Développement d'un In vitro Système modèle pour l'étude de l'interaction de Equus Caballus IgE avec son récepteur de haute affinité FcsRI

L’objectif général de l’expérience suivante est de mesurer la quantité de libération de médiateurs dépendants des IgE à partir des cellules leucémiques basophiles RAD. Les symptômes d’allergie sont causés par la libération de médiateurs tels que l’histamine. Maintenant, l’histamine n’est pas le seul médiateur libéré par les basophiles sont les mastocytes.

L’ensemble de tous les médiateurs libérés par ces cellules entraîne les signes et les symptômes d’une hypersensibilité immédiate et retardée. Maintenant, les humains ne sont pas les seuls organismes à souffrir d’allergies : les chiens et les chevaux en souffrent également. Afin de développer davantage la recherche et de trouver des traitements contre les allergies tels que des vaccins, un test de libération est nécessaire pour quantifier la quantité de médiateurs libérés, le cas échéant, par le traitement de recherche.

C’est la raison de ce test de libération. Le test publié par le médiateur RBL pour le système humain a été développé et publié pour la première fois par Ian et Hook en 1986. Il a ensuite été développé pour le système DOC et maintenant pour le système cheval.

Les modifications sont aussi simples que de changer les protéines d’intérêt. La nouvelle de la lignée cellulaire était la leucémie de Rat Baso ou RBL deux lignée cellulaire H 3.1 exprimant la chaîne alpha des récepteurs équins à haute FNT ffc Serin R one à une densité cellulaire de 500 000 cellules par millilitre. Ajouter l’anticorps IgE d’intérêt à une concentration finale d’un nanogramme par millilitre.

Ajoutez 100 microlitres du mélange dans une plaque de sol de 96 et incubez pendant 16 heures à 37 degrés. Cela permet aux cellules d’adhérer à la surface du puits et à l’anticorps de se lier à son lavage de récepteur. Deux fois le milieu contenant l’anticorps non lié restant et les cellules mortes avec 100 microlitres de tampon de libération chaude à 37 degrés.

Jetez le tampon du dernier lavage et remplacez-le par 100 microlitres de l’antigène d’intérêt à la concentration d’intérêt. Après une incubation de 20 minutes à 37 degrés, transférez 50 microlitres de SUP natin contenant les médiateurs de libération dans un nouveau puits et remplacez le surnageant restant par 50 microlitres de tampon Triton X pour allonger les cellules et libérer les médiateurs restants à l’intérieur des cellules. À 50 microlitres de 2 millions de molaires bêta hx.

Plusieurs jours de substrat dissous dans un tampon de citrate. Après une incubation de deux heures à 37 degrés, ajoutez 150 microlitres de tampon tris dans chaque puits en rajeunissant le puits. Mesurez l’absorbance de la couleur à 405 nanomètres après 16 heures.

Réchauffez le tampon de dosage de libération, également connu sous le nom de tampon Ian, à 37 degrés. Préparez également le gradient de concentration de l’antigène dans le tampon de libération aux concentrations. Zéro 0,1 1 10, 100, 100 et 10 000 nanogrammes par millilitre.

Puis chaud à 37 degrés. Lavez les puits en retournant rapidement le plat pour retirer le média et ajoutez doucement 100 microlitres de tampon de libération chaude vers les parois des puits. Il s’agit de réduire le stress cellulaire dû à la différence de température, qui les amène à libérer prématurément des médiateurs.

Le plat doit être lavé deux fois. Jetez le tampon de libération final, lavez et ajoutez 100 microlitres d’antigène, en commençant par une concentration d’antigène nulle à la rangée A pour le contrôle négatif, et en descendant le gradient de concentration des rangées B à G et enfin aux tranches de Triton X, tampon à la rangée H. Incuber l’assiette pendant 20 minutes à 37 degrés.

C’est à ce moment-là que les cellules libèrent des médiateurs après la période d’incubation. Transférez 50 microlitres du liquide dans chaque puits dans son puits respectif. Aux colonnes sept à 12, retirez complètement et jetez le liquide restant aux positions un à six et remplacez-le par 50 microlitres de tampon de lyse Triton X.

Ajoutez 50 microlitres du substrat préparé dans les 96 puits du plat. Incuber à 37 degrés pendant deux heures. Le bêta H, plusieurs jours transforme le substrat en quatre nitrophénols.

Après la période d’incubation, arrêtez la réaction en ajoutant 150 microlitres de tampon tris, transformant les quatre nitrophénols en une couleur jaune. Lire la plaque à l’aide d’un spectrophotomètre à plaques à 405 nanomètres. Après avoir mesuré les données d’absorbance, calculez la quantité totale de médiateurs à l’intérieur des cellules dans la position A des puits en multipliant.

Son puits correspondant à la position a sept sur deux et en ajoutant le résultat à la valeur en un. En effet, pendant l’expérience, nous avons le supinat contenant l’opposition des médiateurs de libération A lorsque nous l’avons transféré dans un nouveau puits d’opposition. Un sept.

Répétez les calculs pour le reste des puits. Calculez le pourcentage de médiateurs de libération dans l’opposition de puits, A sept à partir du total calculé des médiateurs à l’intérieur des cellules en multipliant la valeur de la position A sept par deux. Encore une fois, parce que pendant l’expérience, nous avons le supernat contenant les médiateurs de Reese.

Au fur et à mesure que nous le transférons dans un nouveau, multipliez ce produit par 100 et divisez ce produit par la valeur totale correspondante des médiateurs à l’intérieur des cellules pour cette position. Cela donne le pourcentage de médiateurs de relâchement pour la houle. Répétez les calculs pour le reste des puits puisque les six houles de chaque rangée sont contestées par la même concentration d’antigène moyenne.

Ces valeurs et calculer l’écart-type représentent ces valeurs sur un graphique comme suit. Le graphique montre qu’à mesure que la concentration d’antigène augmente, davantage de médiateurs sont libérés jusqu’à ce qu’elle atteigne un pic de 100 nanogrammes par millilitre, après quoi la libération de médiateurs diminue avec l’augmentation de la concentration d’antigène. Le résultat expérimental final devrait ressembler à ces graphiques, comme on peut le voir sur le graphique B.Le test de libération de contrôle en bleu clair ne contient pas d’anticorps IgE et ne montre donc aucun changement dans la libération du médiateur avec l’augmentation de la concentration d’antigène.

Comparez cela au résultat expérimental en bleu foncé, qui pourrait contenir des anticorps IgE. Il s’agit d’un exemple d’un vaccin anti-IgE dont l’innocuité est testée. Il est clair, d’après ce graphique en rouge, que le sérum anti-IgE réticule, les récepteurs à la surface des cellules, provoquant la dégranulation des cellules RBL, tout comme on le voit dans le contrôle positif en violet par rapport au contrôle négatif en gris, ce qui rend ce vaccin dangereux.

Ce test est très utile car il peut mesurer la libération du médiateur, ou le retard de celle-ci lors de l’essai de médicaments anti-allergiques potentiels ou les vaccins peuvent également être adaptés aux systèmes humains, canins ou équins, comme le montre le test peut déterminer le blocage réussi ou non de la libération du médiateur lors du test d’anticorps anti-allergiques.