Name: Surface-immobilisation fonctionnelle des gènes à l’aide de la lithographie de déplacement multipas Strand (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Découvrez la lithographie bephore pour l'immobilisation de l'ADN sur surfaces et l'expression génique sans cellule. Cette méthode multi-étapes utilise le déplacement d'brins d'ADN et des composants commerciaux.

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Nous reconnaissons le soutien financier à ce projet par la Fondation Volkswagen (subvention no 89 883) et l’European Research Council (subvention contrat n° 694410 - AEDNA). M.S.-S. reconnaît la prise en charge par la DFG par GRK 2062.

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<li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li>
<li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas des intérêts concurrents.

Bephore lithographie est une technique robuste et polyvalente pour l’immobilisation à motifs d’ADN ou d’ARN. Pourtant, la procédure comprend plusieurs étapes, ce qui - si changé - peuvent être une source de l’échec ou réduit les performances du système.
Une étape cruciale dans la fabrication de puces de Bephore est la PEGylation du substrat, qui fournit la biocompatibilité de la surface. Ici, l’étape de nettoyage avec une procédure RCA est important, car il active également la surface pour la ...

Les réactions sont d’un grand intérêt pour diverses applications en biochimie, biotechnologie, biologie synthétique et l’expression des gènes sans cellule. Acellulaire expression de protéines a contribué à la préparation des échantillons de protéines pures, qui faisaient l’objet de nombreuses études en biologie structurale. Par exemple, des systèmes acellulaires ont été utilisés avec succès pour l’expression des protéines complexes1 ou membrane protéines2, qui sont difficiles à produire en utilisant expression basés sur les cellules. Notamment, acellulaire réactions ont également été utilisées pour élucider la structure du code génétique, commençant par les expériences révolutionnaires par Nirenberg et Matthaei en 19613l’expression des gènes.
Récemment, il y a eu un regain d’intérêt pour les méthodes acellulaire en biotechnologie et biologie synthétique4,5,6. Des systèmes acellulaires peuvent être augmentés avec les composés non biologiques, et des composants de diverses origines biologiques peuvent être combinés plus facilement7. Même si des systèmes acellulaires ont l’inconvénient évident qu’ils ne sont pas « cultiver et diviser », il est concevable de préparer ouverts acellulaire bioréacteurs avec fonctions métaboliques de base et leur faire synthétiser des métabolites lorsqu’il est fourni avec l’énergie et de carbone simple entrées8. Dans le domaine émergent de la biologie synthétique, systèmes acellulaires promettent d’être un « châssis » plus prévisible pour la mise en œuvre des fonctions biologiques synthétiques.
Actuellement, les réactions d’expression de gène acellulaires sont effectuées soit à l’aide des extraits cellulaires (à partir de différentes sources telles que les bactéries, les levures, les insectes), ou qui ont été optimisés pour différentes applications (p. ex., des systèmes de transcription/traduction procaryotes et eucaryotes expression génique, production de protéines membranaires, etc.). Un protocole populaire pour la préparation d’extrait de cellule bactérienne (communément appelé TXTL) a été fourni récemment par V. Noireaux et collaborateurs9. Ses propriétés biophysiques ont été soigneusement caractérisés10, et le système TXTL a été déjà utilisé avec succès pour effectuer une série de tâches biochimiques complexes : par exemple, l’Assemblée des bactériophages fonctionnelle via acellulaire expression du génome phagique11, la synthèse des protéines bactériennes filaments12ou la mise en œuvre du gène acellulaire circuits13,14.
Un autre système populaire en biologie synthétique acellulaire est le pur, qui est reconstituée à partir des composantes purifiées15,16. Par rapport au système TXTL, il ne contient pas de nucléases ou mécanisme de dégradation des protéines. Alors que la dégradation de l’ADN linéaire, molécules d’ARN ou de protéines est moins un problème dans le système pur, voies de décomposition sont réellement importants pour la mise en œuvre des fonctions dynamiques. Afin de réduire l’effet de la dégradation de l’exonucléase de modèles linéaires de gène dans le système TXTL (par RecBCD), la protéine de GamS-protection de fin doit être ajouté. Le TXTL tant le système pur sont disponibles dans le commerce.
Un sujet étroitement lié aux préoccupations acellulaire biologie l’étude de l’effet de cloisonnement sur les réactions biochimiques et outre la création de structures artificielles de cellules ou protocells17,18,19 ,,20. Recherche sur les cellules artificielles implique généralement l’encapsulation d’un système de réaction biochimique à l’intérieur des compartiments vésiculaires de phospholipides ou autres amphiphiles. Tandis que ces systèmes aident à explorer les aspects fondamentaux de la compartimentation, ou l’émergence de la cellularité et structures auto-réplication, ils font face à des problèmes typiques des systèmes fermés : en l’absence d’un métabolisme efficace et approprié mécanismes de transport de membrane, il est difficile de garder des réactions compartimentées en cours d’exécution pendant de longues périodes de temps - molécules de carburant ont été utilisés et les déchets s’accumulent.
Une alternative intéressante à la compartimentation à l’intérieur de ces compartiments cellulaires-imitant est l’organisation spatiale du matériel génétique à l’aide de méthodes photolithographiques. Immobilisation des « gènes sur une puce » a été lancée par le groupe Bar-Ziv à l’Institut Weizmann, il y a plus de dix ans21. Parmi les grandes questions qui devaient être résolues ont été l’adsorption non spécifique de l’ADN et l’éventuelle dénaturation des protéines à la surface de la puce. Bar-Ziv et coll. a développé une résistance photolithographie dédiée appelée « Daisy », qui était composé d’un silane terminal réactif pour l’immobilisation des molécules sur les surfaces de dioxyde de silicium, résister à un intercalaire longue de polyéthylèneglycol (PEG) qui a assuré biocompatibilité et une tête de PHOTOCLIVABLES, qui a été transformé en une amine réactive lors de l’irradiation avec la lumière ultraviolette (UV). Il a été démontré que Daisy peut être utilisé pour immobiliser les molécules d’ADN gène-longueur (avec des longueurs de plusieurs kilo paires de bases (KPB)) sur une surface de puce. D’un point de vue de polymère physique, les systèmes représentant brosses polymère greffés sur un substrat solide. En raison de la nature de polyélectrolyte de l’ADN, la conformation de ces brosses est fortement affectée par osmotique et autres effets spécifiques à ion22,23.
Surtout, il a été démontré que substrat immobilisée gènes sont encore fonctionnels et peuvent être transcrit et traduit en ARN et des protéines. Brosses de gène sont accessibles pour les ARN polymérases de solution24, et le mélange complexe macromoléculaire de la transcription/traduction n’est pas dénaturé à la surface. Un des avantages de l’immobilisation des composantes génétiques sur un substrat est qu’ils peuvent être utilisés dans un système de réacteur ouvert microfluidique qui est fourni en continu avec des molécules précurseurs de petite et de quels produits de déchets peut être enlevé25 , 26.
Nous avons récemment mis au point une variante de cette méthode, appelée Bephore (par faisceau d’électrons Biocompatible et résine photosensible)27, qui reposait exclusivement sur les composants disponibles dans le commerce et utilisé des réactions spécifiques séquence ADN brin invasion pour la réalisation d’une procédure de simple-to-implement Lithographie plusieurs étapes pour la création de cellules artificielles à base de puce. Un aperçu schématique de la procédure est illustré à la Figure 1. Il est issu des molécules d’épingle à cheveux ADN contenant un groupe PHOTOCLIVABLES, qui sont immobilisées sur une couche de PEG biocompatible. Photoclivage de l’épingle expose une séquence simple brin pied, à travers lequel l’ADN molécules d’intérêt (qui contient la séquence DIS « DEPLACEMENT ») peuvent être jointe par l’invasion brin induite par le pied.
Alors que Bephore est potentiellement plus simple à mettre en œuvre, Daisy permet la réalisation de très dense et très propre « brosses à gène », qui a des avantages dans certaines applications. En principe, cependant, lithographie de Daisy et Bephore pourrait être facilement combiné. Une méthode connexe Lithographie utilisant déplacement brin ADN pour structurer les ADN brosses sur l’or a été précédemment développé par Huang et al., mais n’était pas utilisé dans le cadre d’expression de gène acellulaire28,29.
Dans le protocole suivant, nous fournir qu'une description détaillée de la production d’ADN brushes pour l’expression des gènes sans cellule à l’aide de la méthode Bephore. Les auteurs décrivent comment les puces sont fabriqués et démontrent l’utilisation de plusieurs étape photo-Lithographie pour l’immobilisation structurée spatialement de gènes sur une puce. Nous discutons également la fabrication des chambres de réaction et l’application de microfluidique pour l’exécution des réactions d’expression génique sur puce.

<table><tbody><tr><td>Plaquette de silicium avec dioxyde de silicium de 50 nm (substrat Bephore)</td><td>Épaisseur de la plaquette</td><td></td> Siegert <td>(&micro ; m) : 525 &plusmn ; 25, Diamètre (mm) : 100</td></tr><tr><td>Plaquette de silicium (pour moule maître PDMS)</td> <td>Épaisseur de la</td><td></td> plaquette Siegert <td>(&micro ; m) : 525 &plusmn ; 25, Diamètre (mm) : 76.2 (3")</td></tr><tr><td>Lames en verre n° 4</td><td>Menzel</td><td></td><td>22 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Lames en verre n° 1.5</td><td>Assistent</td><td></td><td>24 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Silane</td><td>Laysan Bio</td><td></td><td>MW 5 000</td></tr><tr><td>Toluène anhydre</td><td>Sigma Aldrich (Merck)</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>DNA</td><td>Integrated DNA Technologies ( IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix avec tampon HF</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>Kit PCR</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel et système de nettoyage PCR&nbsp ;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Kit de nettoyage par PCR en colonne de centrifugation</td></tr><tr><td>PURExpress</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800S</td><td>Système d’expression acellulaire</td></tr><tr><td>PDMS&nbsp ;</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>F8771</td><td></td></tr><tr><td>Tube en PTFE (ID : 0,8 mm, OD : 1,6 mm)</td><td>Bola</td><td>S 1810-10</td><td></td></tr><tr><td>EpoCore 20</td><td>technologie de micro réserve&nbsp ; GmbH</td><td></td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>mr-Dev 600</td><td>micro resist technology&nbsp ; GmbH</td><td></td><td>Développeur photoresist</td></tr><tr><td>Ti-Prime</td><td>MicroChemicals</td><td></td><td>Promoteur d’adhérence</td></tr><tr><td>Colle silicium à deux composants</td><td>Picodent</td><td>Twinsil&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Protection UV feuille jaune</td><td>Lithoprotect (via MicroChemicals)</td><td>Y520E212</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masks pour photolithographie</td><td>Zitzmann GmbH</td><td></td><td>64.000 dpi, 180x240 mm</td></tr><tr><td>Microscope droit</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td>Photolithographie et imagerie par fluorescence</td></tr><tr><td>Objectif d’immersion dans l’eau 60x</td><td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>Utilisé avec Olympus BX51, NA 0.9</td></tr><tr><td>Objectif à immersion dans l’eau 20x</td><td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>Utilisé avec Olympus BX51, NA 0.5</td></tr><tr><td>Appareil</td><td>photo Photométrie</td><td>Coolsnap HQ Utilisé</td><td>avec Olympus BX51</td></tr><tr><td>Source lumineuse</td><td>EXFO</td><td>X-Cite 120Q</td><td>Utilisé avec Olympus BX51</td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Nikon</td><td>Ti2-E</td><td>Fluorescence imagerie de l’expression génique</td></tr><tr><td>4x objectif</td><td>Nikon</td><td>CFI P-Apo 4x Lambda Utilisé avec l’appareil</td> photo <td>Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td></td><td>Andor</td><td>Neo5.5</td><td>Utilisé avec Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>Source lumineuse</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM II</td> Utilisé avec l’incubateur <td>à cage Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td></td><td>Okolab</td><td>bold line</td><td>Utilisé avec le régulateur de pression Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td></td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3</td><td></td></tr><tr><td>NanoPhotomètre</td><td>Implen</td><td></td><td>Mesure de la concentration d’ADN</td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma</td><td>Diener</td><td>Femto</td><td>200 W, fonctionnant à 0,8 mbar avec l’échantillon dans une cage de Faraday</td></tr></tbody></table>

surface-immobilisation fonctionnelle des gènes à l’aide de la lithographie de déplacement multipas strand

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilisation des gènes sur les surfaces lithographically structurés permet l’étude du gène compartimentée processus d’expression dans un système de bioréacteur microfluidique ouvert. Contrairement aux autres approches vers des systèmes cellulaires artificielles, une telle installation permet un approvisionnement continu avec les réactifs d’expression de gène et simultanée, l’évacuation de déchets produits. Cela facilite la mise en œuvre des processus d’expression de gène acellulaire sur de longues périodes de temps, ce qui est important pour la réalisation de systèmes de rétroaction réglementaire de gène dynamique. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la fabrication de biopuces génétiques en utilisant une technique lithographique de simple-to-use issue des réactions de déplacement de brin de l’ADN, qui utilise exclusivement des composants disponibles dans le commerce. Nous fournissons également un protocole sur l’intégration des gènes compartimentées avec un polydiméthylsiloxane (PDMS)-basé système microfluidique. De plus, nous montrons que le système est compatible avec la microscopie de fluorescence (FRBR) de réflexion totale interne, qui peut être utilisée pour l’observation directe des interactions moléculaires entre l’ADN et les molécules contenues dans le mélange d’expression.

Lithographie en deux étapes : la Figure 5 montre le résultat d’un procédé lithographique en deux étapes sur une lame de verre qui se chevauchent de patrons de fluorescent étiquetés DIS brins.
Expression d’une protéine fluorescente de la brosse de gène : la Figure 6 illustre l’expression de la protéine fluorescente YPet d’ADN immobilisée. À plusieurs moments que nous avo...

Nous décrivons une procédure simple lithographique pour l’immobilisation des molécules d’ADN gène-longueur sur une surface, ce qui peut être utilisée pour réaliser des expériences d’expression de gène acellulaire sur biopuces.

Surface-immobilisation fonctionnelle des gènes à l’aide de la lithographie de déplacement multipas Strand

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

Les biopuces d’ADN sont une plate-forme de recherche attrayante pour la biologie auto-resythique, développée à l’origine par le groupe BASF, qui permet l’exploitation de circuits génétiques in vitro sur de longues périodes de temps. Avec ce protocole, nous espérons mettre cette technologie à la disposition d’un plus large éventail de chercheurs. Notre méthode, appelé lithographie bephore, représente une stratégie pour l’immobilisation de l’ADN basée sur la réaction de déplacement des brins d’ADN.La force de cette technique réside dans ses capacités lithographiques en plusieurs étapes, sa simple reproductibilité et la disponibilité commerciale de tous les composants. Comme d’autres solutions de biopuces, bephore peut être combiné avec différentes technologies. Par exemple, les brosses génétiques fonctionnelles peuvent être assemblées dans des micro-compartiments pour l’expression des protéines.Pour commencer, préparez un mélange RCA en mélangeant cinq parties d’eau avec une partie d’une solution d’ammoniac à 30 % dans un bécher en verre. Chauffer le mélange à 70 degrés Celsius sur une plaque chaude en remuant. Une fois qu’il atteint 70 degrés Celsius, ajouter une partie 30% peroxyde d’hydrogène.Ensuite, placez une plaquette de silicium de 100 millimètres de diamètre dans la solution, pour enlever les matières organiques et les particules de lui. Après 30 minutes, sortir le substrat, le rincer abondamment à l’eau d’une bouteille de lavage et le sécher à l’aide d’un pistolet à azote. Procédez immédiatement à la pegylation du substrat.Pour ce faire, d’abord diluer la biotine-PEG-Silane en toluène sec à 5 milligrammes par millilitre, et vortex la solution jusqu’à ce qu’elle soit bien mélangée. Avec le substrat placé dans une boîte de Pétri en verre, pipette lentement la solution sur le substrat, couvrant toute la surface, mais éviter de permettre à la solution de couler sur le bord. Une fois la surface couverte, fermer la boîte de Pétri, puis ajouter un couvercle supplémentaire.Après 30 minutes, retirer le couvercle et ajouter environ 40 millilitres d’alcool d’isopropylique à la boîte de Pétri. Ensuite, sortez le substrat, rincez-le à nouveau à fond avec de l’alcool d’isopropyle et séchez-le à l’aide d’un pistolet à azote. Lorsqu’il est sec, conserver le substrat dans l’obscurité jusqu’à ce qu’il soit nécessaire.Préparer un substrat à l’aide d’un coupeur de verre ou d’un scalpel pour former des morceaux d’un centimètre sur un centimètre. Ensuite, ajoutez une simple marque d’alignement en faisant une courte égratignure du centre vers un bord du substrat. Soufflez toutes les petites particules de la puce à l’aide d’un pistolet à azote.Ensuite, mélangez deux gouttelettes d’une colle en silicone à deux composants et appliquez la colle à la surface de la puce, en laissant la zone autour de la pointe de l’égratignure vide. Là, la colle fournit une barrière hydrophobe, en gardant des solutions aqueuses sur la puce. Cela facilite les étapes de lavage subséquentes et réduit la quantité d’ADN nécessaire aux incubations.Dans une étape ultérieure, la colle peut être facilement épluchée. Dans les étapes suivantes, l’ADN photocléavable n’est manipulé que dans un environnement de lumière jaune. Couvrir la puce d’environ 10 microlitres d’un mélange de bephore à température ambiante et placer la puce dans une boîte partiellement remplie d’eau pour réduire l’évaporation.Après une heure, laver la puce plusieurs fois avec PBS pour enlever tout mélange de bephore non lié. Ensuite, ajoutez 10 microlitres du mélange de passivation à la puce. Après deux heures, lavez la puce plusieurs fois avec PBS pour enlever les agents de passivation non liés.Coupez un masque photo imprimé à la taille appropriée afin de s’adapter à un porte-masque approprié. Insérez-le à la position de l’arrêt de champ, et utilisez les marques d’alignement pour aligner le masque dans le support. Avec le substrat placé sur le stade de microscopie, insérez un filtre rouge dans le chemin d’éclairage, et concentrez-vous sur la surface du substrat.Ensuite, naviguez vers la région du substrat qui sera exposée. Ensuite, insérez le porte-masque, bloquez l’éclairage et changez pour le filtre UV. À faible intensité lumineuse, ouvrez l’obturateur et utilisez la caméra pour concentrer rapidement le masque sur le substrat.Avec le substrat maintenant aligné et le masque au point, bloquer le chemin de lumière à la caméra, et illuminer le substrat à une intensité lumineuse élevée pour le temps d’exposition désiré. Après l’exposition, retirer l’échantillon du microscope et retirer soigneusement le plus de tampon possible du substrat sans le sécher. Ensuite, ajoutez 10 à 20 microlitres d’ADN avec la séquence d’attachement à la surface.Placez le substrat dans une boîte humide pour l’empêcher de sécher et incubez l’ADN sur le substrat pendant deux heures à température ambiante. Afin d’observer l’expression du gène compartimenté sur un microscope inversé, préparez d’abord séparément les deux parties du porte-échantillon. Commencez par coller une puce bephore avec une brosse à gènes immobilisée sur le support de la puce, à l’aide de ruban adhésif à double face.Ensuite, ajoutez un peu de graisse sous vide autour du trou central de la partie inférieure du support, et insérez le support de la puce. Assemblez maintenant la partie supérieure du support. Couper une puce PDMS mince avec des compartiments aussi petits que possible, laissant un canal ouvert d’un côté pour permettre plus tard l’échange de déchets et de molécules précurseurs par diffusion Ensuite, plasma-traiter un glissement de couverture en verre dans le côté arrière de la puce PDMS avec du plasma d’oxygène.Immédiatement après le traitement, placez la puce PDMS au centre de la glissière de verre, les compartiments pointant vers le haut. Ensuite, cuire le verre avec le PDMS pendant une heure à 70 degrés Celsius. Peu de temps avant l’assemblage de l’ensemble du support de l’échantillon, traitez le glissière en verre avec la puce PDMS comme avant.Ensuite, ajoutez un peu de graisse sous vide autour du grand trou du support supérieur, et placez la glissière en verre avec le PDMS sur elle. Presser délicatement le verre sur la graisse. Retirez soigneusement le tampon de la puce et lavez-le une fois avec 10 microlitres de système d’auto-ré-expression.Ensuite, ajoutez 60 microlitres de système d’auto-ré-expression sur la puce, et retirez la colle en silicone à deux composants des bords. Maintenant, ajoutez 20 microlitres du système d’expression sur le PDMS. Après avoir placé la gouttelette sur le PDMS, vérifiez rapidement au microscope stéréoscopique que les compartiments sont bien mouillés et sans bulles d’air.S’il y a des bulles d’air, essayez de les laver. Pour assembler les deux pièces du support, et pour aligner les chambres et les brosses à ADN, travaillez au microscope stéréoscopique. Immobiliser le support inférieur avec un bras de pince de sorte que les deux vis et les extrémités des ailes seront facilement accessibles avec les deux mains.Insérez le support supérieur dans le support inférieur et abaissez-le jusqu’à ce que les gouttelettes du système de libre expression cellulaire fusionnent. Ensuite, vérifiez que les compartiments et la marque d’alignement sont dans une région similaire dans le plan XY. Par le bas, vissez les extrémités des ailes jusqu’à ce qu’elles touchent le côté inférieur du support.Tout en alignant les compartiments et la puce dans le plan XY, serrez doucement les extrémités des ailes. Cette étape nécessite une certaine expérience et dépend de la construction du porte-échantillon. Le PDMS ne doit être pressé sur la puce qu’avec une force douce.Ensuite, vaporisez une éponge dans l’enceinte anti-évaporation avec de l’eau, et insérez le support dans la boîte. Ensuite, remplissez une seringue de cinq millilitres avec de la colle en silicone à deux composants et utilisez-la pour sceller la boîte. Enfin, transférez la boîte à un microscope à température contrôlée, et imagez la brosse à ADN et la réaction à l’aide de microscopie de fluorescence.Un processus lithographique en deux étapes, ici effectué sur une lame de verre bephore, donne des modèles qui se chevauchent de brins d’ADN étiquetés fluorescentement. Dans cette démonstration de l’expression du gène sur puce, l’ADN est immobilisé dans la chambre à gauche. Lorsqu’elle est exposée au mélange d’expression, la protéine fluorescente jaune YPet est synthétisée à partir de l’ADN immobilisé.Pour évaluer l’activité du système d’expression génique, la récupération de la fluorescence est observée après une étape de blanchiment. À deux heures, l’intensité de fluorescence s’est rapidement rétablie. Toutefois, après quatre et six heures, il ne s’est pas rétabli, ce qui indique que sans un nouvel approvisionnement du mélange d’expression, la réaction s’est terminée vers l’heure quatre.Bien que l’expression des gènes soit limitée dans un système fermé, elle peut être soutenue sur de plus longues périodes en fournissant aux compartiments d’expression des molécules précurseurs supplémentaires par micro-fluidité. La méthode du bephore est utilisée pour immobiliser les oligonucléotides ou l’ADN de longueur de gène, qui peuvent être appliqués pour construire des systèmes de brosses à ADN en interaction pour l’expression autorégénique. La technique peut également être utilisée pour d’autres applications en biophysique, telles que des études de fluorescence à molécule unique.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure de fabriquer des biopuces bephore à partir de gaufrettes ou de toboggans en verre, et de les intégrer dans vos projets de recherche.

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