Surface-immobilisation fonctionnelle des gènes à l’aide de la lithographie de déplacement multipas Strand

Les biopuces d’ADN sont une plate-forme de recherche attrayante pour la biologie auto-resythique, développée à l’origine par le groupe BASF, qui permet l’exploitation de circuits génétiques in vitro sur de longues périodes de temps. Avec ce protocole, nous espérons mettre cette technologie à la disposition d’un plus large éventail de chercheurs. Notre méthode, appelé lithographie bephore, représente une stratégie pour l’immobilisation de l’ADN basée sur la réaction de déplacement des brins d’ADN.

La force de cette technique réside dans ses capacités lithographiques en plusieurs étapes, sa simple reproductibilité et la disponibilité commerciale de tous les composants. Comme d’autres solutions de biopuces, bephore peut être combiné avec différentes technologies. Par exemple, les brosses génétiques fonctionnelles peuvent être assemblées dans des micro-compartiments pour l’expression des protéines.

Pour commencer, préparez un mélange RCA en mélangeant cinq parties d’eau avec une partie d’une solution d’ammoniac à 30 % dans un bécher en verre. Chauffer le mélange à 70 degrés Celsius sur une plaque chaude en remuant. Une fois qu’il atteint 70 degrés Celsius, ajouter une partie 30% peroxyde d’hydrogène.

Ensuite, placez une plaquette de silicium de 100 millimètres de diamètre dans la solution, pour enlever les matières organiques et les particules de lui. Après 30 minutes, sortir le substrat, le rincer abondamment à l’eau d’une bouteille de lavage et le sécher à l’aide d’un pistolet à azote. Procédez immédiatement à la pegylation du substrat.

Pour ce faire, d’abord diluer la biotine-PEG-Silane en toluène sec à 5 milligrammes par millilitre, et vortex la solution jusqu’à ce qu’elle soit bien mélangée. Avec le substrat placé dans une boîte de Pétri en verre, pipette lentement la solution sur le substrat, couvrant toute la surface, mais éviter de permettre à la solution de couler sur le bord. Une fois la surface couverte, fermer la boîte de Pétri, puis ajouter un couvercle supplémentaire.

Après 30 minutes, retirer le couvercle et ajouter environ 40 millilitres d’alcool d’isopropylique à la boîte de Pétri. Ensuite, sortez le substrat, rincez-le à nouveau à fond avec de l’alcool d’isopropyle et séchez-le à l’aide d’un pistolet à azote. Lorsqu’il est sec, conserver le substrat dans l’obscurité jusqu’à ce qu’il soit nécessaire.

Préparer un substrat à l’aide d’un coupeur de verre ou d’un scalpel pour former des morceaux d’un centimètre sur un centimètre. Ensuite, ajoutez une simple marque d’alignement en faisant une courte égratignure du centre vers un bord du substrat. Soufflez toutes les petites particules de la puce à l’aide d’un pistolet à azote.

Ensuite, mélangez deux gouttelettes d’une colle en silicone à deux composants et appliquez la colle à la surface de la puce, en laissant la zone autour de la pointe de l’égratignure vide. Là, la colle fournit une barrière hydrophobe, en gardant des solutions aqueuses sur la puce. Cela facilite les étapes de lavage subséquentes et réduit la quantité d’ADN nécessaire aux incubations.

Dans une étape ultérieure, la colle peut être facilement épluchée. Dans les étapes suivantes, l’ADN photocléavable n’est manipulé que dans un environnement de lumière jaune. Couvrir la puce d’environ 10 microlitres d’un mélange de bephore à température ambiante et placer la puce dans une boîte partiellement remplie d’eau pour réduire l’évaporation.

Après une heure, laver la puce plusieurs fois avec PBS pour enlever tout mélange de bephore non lié. Ensuite, ajoutez 10 microlitres du mélange de passivation à la puce. Après deux heures, lavez la puce plusieurs fois avec PBS pour enlever les agents de passivation non liés.

Coupez un masque photo imprimé à la taille appropriée afin de s’adapter à un porte-masque approprié. Insérez-le à la position de l’arrêt de champ, et utilisez les marques d’alignement pour aligner le masque dans le support. Avec le substrat placé sur le stade de microscopie, insérez un filtre rouge dans le chemin d’éclairage, et concentrez-vous sur la surface du substrat.

Ensuite, naviguez vers la région du substrat qui sera exposée. Ensuite, insérez le porte-masque, bloquez l’éclairage et changez pour le filtre UV. À faible intensité lumineuse, ouvrez l’obturateur et utilisez la caméra pour concentrer rapidement le masque sur le substrat.

Avec le substrat maintenant aligné et le masque au point, bloquer le chemin de lumière à la caméra, et illuminer le substrat à une intensité lumineuse élevée pour le temps d’exposition désiré. Après l’exposition, retirer l’échantillon du microscope et retirer soigneusement le plus de tampon possible du substrat sans le sécher. Ensuite, ajoutez 10 à 20 microlitres d’ADN avec la séquence d’attachement à la surface.

Placez le substrat dans une boîte humide pour l’empêcher de sécher et incubez l’ADN sur le substrat pendant deux heures à température ambiante. Afin d’observer l’expression du gène compartimenté sur un microscope inversé, préparez d’abord séparément les deux parties du porte-échantillon. Commencez par coller une puce bephore avec une brosse à gènes immobilisée sur le support de la puce, à l’aide de ruban adhésif à double face.

Ensuite, ajoutez un peu de graisse sous vide autour du trou central de la partie inférieure du support, et insérez le support de la puce. Assemblez maintenant la partie supérieure du support. Couper une puce PDMS mince avec des compartiments aussi petits que possible, laissant un canal ouvert d’un côté pour permettre plus tard l’échange de déchets et de molécules précurseurs par diffusion Ensuite, plasma-traiter un glissement de couverture en verre dans le côté arrière de la puce PDMS avec du plasma d’oxygène.

Immédiatement après le traitement, placez la puce PDMS au centre de la glissière de verre, les compartiments pointant vers le haut. Ensuite, cuire le verre avec le PDMS pendant une heure à 70 degrés Celsius. Peu de temps avant l’assemblage de l’ensemble du support de l’échantillon, traitez le glissière en verre avec la puce PDMS comme avant.

Ensuite, ajoutez un peu de graisse sous vide autour du grand trou du support supérieur, et placez la glissière en verre avec le PDMS sur elle. Presser délicatement le verre sur la graisse. Retirez soigneusement le tampon de la puce et lavez-le une fois avec 10 microlitres de système d’auto-ré-expression.

Ensuite, ajoutez 60 microlitres de système d’auto-ré-expression sur la puce, et retirez la colle en silicone à deux composants des bords. Maintenant, ajoutez 20 microlitres du système d’expression sur le PDMS. Après avoir placé la gouttelette sur le PDMS, vérifiez rapidement au microscope stéréoscopique que les compartiments sont bien mouillés et sans bulles d’air.

S’il y a des bulles d’air, essayez de les laver. Pour assembler les deux pièces du support, et pour aligner les chambres et les brosses à ADN, travaillez au microscope stéréoscopique. Immobiliser le support inférieur avec un bras de pince de sorte que les deux vis et les extrémités des ailes seront facilement accessibles avec les deux mains.

Insérez le support supérieur dans le support inférieur et abaissez-le jusqu’à ce que les gouttelettes du système de libre expression cellulaire fusionnent. Ensuite, vérifiez que les compartiments et la marque d’alignement sont dans une région similaire dans le plan XY. Par le bas, vissez les extrémités des ailes jusqu’à ce qu’elles touchent le côté inférieur du support.

Tout en alignant les compartiments et la puce dans le plan XY, serrez doucement les extrémités des ailes. Cette étape nécessite une certaine expérience et dépend de la construction du porte-échantillon. Le PDMS ne doit être pressé sur la puce qu’avec une force douce.

Ensuite, vaporisez une éponge dans l’enceinte anti-évaporation avec de l’eau, et insérez le support dans la boîte. Ensuite, remplissez une seringue de cinq millilitres avec de la colle en silicone à deux composants et utilisez-la pour sceller la boîte. Enfin, transférez la boîte à un microscope à température contrôlée, et imagez la brosse à ADN et la réaction à l’aide de microscopie de fluorescence.

Un processus lithographique en deux étapes, ici effectué sur une lame de verre bephore, donne des modèles qui se chevauchent de brins d’ADN étiquetés fluorescentement. Dans cette démonstration de l’expression du gène sur puce, l’ADN est immobilisé dans la chambre à gauche. Lorsqu’elle est exposée au mélange d’expression, la protéine fluorescente jaune YPet est synthétisée à partir de l’ADN immobilisé.

Pour évaluer l’activité du système d’expression génique, la récupération de la fluorescence est observée après une étape de blanchiment. À deux heures, l’intensité de fluorescence s’est rapidement rétablie. Toutefois, après quatre et six heures, il ne s’est pas rétabli, ce qui indique que sans un nouvel approvisionnement du mélange d’expression, la réaction s’est terminée vers l’heure quatre.

Bien que l’expression des gènes soit limitée dans un système fermé, elle peut être soutenue sur de plus longues périodes en fournissant aux compartiments d’expression des molécules précurseurs supplémentaires par micro-fluidité. La méthode du bephore est utilisée pour immobiliser les oligonucléotides ou l’ADN de longueur de gène, qui peuvent être appliqués pour construire des systèmes de brosses à ADN en interaction pour l’expression autorégénique. La technique peut également être utilisée pour d’autres applications en biophysique, telles que des études de fluorescence à molécule unique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure de fabriquer des biopuces bephore à partir de gaufrettes ou de toboggans en verre, et de les intégrer dans vos projets de recherche.