À haut débit la synthèse des glucides et fonctionnalisation de nanoparticules polyanhydride

Dans cet article vidéo, nous décrivons un nouveau protocole hydro put pour la synthèse automatisée en phase de solution d’oligosaccharides et la fonctionnalisation de nanoparticules de polyanhy. Avec ces agents de ciblage à base de glucides, les premières molécules de glucides sont synthétisées à l’aide d’un système automatisé qui utilise la synthèse en phase solution au lieu des synthétiseurs en phase solide. Ensuite, les intermédiaires oligosaccharidiques sont purifiés par fleuriste, extraction en phase solide ou FSPE.

Les molécules de glucides produites sont caractérisées par RMN, puis elles sont attachées aux nanoparticules de polyanhydride par conjugaison carbo IDE. Enfin, les nanoparticules fonctionnalisées en glucides sont caractérisées par spectroscopie photoélectronique à rayons X et un dosage de l’acide phénylsulfurique hydroputt. En fin de compte, en utilisant la méthodologie hydro put décrite ici, les conditions de réaction permettant d’optimiser la morphologie des nanoparticules et la densité des glucides à la surface des particules ont été obtenues.

Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes, comme la synthèse d’oligosaccharides à face solide, est que dans cette méthode, nous utilisons une quantité nettement plus faible de blocs de construction Dans cette méthode, nous utilisons généralement deux à trois équivalents au lieu de 10 à 20 équivalents. Nous avons d’abord l’idée de cette méthode lorsque nous démontrons l’efficacité des effets de surface, de la fonctionnalisation des poly hydro nanoparticules, de l’utilisation des glucides pour cibler les récepteurs ceep sur les cellules anti-bosselage. Nous avons ensuite voulu concevoir un système à haut débit qui nous permettra de cribler les multiples paramètres impliqués dans la fabrication et l’application de ces nouveaux supports.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car le développement de plates-formes automatisées pour la synthèse à haut débit d’oligosaccharides et leur fixation à des particules de polymère est un nouveau domaine d’investigation sans beaucoup de documentation disponible avant la synthèse automatisée de l’acide diano. Un donneur de sucre convenablement protégé, généralement du tri chloro acétamide et un accepter principalement dans Alcon, l’alcool fluoré sont synthétisés sur la paillasse et préparés dans le chlorométhane préparent également le silo de triméthyle, le sulfonate de tri fluorométhane dans le chlorométhane, 80 % méthanol et 100 % méthanol. Assurez-vous que l’humidité relative de la pièce est de 30 % ou moins dans la chambre d’automatisation.

Une humidité élevée est préjudiciable aux réactions de glycosylation. Les étapes suivantes sont effectuées à l’aide d’une plateforme d’automatisation. La première glycosylation est réalisée avec l’alcool donneur et l’alcool du fleuriste.

Une fois cela fait, la molécule de sucre de l’étiquette de fleuriste résultante est purifiée par le FSPE. Le groupe protecteur temporaire est ensuite éliminé par le sodium, l’oxyde de méthamphétamine et le méthanol, et une fois de plus, le produit est purifié par le FSPE. Après cela, le sucre d’étiquette du fleuriste est utilisé comme accepteur et couplé au même donneur pour obtenir le disaccharide, le disaccharide est purifié par la FSPE pour commencer.

Placez des réactifs, y compris le promoteur accepteur donneur, 80 % d’eau de méthanol, 100 % de méthanol, de l’oxyde de méthamphétamine de sodium dans la plateforme robotique, et lancez le programme. Le bras robotique retirera le donneur puis l’accepteur des flacons et les transférera dans un flacon de réaction. Ensuite, le mélange de donneur et d’accepteur est agité pendant 30 minutes.

Après 30 minutes se sont écoulées. Le bras robotique transfère le silo catalytique de triméthyle, le trifluoro, le sulfonate de méthane dans le mélange. La solution est ensuite agitée pendant 30 minutes supplémentaires Une fois l’agitation terminée, le programme s’arrête.

Prélever une aliquote de 10 microlitres pour vérifier si la réaction est complète par chromatographie sur couche mince. Si la réaction est complète, la molécule accepteuse ne sera pas visible. Si la réaction n’est pas complète, l’accepteur sur le CCM est toujours visible.

Si tel est le cas, arrêtez le programme, réinitialisez le temps de glycosylation autour de 30 minutes et ajoutez un excès du promoteur silo triméthyle, trifluoro, sulfonate de méthane. Lorsque la réaction est terminée, passez à l’étape suivante. Une fois la réaction terminée, le robot transfère le mélange réactionnel dans des cartouches FSPE contenant du gel de silice modifié C nine F 17 pour la purification.

Ensuite, les cartouches sont lavées avec huit millilitres de méthanol à 80 %, suivis de huit millilitres de méthanol à 100 %. Pour éliminer la fraction non floris, le flux est collecté dans un flacon pour obtenir le produit étiqueté fleuriste souhaité. Si une purification supplémentaire est nécessaire, mettez le robot en pause et retirez les produits de réaction appropriés.

Selon la structure, les donneurs peuvent être extrêmement peu réactifs et une certaine molécule d’acceptation du fleuriste sera laissée même après avoir ajouté suffisamment de promoteur. Si tel est le cas, la FSPE ne sera pas assez efficace pour la purification et une purification supplémentaire par chromatographie sur colonne de gel de silice peut être effectuée après la purification, le bras robotique distribue de l’oxyde de méthamphétamine de sodium dans le flacon de réaction. La réaction est ensuite agitée pendant deux heures dans la plate-forme robotique, si elle n’est pas complète comme déterminé par la TLC, prolongez la période d’incubation d’environ une heure.

Une fois la réaction terminée, le produit est purifié par le FSPE comme auparavant. Ensuite, retirez le produit de réaction du robot et sur la paillasse soumis à la dissolution dans du toluène anhydre, suivie d’une évaporation pour éliminer l’eau résiduelle. Une fois qu’un échantillon est sec, replacez-le dans le robot selon le même cycle, y compris la purification par glycosylation par FSPE.

La protection profonde du groupe protecteur temporaire suivie d’une glycosylation est répétée jusqu’à ce que la longueur de chaîne souhaitée soit obtenue pour que la molécule cible déprotège le produit protégé obtenu par automatisation, retire le flacon du robot. Les dernières étapes de la procédure utilisent de l’hydrogène gazeux explosif et doivent être effectuées à l’extérieur de la plate-forme d’automatisation. Sur l’oz de paillasse, la lyse de la double liaison dans l’étiquette du fleuriste se produit et est suivie d’une oxydation de l’aldéhyde produit en acide carboxylique.

Purifier le produit obtenu par chromatographie sur colonne de gel de silice sur une paillasse en utilisant un mélange de 30 % de méthanol dans du chlorométhane. Enfin, pour protéger les groupes benzo-éther par hydrogénation catalysée par le palladium, passez le produit à travers une pastille satellite pour se débarrasser du palladium, afin d’obtenir un produit final pur. Caractériser entièrement le produit à l’aide de la résonance magnétique nucléaire ou de la spectroscopie RMN.

La synthèse de polymères à haute portée et la fabrication de nanoparticules sont effectuées selon le protocole décrit par Peterson et al. Comme il est mentionné dans le document d’accompagnement, l’appareil de dépôt automatisé utilisé pour la fonctionnalisation des particules se compose de trois pompes ne 1000, d’un étage robotisé intégré par deux actionneurs, l’un pour le mouvement dans la direction X et l’autre pour le mouvement dans la direction Y et d’un second étage robotisé avec deux racks adjacents composés de trois actionneurs, Un pour chaque direction : les pompes et un total de cinq actionneurs sont connectés. En série, les actionneurs et les pompes sont commandés par un ordinateur à l’aide d’un logiciel de vue de laboratoire.

Les systèmes de copolymères utilisés pour la fabrication de particules sont basés sur l’acide SEBA ou SA et un six bis, paraïc carboxy, oxil heane ou CPH et un huit BIS para carboxy phénoxy trois six dioxane ou CP Teeg. Après la fabrication des nanoparticules, un rack contenant les tubes de centrifugation de 1,7 millilitre avec une bibliothèque de nanoparticules à l’étage de l’actionneur linéaire pour la fixation des glucides à la surface des particules polyanhy et une réaction moyenne de couplage d’acide carboxylique composée de deux réactions consécutives est effectué pour la première réaction. Remplissez une seringue dans un pousse-seringue programmable avec une solution aqueuse d’EDC et d’éthylènediamine à une concentration de deux milligrammes par milligramme de nanoparticules et de 0,6 milligramme par milligramme de nanoparticules, respectivement.

Remplissez une deuxième seringue dans un pousse-seringue programmable avec 2,5 milligrammes par milligramme de particules de NHSA total de 12 équivalents par échantillon de nanoparticules, une solution aqueuse. Ensuite, à l’aide du programme de vue de laboratoire, demandez au robot de déposer des suspensions de réactifs dans la bibliothèque de nanoparticules. Les actionneurs du robot déplaceraient ensuite le support de tube à la bonne position dans la plate-forme pour la distribution de solutions, EDC et NHS.

Activer les groupes d’acide carboxylique à la surface des nanoparticules de polyanhydride et permettre un couplage moyen. Ensuite, plongez une sonique dans chaque tube et sonisez chaque échantillon pendant 30 secondes à 40 hertz. Avant de passer à l’échantillon suivant, nettoyez la sonde avec de l’acétone.

Une fois tous les échantillons rassasiés, le support de tube est détaché de la plate-forme robotique. Incuber les suspensions de nanoparticules pendant neuf heures avec une rotation constante à quatre degrés Celsius. Les temps de réaction pour la première et la deuxième réaction peuvent être modifiés pour ajuster la concentration finale de saccharide.

Une fois la réaction terminée, centrifugez les tubes à 12 000 fois G pendant cinq minutes. Dans un environnement froid, retournez à la station robotisée. Rattachez le support de tube au bras robotique et remplissez la deuxième seringue dans la plate-forme robotique.

Avec de l’eau froide, la première seringue doit rester vide. Démarrez le robot. Le surnageant de chaque tube est aspiré dans la seringue vide et la deuxième pompe dépose de l’eau froide dans les tubes.

Cette étape est effectuée pour éliminer tous les réactifs non réactifs des suspensions de nanoparticules. Ensuite, homogénéisez la suspension de nanoparticules par sonication comme démontré précédemment. Ensuite, centrifugez les tubes à 12 000 fois G pendant cinq minutes.

Effectuez un deuxième lavage à l’eau froide à l’aide de l’appareil robotisé pour la deuxième charge de réaction : 12 équivalents par échantillon de nanoparticule d’EDC dans la première pompe et 12 équivalents par échantillon de nanoparticule de NHS dans la deuxième pompe. Démarrer la plate-forme robotique pour distribuer des volumes adéquats dans les tubes contenant des nanoparticules. La présence d’EDC et de NHS permettra la formation d’une liaison amide entre les groupes amines du dite d’éthylène déjà attachés à la surface de la nanoparticule et le groupe acide carboxylique du sucre protégé en profondeur.

Une fois le dépôt terminé, chargez 10 équivalents d’un saccharide spécifique. Dans ce cas, le lactose a été utilisé et le contrôle de l’acide glycolique dans les deux pompes disponibles. Chaque saccharide est déposé dans des tubes à essai en fonction de la fonctionnalisation souhaitée à réaliser dans chaque tube, qui est préalablement programmée dans le programme de vue de laboratoire, utilisée pour faire fonctionner les actionneurs et les fonctions de pompe pour la réaction spécifique employée Dans cette étude pour la fixation des glucides, l’acide glycolique est utilisé comme contrôle de liaison puisque les saccharides protégés en profondeur ont déjà cette molécule liée de manière covalente, ce qui permet une fixation supplémentaire à la surface de la nanoparticule.

Les suspensions de nanoparticules sont homogénéisées par sonication comme auparavant, puis incubées pendant neuf heures avec une rotation constante à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, lavez les suspensions de nanoparticules par centrifugation en éliminant le surnageant, puis Resus suspend la pastille dans de l’eau froide et placez les tubes, qui contiennent maintenant la bibliothèque de nanoparticules fonctionnalisées, dans une chambre à vide pour sécher pendant au moins deux heures. Les nanoparticules fonctionnalisées sont caractérisées par une diffusion dynamique de la lumière et d’autres méthodes pour évaluer la composition de surface, la concentration, la taille des particules, la distribution de la taille et la charge de surface.

Le côté diano entièrement protégé présenté ici a été synthétisé à l’aide de la plate-forme d’automatisation. Le composé synthétisé a été caractérisé par RMN des protons dans un spectromètre VXR 400 mégahertz. En utilisant le CDC 13 comme solvant, la formation du produit peut être confirmée par la présence de certains pics caractéristiques.

Dans le diagramme RMN des protons, les quatre protons de 1,79 à 2,21 et les deux protons de 3,38 proviennent de la balise du fleuriste. Le pic singulet à 2,16 correspond aux pics d’acétate à 4,94 et 5,11 sont les protons anomères pour évaluer l’effet du temps de réaction sur la morphologie finale des nanoparticules et le degré d’attachement du sucre atteint. Les nanoparticules ont été fonctionnalisées avec des temps de réaction croissants comme le montre ici, la concentration de diano à la surface de 50 50 nanoparticules CPT CPH a augmenté avec le temps total de réaction et a atteint un maximum après 18 heures.

Des nanoparticules fonctionnalisées avec un temps de réaction total de 24 heures ont ensuite été utilisées pour évaluer leur capacité à cibler les CLR sur des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse de souris à l’aide de la cytométrie en flux, comme illustré ici. Une augmentation de l’expression du signe DC et du récepteur mano aux récepteurs de lectine de type C a été observée après stimulation avec des nanoparticules non fonctionnalisées ainsi que du lactose et du dano. Cela indique un ciblage efficace.

Cependant, les particules fonctionnalisées par Diano ont montré un niveau d’expression plus élevé, indiquant une spécificité de ce ligand pour les récepteurs étudiés. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la synthèse automatisée à haut débit des oligosaccharides ainsi que la fonctionnalisation des poly nanoparticules. En utilisant ces glucides de base chez les agents cibles, une fois maîtrisé, la synthèse du sucre protégé par l’accepteur donneur, ainsi que l’assemblage de l’appareil peuvent être effectués en 24 à 48 heures.

Bien entendu, la durée dépend de la taille de la bibliothèque ainsi que du temps de fonctionnalisation. Lors de l’utilisation de cette méthode, il est important de se rappeler que vous pouvez optimiser les conditions de réaction de la fonctionnalisation des particules polyhydro biodégradables en fonction de la chimie des nanoparticules. En suivant cette procédure, diverses structures de glucides peuvent être synthétisées afin de cibler différents récepteurs cellulaires pour influencer les résultats immunologiques.