Name: Fabrication de substrats de culture complexe robotisée microcontact impression (R-uCP) et substitution nucléophile séquentielle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Découvrez la fabrication automatisée de substrats de culture tissulaire avec brosses PEG micropatternées et chimies orthogonales. Cette méthode permet l'immobilisation spatialement précise de ligands biologiques pour l'ingénierie tissulaire.

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Le financement de ce travail, GTK, TK et JDM a été fourni par le Wisconsin Institute for Discovery et la Wisconsin Alumni Research Foundation.

1. Génération élastomères Timbres <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pour générer les maîtres de silicium du timbre de PDMS, concevoir les modèles de fonction du photomasques en utilisant un logiciel de conception assistée par ordinateur. <ol><li> Concevoir le premier motif comme une matrice 20 x 20 d'anneaux de 300 um de diamètre interne (ID) et de 600 um à 1200 um OD espacement centre-à-centre. </li><li> Concevoir le second modèle en tant que matrice de 20 x 20 avec des anneaux 600 de ID 900 um um et 1200 um OD avec un espacement de centre à centre. </li><li> En outre, placer 1 x 1 mm 2 points de référence carrés aux quatre coins de la conception de chaque réseau espacé 1200 um centre-à-centre du motif de coin à un angle de 45 °. </li><li> Fabriquer les maîtres de silicium utilisés dans cette expérience avec 1: 1 ratio d'aspect, en corrélation avec une fonction profondeur de 300 um en utilisant des techniques de lithographie standard présentés ailleurs 15 ou en collaboration avec une fonderie microfluidique. Remarque: La fonction profondeurs inférieure à 100 um peuvent entraîner une déformation anormale de timbres avant contact avec des surfaces de substrat. NOTE: Ce protocole commence par avoir des maîtres de silicium déjà obtenues avec les modèles décrits de résine photosensible, qui nécessite un équipement spécialisé et des chambres propres à créer. Il est préférable de consulter un centre de fabricant ou de base pour créer ces maîtres motifs. </li></ol></li><li> Maîtres de silicium silaniser O / N par incubation avec (tridécafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) la vapeur d'trichlorosilane. REMARQUE: Silane vapeur est hautement toxique et ne doit être manipulé dans une hotte chimique. </li><li> Créez des répliques inverse des maîtres de silicium par durcissement d'un ratio de 10: 1 de PDMS pré-polymère et PDMS agent sur le dessus des maîtres de silicium silanisés durcissement dans un plat de Pétri O / N à 60 ° C. </li><li> Retirez les timbres de PDMS par les maîtres de silicium, et coller les timbres à l'acrylonitrile butadiène styrène (ABS) supports ou tout autre matériau rigides en utilisant de la colle. REMARQUE: Le matériau de choix ne doit pas être transparent ou biocompatible. Toutefois, il doit fournir une surface plane pour l'interface avec l'outillage robotique et une plus grande rigidité que le PDMS. </li></ol> 2. Préparation Couvre-objets <ol style="margin-left: 40px;"><li> Couvre-objets de microscope de rinçage (24 mm x 50 mm n ° 1) dans du toluène, du methanol et de traitement par ultrasons dans de l'acétone pendant 1 min avant de le rincer avec de l'éthanol et séchage sous un léger courant d'azote. REMARQUE: Manipulez le toluène et l'acétone que dans une hotte chimique. </li><li> Couvre-objets Coat avec ~ 3,5 nm de titane (Ti), suivie par 18,0 nm d'or (Au) à l'aide d'un évaporateur à faisceau d'électrons focalisé. Remarque: Cette procédure est compatible avec une grande variété de substrats d'or revêtu, y compris le silicium et le polystyrène. Bien qu'il soit possible de générer celles-ci sur le site, des substrats revêtus d'or sont également disponibles par l'intermédiaire de fournisseurs commerciaux. REMARQUE: couches Ti devrait être d'au moins 3 nm d'épaisseur, tandis que Au couches sur des substrats devraient être unt moins 5 nm d'épaisseur, et peut aller jusqu'au bout de 1 mm d'épaisseur en fonction des propriétés optiques idéales du substrat final 16,17. Substrats sont pas tenus d'être optiquement clair pour la fabrication; Cependant, il facilite l'analyse microscopique de substrats fabriqués. </li><li> Rincer Couvre-objets revêtues d'or avec de l'éthanol et sèche sous azote doux immédiatement avant utilisation. </li></ol> 3. R-uCP de couronne extérieure <ol style="margin-left: 40px;"><li> Avant R-uCP avec le système conforme sélective bras de robot articulé (SCARA), calibrer les effecteurs d'outils robotiques et des systèmes à double caméra d'accompagnement en utilisant le logiciel du système. NOTE: Ces outils sont illustrés dans la Figure 1. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg"> Figure 1. R- système uCP et le bras robotique Outillage. (A) de vue à grande échelle de système R-uCP avec tout l'outillage et des accessoires, (a) ventouse, (b) un bain de réactif, (c) face à la caméra vers le bas, (d) timbre de nidification appareil, (e) robotique outil. (B) outillage de bras robotique représentant (f) outil de gravure diamantée et (g) de l'outil d'aspiration pneumatique tenant un (h) PDMS timbre ABS adossés. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Placer manuellement un timbre de PDMS avec 600 ID um et 900 um OD saillie anneaux face vers le bas dans l'appareil timbre de nidification. Placer manuellement un coverslide revêtu d'or fraîchement nettoyée au-dessus du mandrin à vide, affiché dans la figure 1A, et l'immobiliser à l'aide du vide de laboratoire connecté. </li><li> Utilisation des commandes de robots, aligner la caméra vers le bas sur le point de le coverslide revêtu d'or centre, comme dans la figure 2A. NOTE: Ce point peut d'abord être défini par inspection visuelle et ne nécessite pas une grande précision, comme le timbre de PDMS est beaucoup plus larger que la lame d'or revêtu. </li><li> Demandez le bras robotique de graver quatre référence "X" marque aux sommets d'un carré avec des dimensions de 3,8 mm par 3,8 mm centré sur le coverslide revêtu d'or en utilisant l'outil de gravure diamantée fixée au bras robotique. (Représentée à la figure 2B; processus automatisé) REMARQUE: Ceci assure aux quatre marques de référence sont à l'intérieur d'une image visuelle de la caméra vers le bas. </li><li> En utilisant les robots outillage d'aspiration pneumatique, pick-up et détiennent les PDMS timbre de 1 mm au-dessus du luminaire timbre de nidification comme dans la figure 2C. (Processus automatisé) </li><li> Utilisation de la caméra vers le haut et anneau d'éclairage LED illustré à la figure 2D et E, de visualiser les repères de la place de la vignette et les identifier avec le logiciel de la caméra 10 fois afin de déterminer X moyenne du timbre, Y, et décalage angulaire du centre de la axe robot outillage. (Processus automatisé) </li><li> Comme dans REMARQUE: Un calcul interne est effectuée par le logiciel du système robotique d'aligner précisément de l'empreinte et la lamelle de X, Y emplacements de centre et des décalages angulaires dans les futures étapes R-uCP. </li><li> 3.8) Placer le tampon dans un bain de alcanethiol initiateur ATRP, ω-mercaptoundecyl bromoisobutyrate (2 mM dans l'éthanol) tel que représenté sur la figure 2F. (Processus automatisé) </li><li> Enlevez le tampon de la solution de alkanethiol et placez-le sur courant d'azote sous pression à 0,48 bar (5 psi) pour faire évaporer l'éthanol comme dans la figure 2G. Après 1 min d'augmenter la pression du courant d'azote est de 1,03 bar (15 psi) pour assurer la sécheresse uniforme. (Processus automatisé) REMARQUE: séchage incomplet entraînera la perte totale ou partielle de modèle fidélité. </li><li> Après séchage, le timbre se déplacer au-dessus de la position centrale calculée de la lame d'or revêtu et de l'abaisser à 100 um incréments tout en contrôlant la force du moteur d'axe Z comme illustré sur la figure 2H. NOTE: Ce communiqué est aussi connu par le couple moteur de l'axe Z et affiché dans le logiciel de guidage de robot. (Processus automatisé) </li><li> Arrêter l'abaissement du timbre une fois la pression prédéterminée de 79,2 kPa a été atteint, et maintenir le contact avec la lame d'or revêtu pendant 15 sec. (Processus automatisé) REMARQUE: Les valeurs de pression ici sont optimisés pour la conception du timbre et fonction hauteur actuelle. Si la conception du timbre est modifié, en particulier pour le rapport d'aspect élevé timbres, régler ces en conséquence par un processus d'essais et d'erreurs. </li><li> Retirer lentement le cachet de la lame d'or revêtu et placer le timbre de retour dans la fixation timbre de nidification. (Processus automatisé) </li></ol> 4. SI-ATRP de PEGMEMA sur microélectrodes Couvre-objets <ol style="margin-left: 40px;"><li> Relâchez la pression du vide en maintenant la coverslide microélectrodes, et de la transférer à un ballon de Schlenk de 50 ml. Seal et dégazer le ballon de Schlenk l'aide d'une pompe à vide. </li><li> Ajouter 5,5 ml de mélange réactionnel ATRP contenant le macromonomère PEGMEMA (208,75 mmol), de l'eau (34,4 ml), du methanol (43,8 ml), de cuivre (II), le bromure de (1 mmol) et de 2 ', 2-bipyridine (3 mmol) de le ballon de Schlenk. </li><li> Ajouter 0,5 ml d'ascorbate L-sodium (454,3 mM) dans de l'eau pour amorcer la réaction, et lui permettre de continuer pendant 16 heures à température ambiante sous gaz inerte. REMARQUE: Après l'ajout d'ascorbate L-sodium, couleur de réaction se déplacera du vert clair au brun foncé, comme illustré sur la figure 3A-B. NOTE: La réaction peut continuer au-delà de 16 heures, mais il ne sera pas augmenter de manière significative la longueur des brosses de PEG. </li></ol><imgalt src='"/' files ftp_upload></imgalt> Figure 3. Ouverture de SI-ATRP. (A) Initiation de réaction et (B) changement de couleur suite après l'addition de L-ascorbate de sodium. L'image (C) Microscope de surface de coverslide microélectrodes en suivant la procédure SI-ATRP. Barre d'échelle 1 mm. <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li> Retirez le coverslide microélectrodes du ballon Schenk et rincer avec de l'éthanol, de l'eau et de l'éthanol et sécher sous un léger courant d'azote. NOTE: Après SI-ATRP, les modifications de surface doit être visible à l'œil et peut être imagé et analysé au microscope comme dans la figure 3C. NOTE: Ceci est la méthode la plus simple pour tester la précision de l'essai car il évite d'avoir à immunocoloration les substrats. </li></ol> 5. La fonctionnalisation des chaînes azoture de microélectrodes PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Placez le coverslide microélectrodes dans 20 ml de réaction flacon en verre. </li><li> Ajouter 6 ml de N, N-diméthylformamide (DMF) contenant de l'azoture de sodium à 100 mM dans le flacon de réaction. Maintenir cette réaction à 37 ° C pendant 24 heures. REMARQUE: Manipulez DMF que dans une hotte chimique. Faites preuve de prudence lors de la pesée à l'azoture de sodium. </li><li> À la fin, retirez le coverslide microélectrodes du flacon de réaction et rincer avec de l'éthanol puis à l'eau et à sec sous un courant d'azote. </li></ol> 6. passivation des chaînes de brome fonctionnalisés PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Placez coverslide microélectrodes en flacons de 20 ml de réaction de verre. </li><li> Ajouter 6 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) contenant 100 mM d'éthanolamine et de la triéthylamine 300 mM dans le flacon de réaction. Maintenez cette réaction à 40 ° C pendant 24 heures. REMARQUE: Manipulez DMSO, l'éthanolamine, la triéthylamine et seulement dans une hotte chimique. </li><li> À la fin enlever le coversl microélectrodeside du flacon de réaction, rincer avec de l'éthanol puis à l'eau et à sec sous un courant d'azote. </li></ol> 7. R-uCP de anneau intérieur et SI-ATRP de PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Effectuer les étapes uCP-R tel que précédemment décrit dans les étapes 3.2 et 03.06 à 03.12, en substituant un timbre de PDMS à 300 um et 600 um ID OD anneaux en saillie, de telle sorte que les anneaux de petits éléments sont placés à l'intérieur des anneaux précédemment microélectrodes. REMARQUE: Le seuil de pression pour ce timbre est de 132,0 kPa. Comme mentionné précédemment, ces réglages de pression sont optimisés pour les caractéristiques de timbre utilisés dans cette expérience. </li><li> Effectuer les étapes SI-ATRP comme précédemment décrit dans les étapes 04.01 à 04.04. </li></ol> 8. acétylène fonctionnalisation des chaînes microélectrodes PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Placez coverslide microélectrodes dans 20 ml de réaction flacon en verre. </li><li> Ajouter 6 ml de DMSO contenant 100 mMpropargylamine dans le flacon de réaction. Maintenir cette réaction à température ambiante pendant 24 h. REMARQUE: Manipulez DMSO et propargylamine seulement dans une hotte chimique. </li><li> À la fin enlever le coverslide microélectrodes du flacon de réaction et rincer avec de l'éthanol puis à l'eau et à sec sous un courant d'azote. </li></ol> 9. Cuivre catalysée "Cliquez sur" Biotinylation d'acétylène Terminé Chaînes PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Placez coverslide microélectrodes dans 20 ml de réaction flacon en verre. </li><li> Ajouter 6 ml de sulfate de cuivre (15 mM) / Tris [(1-benzyl-1 H -1,2,3-triazole-4-yl) méthyl] amine (TBTA, 30 mM) (1: / v 1 v eau / DMF) contenant 562 uM de l'azoture de PEG-4 -Biotin conjugué dans le flacon de réaction. Ajouter 1,2 ml d'acide L-ascorbique (0,15 mM) dans de l'eau au mélange pour initialiser la réaction. </li><li> Bubble azote à travers la solution de réaction pendant 10 sec, sceller la fiole avec du parafilm, et réagir pendant 24 heures à température ambiante. </li><li> Lors des achèvementsn enlever coverslide microélectrodes du flacon de réaction, rincer avec de l'eau et placez-le dans une boîte en polystyrène de 12 puits. </li></ol> 10. immunofluorescence détection biotinylé Groupes d'acétylène <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bloquer coverslide microélectrodes dans DPBS (3% âne sérum) pendant 1 heure à température ambiante. Teinture pour les groupes acétylène biotinylés avec de la streptavidine-546 conjugué (2 pg / ml) dans SPD (3% de sérum d'âne dans PBS) pendant 2 heures à température ambiante. </li><li> Rincer coverslide microélectrodes 5 fois avec DPBS pendant 10 min avec agitation douce. REMARQUE: la figure 4B représente une image de la diapositive après cette étape est terminée. </li></ol> 11. cuivre-libre "Cliquez sur" Biotinylation d'azoture Terminé Chaînes PEGMEMA Remarque: Si on le souhaite, cette étape de modification du substrat peut être réalisé in situ au cours de la culture cellulaire. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Laissez coverslide microélectrodes dans 12 puits pplat olystyrene SPD après rinçage. </li><li> Ajouter 2 ml de SPD (ou milieux de culture cellulaire contenant 20 uM) DBCO PEG-4 -Biotin, et laisser cette réaction se poursuivre pendant 24 heures à température ambiante (ou à 37 ° C dans un incubateur). </li><li> À la fin, rincer coverslide microélectrodes 5 fois avec DPBS (ou simplement effectuer un changement de support). </li></ol> 12. immunofluorescence détection biotinylé groupes azoture <ol style="margin-left: 40px;"><li> Teinture pour les groupes azide biotinylés avec un conjugué streptavidine-488 (2 pg / ml) dans 2 ml de DPBS (3% de sérum d'âne) pendant 2 h à température ambiante. </li><li> Rincer coverslide microélectrodes 5 fois dans DPBS pendant 10 min avec agitation douce. </li><li> Image microélectrodes coverslide utilisant la fluorescence confocale microscope. Figure 4A-C représente les images de la diapositive après cette étape est terminée. REMARQUE: Lors de l'utilisation de substrats pour des essais de culture de tissus, sauter des sections 10 et 12 du présent protocole. Après le degre souhaitéee de fonctionnalisation, stériliser le coverslide conçu par rinçage les deux faces avec 100% d'éthanol et le séchage sous un courant d'azote. Placer les lames dans une enceinte de sécurité biologique stérile et rincer la lame avec PBS cinq fois avant de procéder à l'ensemencement et à la culture cellulaire. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêt financier concurrent.

Substrats Idéal pour l&#39;ingénierie tissulaire seraient bioinspirée et ainsi récapitulent la répartition spatiale des ligands bioactifs essentiels trouvés dans les tissus natifs. Ils seraient également posséder des propriétés dynamiques qui permettent des ajustements temporels des ligands et les structures spatiales dans lequel elles sont présentées pour permettre la morphogenèse du tissu réalisé et l&#39;espace restreint induction du destin cellulaire. Fabrication de ces substrats nécessite l&#39;immobilisation de pl...

La capacité des surfaces PEG greffées à afficher ligands biochimiques liés de manière covalente tout en maintenant les propriétés inhérentes non-fouling font un choix idéal pour les environnements à micro-ingénierie personnalisés sur des substrats de culture 1,2,3. Les interactions biospécifiques à médiation par un ligand conjugué PEG permet de brosses analyse réductrice des effets des signaux biochimiques qui se trouvent dans des micro-environnements complexes dans des tissus in vivo sur des phénotypes cellulaires individuelles. En outre, la chimie bio-orthogonal «clic» peut être utilisé pour faciliter l&#39;immobilisation de ligands directionnel de sorte qu&#39;ils sont présentés dans les conformations natives 6.4. Ainsi, la structuration spatiale microscopique de PEG brosses est un outil polyvalent pour créer concepteur dans des niches in vitro pour étudier la signalisation cellulaire induite par 6,7 signaux biochimiques immobilisés. Une méthode courante pour générer des motifs spatiaux de cu biochimiquees entraîne l&#39;impression par microcontact (uCP) substrats d&#39;or revêtu avec des motifs de PEG alcanethiols conjugués. Ensuite, les monocouches microélectrodes auto-assemblées (SAM) d&#39;alcane-thiols de PEG-ylated restreint adsorption physique des molécules biochimiques, par exemple, des protéines, uniquement à des régions non-motif du substrat 8,9. Cependant, les SAM générés par cette technique sont sensibles à l&#39;oxydation à long terme des milieux de culture cellulaire. Ainsi, μCP&#39;d alkanethiol SAM sont souvent plus greffé avec brosses de polymères de PEG par transfert d&#39;atomes de surface initié polymérisation radicalaire (SI-ATRP) pour augmenter la stabilité non-fouling 10 de la région. Plus précisément, uCP de l&#39;initiateur de polymérisation alcanethiol, ω-meraptoundecyl bromoisobutyrate, sur des surfaces revêtues d&#39;or, suivie par SI-ATRP de poly (éthylène glycol) méthyl méthacrylate de l&#39;éther (PEGMEMA) monomères génère des surfaces ayant une longue durée microélectrodes, stable et non encrassement PEG brosses. En outre, ceux-ci<html> sont susceptibles d&#39;être davantage modifiée pour présenter des fractions chimiques divers 11. Profitant de cette propriété, et Sha. al. développé une méthode pour concevoir des substrats de culture avec des brosses de PEGMEMA plusieurs composants chimiques présentant orthogonales &quot;clic&quot;. Dans ce procédé, on utilise une série d&#39;étapes uCP / SI-ATRP intercalées avec de l&#39;azoture de sodium séquentiel, l&#39;éthanolamine, la propargylamine et substitutions nucléophiles pour créer des substrats de culture présentant des motifs micrométriques de plusieurs ligands immobilisés 6. Bien que la possibilité d&#39;utiliser de telles compositions chimiques, en liaison avec uCP manuel pour concevoir de nouveaux substrats de culture est immense, elle est limitée par la précision et l&#39;exactitude avec laquelle de multiples étapes de uCP peuvent être alignés sur un même substrat. Un niveau élevé de précision et d&#39;exactitude serait nécessaire à la fabrication reproductible complexe dans des niches in vitro utilisant ces techniques polyvalents. e_content &quot;&gt; Pour remédier à cette limitation, plusieurs systèmes de uCP automatiques et semi-automatiques ont été générés. Chakra et. al. développé un système uCP dans laquelle timbres personnalisés sont placés sur un système de rail et mis en contact conforme avec lames d&#39;or revêtue par un vérin pneumatique commandé par ordinateur. Cependant, cette méthode nécessite la fabrication précise des motifs de timbres personnalisés et signale une précision de 10 um sans rapport de la précision obtenue lors de l&#39;exécution multiple uCP étapes 12. Plus récemment, une méthode utilisant un système intégré de couplage cinématique précision indiquée au-dessous de 1 um en utilisant un modèle unique, mais ont été incapables d&#39;aligner avec précision plusieurs motifs en raison d&#39;un manque de contrôle précis des caractéristiques de timbre de moule pour mouler 13. En outre, les deux procédés antérieurs exigent le substrat reste fixe entre les étapes de mise en forme , ce qui limite considérablement la diversité des compositions chimiques de modification de surface qui peuvent êtreutilisé. Ici, nous décrivons un système R-uCP automatisé capable d&#39;alignement exacte et précise de plusieurs étapes de uCP tout en permettant une flexibilité maximale dans la conception et la fabrication timbre. En outre, les substrats peuvent être retirés à motifs à plusieurs reprises à partir de pièces estampées entre le système, ce qui permet l&#39;utilisation de diverses compositions chimiques de modification du substrat, y compris les substitutions nucléophiles séquentielles. L&#39;utilisation de tels substrats modifiés chimiques ont été utilisées pour la culture de cellules préalablement à la fois par nous et d&#39;autres 6,14 7. Par conséquent, nous avons fusionné R-uCP et des réactions de substitution nucléophiles séquentielles de développer un procédé de fabrication évolutive de substrats de culture avec des indices biochimiques complexes et microélectrodes.

<table><tbody><tr><td>SCARA&nbsp ;</td><td>Epson</td><td>LS3-401ST</td><td>Des modèles haut de gamme avec une précision accrue sont disponibles si vous le souhaitez.</td></tr><tr><td>(Tridécafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyl)trichlorosilane</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td>ATTENTION, Ne doit être manipulé que dans une hotte chimique. Lors de la silanisation des gaufrettes, personne ne doit entrer dans la hotte tant que tout le silane n’a pas été évaporé.</td></tr><tr><td>Kit d’élastomère de silicone Sylgard 184</td><td>Ellsworth Adhesive Co</td><td>NC9020938</td><td>Dégazer rapidement les solutions par exposition sous vide avant utilisation. D’autres kits tels que le kit 182 sont acceptables.</td></tr><tr><td>Lames de verre de couverture #1 de 24 mm x 50 mm Fisher</td><td>Scientific</td><td>48393106</td><td>Celles-ci peuvent être achetées auprès d’un certain nombre de fournisseurs avec des dimensions variables en fonction des besoins.</td></tr><tr><td>CHA-600 Telemark Évaporateur à faisceau d’électrons</td><td>Telemark</td><td>SEC-600-RAP</td><td>Nécessite une formation spécialisée.</td></tr><tr><td>EPSON LS3 SCARA</td><td>EPSON</td><td>LS3-401ST</td><td></td></tr><tr><td>&omega ;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate</td><td>Prochimia</td><td>FT 015-m11-0.2</td><td>Conserver à -20 &deg ;C. D’autres initiateurs ATRP peuvent être utilisés comme ce R-&mu ; La plateforme CP est applicable à toutes les modalités de micropatterning.</td></tr><tr><td>Schlenk Tube Flask 50 ml</td><td>Synthware</td><td>60003-078</td><td>Nécessite des bouchons en caoutchouc avec diaphram.</td></tr><tr><td>Méthacrylate de poly(éthylène glycol) méthyléther</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td>Livré contenant des inhibiteurs de lecture sans MEHQ et BHT.</td></tr><tr><td>Méthanol (certifié ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>ATTENTION, manipuler uniquement dans une hotte chimique.</td></tr><tr><td>Bromure de cuivre(II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>437867</td><td>ATTENTION, limitez l’exposition avec un masque chirurgical.</td></tr><tr><td>2,2'-Bipyridine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305</td><td>ATTENTION, limiter l’exposition avec un masque chirurgical.</td></tr><tr><td>L-Ascorbate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Verre borosilicaté Flacons à scintillation Fisher</td><td>Scientific</td><td>03-340-4F</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>ATTENTION, limiter l’exposition avec un masque chirurgical.</td></tr><tr><td>N,N-dimethyformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>ATTENTION, manipuler uniquement dans une hotte chimique.</td></tr><tr><td>Éthanolamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>398136</td><td>ATTENTION, ne manipuler que dans une hotte chimique.</td></tr><tr><td>Triéthylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td>ATTENTION, manipuler uniquement dans une hotte chimique.</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>ATTENTION, ne manipuler que dans une hotte chimique.</td></tr><tr><td>Propargylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P50900</td><td>ATTENTION, manipuler uniquement dans une hotte chimique.</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>University of Wisconsin Services de distribution de matériaux</td><td>2292</td><td>ATTENTION, manipuler uniquement dans une hotte chimique.</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotin</td><td>ClickChemistryTools</td><td>AZ104-100</td><td>Solubilisé dans</td></tr> du <tr><td>DMF Copper(II) Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td>ATTENTION, limiter l’exposition avec un masque chirurgical.</td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)méthyl]amine (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de phosphate Saline</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td>Les articles contaminés par du sérum d’âne sont considérés comme des matières biologiques dangereuses et doivent être éliminés en conséquence. Divers autres composés ( par exemple BSA) sont disponibles et servent à cette fin.</td></tr><tr><td>Plaque en polystyrène 12 puits</td><td>Thermo Scientifit - NUNC</td><td>07-200-81</td><td>Les plaques peuvent être achetées auprès d’un certain nombre de fournisseurs avec des dimensions variables.</td></tr><tr><td>DBCO-PEG4-Biotin</td><td>Clickchemistytools</td><td>A105P4-10</td><td>Solubilisé dans le DMF</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugue</td><td>Life Technologies</td><td>S-11223</td><td>Solubilisé dans PBS</td></tr><tr><td>Streptavidine, Alexa Fluor 546 Conjugué</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td>Solubilisé dans PBS</td></tr><tr><td>Nikon A1-R Microscope confocal</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti, A1R</td><td>Un microscope épifluorescent est suffisant pour imager des substrats fonctionnalisés.</td></tr></tbody></table>

fabrication de substrats de culture complexe robotisée microcontact impression (r-ucp) et substitution nucléophile séquentielle

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

En ingénierie tissulaire, il est souhaitable de présenter un contrôle spatial de la morphologie tissulaire et du destin cellulaire en culture à l’échelle du micron. Des substrats de culture présentant des brosses greffées en poly(éthylène glycol) (PEG) peuvent être utilisés pour réaliser cette tâche en créant des régions à l’échelle microscopique, non salissantes et résistantes à l’adhésion cellulaire, ainsi que des régions où les cellules participent à des interactions biospécifiques avec des ligands attachés de manière covalente. Pour concevoir des tissus complexes à l’aide de tels substrats, il sera nécessaire de modeler séquentiellement plusieurs brosses PEG fonctionnalisées pour conférer des bioactivités différentielles et alignées dans des orientations à l’échelle microscopique qui imitent les niches in vivo. L’impression par microcontact (CP) est une technique polyvalente pour modéliser de tels pinceaux PEG greffés, mais la CP manuelle ne peut pas être réalisée avec une précision à l’échelle microscopique. Ainsi, nous avons combiné la robotique avancée avec des techniques de lithographie douce et des réactions chimiques de surface émergentes pour développer une méthode assistée par impression par microcontact robotisé (R-μCP) pour fabriquer des substrats de culture avec des motifs complexes, à l’échelle microscopique et hautement ordonnés de brosses PEG présentant des chimies orthogonales « clic ». Nous décrivons ici en détail le flux de travail pour fabriquer de tels substrats.

L'utilisation de techniques manuelles alignement de uCP à l'ingénieur des substrats de culture avec des tableaux de brosses PEG-greffons fonctionnalisés avec orthogonal "clic" chimiques a été démontrée dans des travaux antérieurs 6. Cependant, cette offre un contrôle minimal de l'orientation du motif et se traduit souvent par un chevauchement des zones fonctionnalisés. Ici, un système R-uCP roman est utilisé pour surmonter cette limitation, et sa capacité à motif avec précision une gamme de PEG brosse anneaux...

Les substrats de culture cellulaire fonctionnalisés avec des motifs à l’échelle microscopique de ligands biologiques ont une immense utilité dans le domaine de l’ingénierie tissulaire. Ici, nous démontrons la fabrication polyvalente et automatisée de substrats de culture tissulaire avec plusieurs brosses en poly(éthylène glycol) micropatternes présentant des chimies orthogonales qui permettent une immobilisation spatialement précise et spécifique au site des ligands biologiques.

Fabrication de substrats de culture complexe robotisée microcontact impression (R-uCP) et substitution nucléophile séquentielle

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

L’objectif global de l’expérience suivante est de générer des substrats de culture tissulaire avec plusieurs brosses PEG à micro-motifs, présentant des chimies orthogonales qui permettent une immobilisation spatialement précise et spécifique au site des ligands biologiques. Ceci est réalisé par des réseaux de dépôt de thiol d’acane, un initiateur TRP par une impression par micro-contact robotisée sur des substrats recouverts d’or. Comme deuxième étape de l’IS, un TRP est effectué sur les substrats de micro-motifs, ce qui génère des brosses PEG avec des groupes de brome terminaux.Ensuite, les groupes brome terminaux sont fonctionnalisés avec un ou deux groupes chimiques réactifs afin de permettre la mobilisation par voie IM de ligands biologiques correctement préparés. Ensuite, l’ensemble du processus est répété pour fonctionnaliser avec un deuxième groupe chimique. Les résultats montrent des microréseaux de deux brosses PEG fonctionnalisées orthogonalement superposées avec une précision de 10 microns.Ceci est vérifié à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images personnalisé après conjugaison des groupes réactifs avec des molécules fluorescentes. Le principal avantage de cette technique par rapport à des méthodes telles que l’impression manuelle par micro-contact est que l’impression par micro-contact robotisée est capable de superposer plusieurs étapes d’impression avec une précision au micron, tout en permettant une flexibilité et une conception de substrat maximales. La précision offerte par cette méthode, couplée à des réactions de substitution nucléophile séquentielles, nous permet de générer des substrats de culture tissulaire qui sont fonctionnalisés avec de multiples ligands biologiques qui sont ensuite capables d’exercer un contrôle temporel et spatial du sulfate à l’échelle du micron.Avant S-I-A-T-R-P, une diapositive de couverture recouverte d’or aurait dû être dessinée par un tampon A-P-D-M-S. Cette procédure relativement courante est expliquée dans un protocole textuel. Commencez par retirer la glissière du couvercle vernie du robot en relâchant l’aspirateur.Ensuite, transférez-le dans une fiole de 50 millilitres de longueur, fermez la fiole et appliquez un vide négatif de 30 PSI. Ensuite, ajoutez 5,5 millilitres de mélange réactionnel A TRP dans le ballon à l’aide d’une seringue, puis ajoutez 0,5 millilitre de L ascorbate de sodium dans l’eau également à l’aide d’une seringue. Observez la réaction changer de couleur du vert clair au brun foncé.Laissez la réaction se poursuivre pendant 16 heures sous gaz inerte. Lorsque la réaction est terminée, retirez la lame du couvercle et rincez-la à l’éthanol, puis à l’eau, puis à nouveau à l’éthanol. Ensuite, séchez-le doucement avec de l’azote.Le microréseau des pinceaux greffés P-E-G-M-E-M-A doit être visible à l’œil nu. Utilisez la microscopie pour révéler ces changements en détail afin de fonctionnaliser Azad, les chaînes P-E-G-M-E-M-A. Transférez la diapositive de couverture du motif dans un flacon réactionnel en verre de 20 millilitres et ajoutez six millilitres de DMF contenant 100 millimolaires d’azoture de sodium.Laissez la réaction durer 24 heures à 37 degrés Celsius. Le lendemain, rincez la lame de couverture vernie avec de l’éthanol et séchez-la sous un léger jet d’azote pour pacifier les chaînes P-E-G-M-E-M-A fonctionnalisées au brome restantes. Transférez la lame de couverture du micro-motif dans un flacon de réaction en verre de 20 millilitres et ajoutez six millilitres de DMSO contenant 100 millimolaires d’éthanolamine et 300 millimolaires de triéthylamine.Laissez cette réaction se poursuivre pendant 24 heures à 40 degrés Celsius le lendemain. Rincez la lame de couverture du motif avec de l’éthanol et séchez-la doucement sous un jet d’azote. L’étape suivante consiste à répéter l’impression par micro-contact robotisée à l’aide d’un deuxième tampon PDMS et après l’estampage.Utilisez à nouveau SI A TRP pour représenter graphiquement le deuxième pinceau PEG micro-réseau. Ensuite, il est temps de fonctionnaliser à l’acétylène la deuxième chaîne de micro array P-E-G-M-E-A François. La couverture du micro-motif.Glisser dans un flacon de réaction en verre de 20 millilitres avec six millilitres d’amine de propagation molaire de 100 millilitres dans du DMF. Laissez la réaction se poursuivre pendant 24 heures. Le lendemain, à température ambiante, rincez la lame du couvercle verni avec de l’éthanol et séchez-la sous un léger jet d’azote.La glissière de couverture brevetée est alors prête pour l’exaltation à la biotine. Commencez par placer la lame du couvercle micro-breveté dans un flacon de réaction en verre de 20 millilitres. Tout d’abord, la biotine a mangé les chaînes terminées par l’acétylène.Ajoutez six millilitres de sulfate de cuivre avec le conjugué azoté PEG quatre biotine dans le flacon de réaction, suivi de 1,2 millilitre de 0,15. De l’acide rbique millimolaire dans l’eau pour initialiser la réaction, faites buliser la réaction avec de l’azote pendant 10 secondes. Fermez ensuite le flacon avec du paraform et laissez aller la réaction pendant 24 heures.À température ambiante le lendemain, rincez la lame de couverture à l’eau et transférez-la dans un plat en polystyrène à 12 puits. Ensuite, à température ambiante chez DPBS avec du sérum d’âne pendant une heure, une heure plus tard, colorez les groupes exaltés de biotine avec le streptocoque DEIN 5 46 conjugué à deux microgrammes par millilitre dans DPBS et colorez pendant deux heures à température ambiante deux heures plus tard. Rincez cinq fois la glissière de couverture dans DPBS avec de la végétation douce.Tobi ITIN aate les chaînes terminées azi. Placez la lamelle dans un puits d’une plaque de polystyrène à six puits et appliquez deux millilitres de DPBS contenant 20 micromolaires D-B-C-O-P-G quatre biotine. Ensuite, incubez la lame de couverture pendant 24 heures à température ambiante 24 heures plus tard.Rincez la lame de couverture comme avant quatre et teignez-la avec de la streptavidine 4 88. Conjugué à deux microgrammes par millilitre dans le DPBS. Deux heures plus tard.Rincez à nouveau la diapositive de couverture, puis imagez-la au microscope. Utilisation de ce protocole d’impression par micro contact robotisé. Un ensemble précis de brosses PEG ANN UI avec des groupes d’alkin terminaux a été modélisé dans un ensemble séparé de brosses PEG ANN UI plus grandes avec des groupes azi terminaux.La distribution spatiale des groupes azide et alkin a été observée à l’aide de la chimie click et de la liaison à la streptavidine des sondes fluorescentes. Une superposition des deux canaux fluorescents montre que les tampons ne se chevauchent pas. La précision de l’alignement a été calculée à moins de 10 microns, ce qui est à la limite du SCAR.Un système utilisé pour faire l’impression. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des substrats de culture tissulaire personnalisés à l’aide de l’impression par micro-contact robotisée pour superposer plusieurs réseaux de brosses à chevilles. Fonctionnalisé avec des chimies orthogonales.

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