De voxels à la connaissance: Un guide pratique de la segmentation du complexe microscopie électronique 3D-données

L’objectif global de l’expérience suivante est de segmenter des caractéristiques d’intérêt à partir d’ensembles de données complexes de microscopie électronique 3D de cellules et de tissus pour l’analyse de leur organisation 3D. Ceci est réalisé en collectant un ensemble de données composé d’images individuelles de microscopie électronique. Les données 2D brutes sont ensuite reconstruites en un volume 3D et filtrées pour réduire le bruit et améliorer les caractéristiques d’intérêt. Dans un deuxième temps, les caractéristiques objectives et subjectives des données sont évaluées afin d’éclairer le meilleur choix de méthode de segmentation.

Ensuite, soit l’abstraction manuelle, la génération de modèles, le traçage manuel des caractéristiques d’intérêt. Une segmentation automatisée basée sur la densité ou une segmentation automatisée sur mesure est effectuée pour extraire les caractéristiques d’intérêt. Les résultats montrent des modèles finaux segmentés en 3D des caractéristiques d’intérêt en fonction du triage, des caractéristiques de l’image et des objectifs personnels pour choisir l’approche de segmentation optimale.

Une comparaison entre les différentes approches pour les différents ensembles de données aidera à sélectionner la bonne stratégie de segmentation. Nous démontrons différentes méthodes d’extraction des caractéristiques d’intérêt. Compte tenu de la complexité des volumes d’électromicroscopie subcellulaire, chaque approche a ses avantages et ses limites.

En général, les personnes novices en matière de segmentation peuvent avoir des difficultés car il n’est pas toujours évident d’identifier la meilleure approche pour différents ensembles de données. Avec la ventilation des étudiants diplômés. Tai démontrant la procédure sera BU en tant que post-doctorant automobile.

Dans mon laboratoire, Amit Hassan, un associé de recherche dans mon laboratoire et Joaquin Korea, un ingénieur en systèmes informatiques dans mon laboratoire, la génération de modèles abstraits manuels est utilisée lorsque le seul objectif est de créer un modèle géométrique afin de faire des mesures géométriques. Pour commencer, importez le volume de données dans un programme approprié. Pour la génération manuelle de modèles abstraits, le logiciel kymera est utilisé dans cette démonstration.

Sélectionnez d’abord le fichier et ouvrez-le pour ouvrir la boîte de dialogue d’ouverture du fichier, accédez à l’emplacement du fichier de la carte souhaitée. Ensuite, ouvrez le visualiseur de volume et sélectionnez le style d’affichage des fonctionnalités pour afficher les données avec différents styles de rendu. Ajustez le seuil d’affichage en faisant glisser la barre verticale sur l’histogramme dans la fenêtre du visualiseur de volume.

Naviguez dans le volume 3D pour sélectionner une zone d’intérêt pour la segmentation et recadrez un sous-volume plus petit si nécessaire. Dans la boîte de dialogue du visualiseur de volume, sélectionnez les entités, la sélection de sous-région, cliquez et faites glisser pour créer une boîte rectangulaire autour de la région d’intérêt. Ensuite, placez des marqueurs le long de l’élément d’intérêt et reliez-les avec des linkers le cas échéant jusqu’à ce que le modèle soit terminé.

Pour ce faire, à partir de la barre de menu du visualiseur de volume, sélectionnez outils, boîte de dialogue de suivi de volume. Pour ouvrir la boîte de dialogue du traceur de volume, sélectionnez fichier, nouveau marqueur. Poser. Dans la boîte de dialogue du traceur de volume, vérifiez la souris, placez les marqueurs sur la haute densité, placez les marqueurs sur les données, les marqueurs de déplacement des plans et d’ize lient le nouveau marqueur au marqueur sélectionné et liez les marqueurs sélectionnés consécutivement.

Ensuite, dans la fenêtre du traceur de volume, sélectionnez Placer les marqueurs à l’aide du bouton droit de la souris et insérez des rayons pour les marqueurs et les liens. Ensuite, faites un clic droit sur les données de volume pour commencer à poser des marqueurs. Les marqueurs seront connectés automatiquement dans la boîte de dialogue du traceur de volume.

Sélectionnez un fichier, enregistrez le marqueur actuel. Définissez puis classez le marqueur de fermeture. Poser. Ouvrez un nouvel ensemble de marqueurs pour commencer à construire un modèle dans une deuxième caractéristique d’intérêt souhaitée.

Utilisez des couleurs contrastées entre les jeux de marqueurs pour mettre en évidence les différences entre les caractéristiques. Le traçage manuel des caractéristiques d’intérêt est une approche qui prend beaucoup de temps lorsque la densité de population est relativement faible et que la précision de l’extraction des caractéristiques est primordiale. Pour commencer, importez les données de volume dans un programme avec des options de traçage manuel. Logiciel.

Avec cette capacité, proposez généralement un outil de pinceau de base. Dans cette démonstration, le logiciel Amira est utilisé pour les grands tomos. Sélectionnez Ouvrir les données et faites un clic droit sur le nom du fichier rec.

Cliquez ensuite sur formater, sélectionnez raw comme données de disque volumineux. D’accord, et chargez. Sélectionnez les paramètres de données brutes appropriés à partir des informations d’en-tête et cliquez sur OK.

Basculez et enregistrez sous un nouveau nom de fichier. Pour la séquence d’images 3D, sélectionnez ouvrir les données et sélectionnez le nom de fichier tiff ou le nom de fichier dot mrmc.

Ensuite, basculez, faites un clic droit et sélectionnez enregistrer sous le nom de fichier am. Dans la fenêtre de la visionneuse 3D, sélectionnez ortho slice pour ouvrir le fichier image. Ensuite, utilisez un curseur en bas pour naviguer dans les tranches afin de recadrer les données plus volumineuses ouvertes en tant que données de disque volumineuses.

Basculez le nom du fichier dans la fenêtre du pool, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez l’accès au treillis. Entrez la taille de boîte souhaitée, déplacez-la dans la zone souhaitée et cliquez sur Appliquer. Enregistrez le nouveau fichier.

Ensuite, créez un fichier de segmentation en basculant le fichier dans la fenêtre du pool. Faites ensuite un clic droit et sélectionnez le champ d’étiquette d’étiquetage. Un nouveau fichier sera créé et automatiquement chargé dans l’onglet de l’éditeur de segmentation ainsi que dans le pool d’objets.

Utilisez l’outil pinceau pour tracer la bordure de la première caractéristique d’intérêt. Modifiez la taille du pinceau comme vous le souhaitez, puis utilisez le pointeur de la souris pour tracer la bordure de l’entité qui vous intéresse. Remplissez la zone tracée avec le raccourci F.Ajoutez la sélection en cliquant sur le bouton avec le symbole plus.

Suivez la caractéristique qui vous intéresse dans toutes les tranches et répétez la segmentation manuelle du traçage. Générez un rendu de surface pour la visualisation et l’analyse qualitative ou quantitative de base selon les instructions du guide d’utilisation du logiciel dans l’onglet du pool d’objets, basculez les étiquettes de nom de fichier dans la fenêtre du pool. Cliquez ensuite avec le bouton droit de la souris et sélectionnez surface gen.

Sélectionnez les propriétés de surface souhaitées et cliquez sur Appliquer. Un nouveau fichier nommé surf sera créé dans le pool. Pour visualiser le volume segmenté, basculez le nom de fichier surf dans la fenêtre du pool.

Ensuite, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez la vue de surface. Générer une surface pour la visualisation et l’analyse qualitative comme décrit dans le protocole texte. La segmentation automatisée basée sur la densité est utilisée sur des ensembles de données avec n’importe quelle variété de contraste, de netteté ou d’encombrement pour retirer les densités d’intérêt afin de commencer à importer des données de volume dans un programme équipé d’une baguette magique de seuillage ou d’autres outils basés sur la densité pour la segmentation automatique.

Comme fait dans la technique de traçage manuel des caractéristiques d’intérêt, le logiciel Amira est utilisé dans cette démonstration pour des caractéristiques sans marges clairement distinctes. Utilisez l’outil de seuil en sélectionnant l’icône de seuil. Ajustez un curseur pour ajuster la densité dans la plage souhaitée, de sorte que seules les entités d’intérêt soient masquées.

Cliquez sur le bouton de sélection, puis ajoutez une sélection en cliquant sur le bouton avec le symbole plus ou avec le raccourci. A générer une surface pour la visualisation et l’analyse qualitative comme décrit dans le protocole texte. Tout cela une quatrième approche.

La segmentation automatisée sur mesure peut être utilisée pour segmenter efficacement de grands ensembles de données, mais nécessite des connaissances dans des programmes tels que MATLAB. Veuillez vous référer à la vidéo supplémentaire sur la segmentation personnalisée pour obtenir des instructions étape par étape sur cette méthode Six exemples d’ensembles de données ont été segmentés par quatre approches. La génération manuelle de modèles abstraits, le traçage manuel des caractéristiques d’intérêt, la segmentation automatisée basée sur la densité et la segmentation automatisée sur mesure La génération manuelle de modèles abstraits a été efficace pour la résine.

La tomographie colorée intégrée de stéréocils dans le but était de créer un modèle à des fins quantitatives plutôt que d’extraire des densités exactes pour la tomographie colorée intégrée à la résine d’une paroi cellulaire végétale. La segmentation automatisée basée sur la densité a été la plus efficace pour extraire rapidement la cellulose à travers de nombreuses tranches. Les méthodes manuelles nécessitaient plus d’efforts sur seulement quelques tranches de données.

La génération manuelle de modèles abstraits a produit le triplet de microtubules dans la tomographie de stade du kinocilium, tandis que les deux approches automatisées ont extrait les densités plus rapidement et ont donc été préférées en raison de la forme des mitochondries à partir de faisceaux d’ions focalisés, la microscopie électronique à balayage des cellules épithéliales mammaires. Le traçage manuel a fourni le résultat le plus net et la faible densité de population a permis une segmentation rapide. Compte tenu du grand volume à segmenter, la segmentation automatisée sur mesure s’est avérée être la plus efficace pour segmenter les données de bactéries de microscopie électronique à balayage de bloc de série.

Bien que prenant du temps, la seule méthode pour extraire la microscopie électronique à balayage à faisceau d’ions focalisés de la membrane des cellules épithéliales mammaires était le traçage manuel. Le développement des approches de segmentation ouvre la voie aux chercheurs de ce domaine émergent de la biologie cellulaire structurale pour explorer et déterminer l’architecture cellulaire 3D au niveau des complexes macromoléculaires, des organites et des cellules dans une grande variété de cultures cellulaires, de cultures organoïdes ou d’organismes modèles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de choisir et d’appliquer l’approche de segmentation optimale pour votre ensemble de données.