatives en 3D et en laps de temps (par exemple, dynamique du fuseau mitotique, trafic des protéines) permettant des comparaisons objectives entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans la continuité préclinique en fournissant des données phénotypiques pertinentes pour les maladies chez C. elegans, un modèle validé pour les voies développementales conservées.
- Réutilisation en milieu professionnel : Conçu comme un système modulaire assemblé sur une table optique, permettant une utilisation répétée dans divers projets avec un recalibrage minimal.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à l'observation directe et longitudinale de la dynamique des protéines et du comportement cellulaire.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'évolutivité grâce à des procédures standardisées d'alignement optomécanique, de préparation des lames et de montage des embryons.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en permettant une détection précoce de la toxicité développementale, réduisant ainsi l'abandon en phase tardive dû à des risques biologiques non identifiés.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque en fournissant des scores phénotypiques quantitatifs, basés sur l'imagerie, qui éclairent les décisions d'avancement à travers différentes classes de cibles.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en alignement optique, en microscopie à fluorescence et en préparation d'échantillons pour l'imagerie en direct.
- Exige une table optique stable, des sources laser, des objectifs, des plateaux motorisés et une caméra EM-CCD ou sCMOS pour la détection.
- Implique une standardisation interéquipes de la préparation des lames, du stade des embryons et des paramètres d'imagerie afin d'assurer la reproductibilité entre utilisateurs et sites.
- Les considérations d'adaptation incluent la taille de l'embryon, le clarification optique et la compatibilité du milieu de montage lors de l'extension à d'autres systèmes modèles (par exemple, le poisson zèbre, Drosophila).
- Les limitations pratiques comprennent l'efficacité de l'immobilisation des embryons et l'uniformité du feuillet lumineux sur de grands champs de vision, ce qui peut nécessiter une optimisation pour des séances d'imagerie prolongées.
