Fabrication de substrats de culture complexe robotisée microcontact impression (R-uCP) et substitution nucléophile séquentielle

L’objectif global de l’expérience suivante est de générer des substrats de culture tissulaire avec plusieurs brosses PEG à micro-motifs, présentant des chimies orthogonales qui permettent une immobilisation spatialement précise et spécifique au site des ligands biologiques. Ceci est réalisé par des réseaux de dépôt de thiol d’acane, un initiateur TRP par une impression par micro-contact robotisée sur des substrats recouverts d’or. Comme deuxième étape de l’IS, un TRP est effectué sur les substrats de micro-motifs, ce qui génère des brosses PEG avec des groupes de brome terminaux.

Ensuite, les groupes brome terminaux sont fonctionnalisés avec un ou deux groupes chimiques réactifs afin de permettre la mobilisation par voie IM de ligands biologiques correctement préparés. Ensuite, l’ensemble du processus est répété pour fonctionnaliser avec un deuxième groupe chimique. Les résultats montrent des microréseaux de deux brosses PEG fonctionnalisées orthogonalement superposées avec une précision de 10 microns.

Ceci est vérifié à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images personnalisé après conjugaison des groupes réactifs avec des molécules fluorescentes. Le principal avantage de cette technique par rapport à des méthodes telles que l’impression manuelle par micro-contact est que l’impression par micro-contact robotisée est capable de superposer plusieurs étapes d’impression avec une précision au micron, tout en permettant une flexibilité et une conception de substrat maximales. La précision offerte par cette méthode, couplée à des réactions de substitution nucléophile séquentielles, nous permet de générer des substrats de culture tissulaire qui sont fonctionnalisés avec de multiples ligands biologiques qui sont ensuite capables d’exercer un contrôle temporel et spatial du sulfate à l’échelle du micron

Avant S-I-A-T-R-P, une diapositive de couverture recouverte d’or aurait dû être dessinée par un tampon A-P-D-M-S. Cette procédure relativement courante est expliquée dans un protocole textuel. Commencez par retirer la glissière du couvercle vernie du robot en relâchant l’aspirateur.

Ensuite, transférez-le dans une fiole de 50 millilitres de longueur, fermez la fiole et appliquez un vide négatif de 30 PSI. Ensuite, ajoutez 5,5 millilitres de mélange réactionnel A TRP dans le ballon à l’aide d’une seringue, puis ajoutez 0,5 millilitre de L ascorbate de sodium dans l’eau également à l’aide d’une seringue. Observez la réaction changer de couleur du vert clair au brun foncé.

Laissez la réaction se poursuivre pendant 16 heures sous gaz inerte. Lorsque la réaction est terminée, retirez la lame du couvercle et rincez-la à l’éthanol, puis à l’eau, puis à nouveau à l’éthanol. Ensuite, séchez-le doucement avec de l’azote.

Le microréseau des pinceaux greffés P-E-G-M-E-M-A doit être visible à l’œil nu. Utilisez la microscopie pour révéler ces changements en détail afin de fonctionnaliser Azad, les chaînes P-E-G-M-E-M-A. Transférez la diapositive de couverture du motif dans un flacon réactionnel en verre de 20 millilitres et ajoutez six millilitres de DMF contenant 100 millimolaires d’azoture de sodium.

Laissez la réaction durer 24 heures à 37 degrés Celsius. Le lendemain, rincez la lame de couverture vernie avec de l’éthanol et séchez-la sous un léger jet d’azote pour pacifier les chaînes P-E-G-M-E-M-A fonctionnalisées au brome restantes. Transférez la lame de couverture du micro-motif dans un flacon de réaction en verre de 20 millilitres et ajoutez six millilitres de DMSO contenant 100 millimolaires d’éthanolamine et 300 millimolaires de triéthylamine.

Laissez cette réaction se poursuivre pendant 24 heures à 40 degrés Celsius le lendemain. Rincez la lame de couverture du motif avec de l’éthanol et séchez-la doucement sous un jet d’azote. L’étape suivante consiste à répéter l’impression par micro-contact robotisée à l’aide d’un deuxième tampon PDMS et après l’estampage.

Utilisez à nouveau SI A TRP pour représenter graphiquement le deuxième pinceau PEG micro-réseau. Ensuite, il est temps de fonctionnaliser à l’acétylène la deuxième chaîne de micro array P-E-G-M-E-A François. La couverture du micro-motif.

Glisser dans un flacon de réaction en verre de 20 millilitres avec six millilitres d’amine de propagation molaire de 100 millilitres dans du DMF. Laissez la réaction se poursuivre pendant 24 heures. Le lendemain, à température ambiante, rincez la lame du couvercle verni avec de l’éthanol et séchez-la sous un léger jet d’azote.

La glissière de couverture brevetée est alors prête pour l’exaltation à la biotine. Commencez par placer la lame du couvercle micro-breveté dans un flacon de réaction en verre de 20 millilitres. Tout d’abord, la biotine a mangé les chaînes terminées par l’acétylène.

Ajoutez six millilitres de sulfate de cuivre avec le conjugué azoté PEG quatre biotine dans le flacon de réaction, suivi de 1,2 millilitre de 0,15. De l’acide rbique millimolaire dans l’eau pour initialiser la réaction, faites buliser la réaction avec de l’azote pendant 10 secondes. Fermez ensuite le flacon avec du paraform et laissez aller la réaction pendant 24 heures.

À température ambiante le lendemain, rincez la lame de couverture à l’eau et transférez-la dans un plat en polystyrène à 12 puits. Ensuite, à température ambiante chez DPBS avec du sérum d’âne pendant une heure, une heure plus tard, colorez les groupes exaltés de biotine avec le streptocoque DEIN 5 46 conjugué à deux microgrammes par millilitre dans DPBS et colorez pendant deux heures à température ambiante deux heures plus tard. Rincez cinq fois la glissière de couverture dans DPBS avec de la végétation douce.

Tobi ITIN aate les chaînes terminées azi. Placez la lamelle dans un puits d’une plaque de polystyrène à six puits et appliquez deux millilitres de DPBS contenant 20 micromolaires D-B-C-O-P-G quatre biotine. Ensuite, incubez la lame de couverture pendant 24 heures à température ambiante 24 heures plus tard.

Rincez la lame de couverture comme avant quatre et teignez-la avec de la streptavidine 4 88. Conjugué à deux microgrammes par millilitre dans le DPBS. Deux heures plus tard.

Rincez à nouveau la diapositive de couverture, puis imagez-la au microscope. Utilisation de ce protocole d’impression par micro contact robotisé. Un ensemble précis de brosses PEG ANN UI avec des groupes d’alkin terminaux a été modélisé dans un ensemble séparé de brosses PEG ANN UI plus grandes avec des groupes azi terminaux.

La distribution spatiale des groupes azide et alkin a été observée à l’aide de la chimie click et de la liaison à la streptavidine des sondes fluorescentes. Une superposition des deux canaux fluorescents montre que les tampons ne se chevauchent pas. La précision de l’alignement a été calculée à moins de 10 microns, ce qui est à la limite du SCAR.

Un système utilisé pour faire l’impression. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des substrats de culture tissulaire personnalisés à l’aide de l’impression par micro-contact robotisée pour superposer plusieurs réseaux de brosses à chevilles. Fonctionnalisé avec des chimies orthogonales.