Développement et validation d'une méthode de PCR quantitative pour équidé herpèsvirus-2 Diagnostics dans respiratoires Fluides

L'objectif général de la méthode de PCR quantitative est d'évaluer la charge virale de l'herpèsvirus équin-2 dans des échantillons biologiques provenant de chevaux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine diagnostique des maladies respiratoires chez le cheval, en fournissant des données quantitatives sur de nouveaux outils d'interprétation à l'intention des praticiens. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est sensible, spécifique et rapide.

Un autre avantage est le développement conforme à la norme AFNOR NF U47-600, qui est le représentant français au sein du comité international de normalisation. La procédure sera démontrée par Erika Hue, une jeune chercheuse de mon unité. Pour extraire les acides nucléiques à partir d'un échantillon biologique de liquides respiratoires, commencez sous une hotte à ajouter 140 microliters d'échantillon biologique à 560 microliters de solution de lyse et incubez à température ambiante pendant 10 minutes.

Ajouter 560 microlitres d'éthanol à l'échantillon, puis appliquer 630 microlitres de la solution totale sur une colonne de silice et centrifuger. Appliquer les 630 microlitres restants sur la colonne de silice et centrifuger à nouveau. Une fois l'échantillon appliqué sur la colonne, utiliser 500 microlitres de chacun des tampons de lavage AW1 et AW2 pour laver la colonne deux fois.

Ensuite, pour éluer les acides nucléiques de la colonne, ajoutez 50 microlitres de tampon d'élution ou de tampon AVE à température ambiante. Fermez le bouchon et incubez une minute à température ambiante. Puis centrifugez à 6 000 g pendant une minute.

Pour amplifier l'ADN, après avoir titré les amorces et la sonde selon le protocole indiqué dans le texte, préparez 22,5 microlitres de mélange de réaction pour chaque réaction en ajoutant 12,5 microlitres de mélange maître PCR, des amorces avant et arrière à 20 micromolaire, 10 micromolaire de la sonde, et suffisamment d'eau ultra-pure pour atteindre un volume final de 22,5 microlitres. Pour éviter toute contamination, préparez toujours le mélange de réaction PCR dans un secteur dédié. Répartissez 22,5 microlitres du mélange de réaction approprié dans chaque puits d'une plaque 96 puits.

Inclure des contrôles négatifs pour l'extraction et la PCR afin de s'assurer qu'aucun des réactifs n'est contaminé par de l'ADN indésirable. Ajouter ensuite 2,5 microlitres soit de l'échantillon, soit du contrôle négatif d'extraction, soit du contrôle négatif de PCR, soit de l'échantillon témoin positif dans les puits de réaction correspondants. Utiliser ensuite un film adhésif pour plaques afin de recouvrir la plaque.

Et centrifuger à 6 000 ×g pendant 10 secondes. Placer la plaque dans un système de PCR en temps réel. Ensuite, sélectionner le modèle pour l'agencement du test et les paramètres du programme de PCR indiqués ici, puis démarrer l'analyse.

Après avoir transféré les données brutes du système de PCR en temps réel vers un tableur, réglez le seuil sur les tracés d'amplification au-dessus de la ligne de base et dans la région de croissance exponentielle afin d'obtenir le cycle de seuil pour chaque échantillon. Reportez chaque jeu de points standards sous forme de courbe standard afin d'obtenir une relation linéaire. Calculez ensuite le nombre de copies pour les différents échantillons en fonction de la courbe standard.

Pour déterminer la limite de détection des résultats de la qRT-PCR, distribuez 90 microlitres d'eau ultra-pure dans six tubes. Pour préparer six dilutions sérielles décimales du plasmide visant la zone d'abattement, commencez par transférer 10 microlitres de la dilution working du plasmide dans le tube contenant 90 microlitres d'eau ultra-pure. Vortexez brièvement et centrifugez le tube.

Ensuite, transférez 10 microlitres du tube vers le tube suivant contenant de l'eau. Après avoir vortexé et centrifugé, répétez le transfert jusqu'à ce que tous les tubes d'eau aient reçu le plasmide. Après amplification de l'ADN dans les six dilutions sérielles décimales comme décrit précédemment dans cette vidéo, déterminez la zone d'abattement, qui correspond à la dernière dilution de plasmide produisant un signal positif et à la première dilution sans détection.

Pour préparer six dilutions sérielles par doublements successifs, distribuez 25 microlitres d'eau ultra-pure dans six tubes. À partir de la dernière dilution du plasmide ayant donné un signal positif dans les dilutions décimales, transférez 25 microlitres du tube dans le premier tube d'eau. Agitez vigoureusement puis centrifugez avant de préparer les cinq dilutions restantes comme indiqué précédemment.

Amplifiez l'ADN provenant des dilutions sérielles en double comme décrit précédemment dans cette vidéo. Après amplification de l'ADN à partir des trois essais indépendants, calculez le nombre de réplicats positifs parmi les 24 réplicats pour chaque niveau de concentration du plasmide. Déterminez la limite de détection avec un intervalle de confiance de 95 %, ou DL 95 % PCR, qui correspond au niveau entraînant la détection de 23 réplicats positifs parmi 24 réplicats.

Pour déterminer la DL de la méthode, préparez cinq dilutions sérielles par doublement à partir de 25 microlitres de la dilution de travail du plasmide, qui est quatre fois plus concentrée que la dernière concentration issue d'une dilution dix fois plus élevée ayant donné un signal positif. Le plasmide utilisé lors de l'étape d'amplification provient d'une dilution de travail du plasmide préparée dans un espace dédié afin d'éviter toute contamination. Il s'agit d'une étape critique.

Transférez 5 microlitres de chaque dilution de plasmide vers quatre tubes contenant 135 microlitres du matériau de ressource négatif afin d'obtenir quatre répliques des cinq standards positifs. Effectuez l'extraction des quatre répliques pour les cinq standards positifs et réalisez la procédure d'amplification comme décrite précédemment dans cette vidéo. Comptez le nombre de répliques positives parmi les huit répliques pour chaque niveau de concentration du plasmide.

Enfin, déterminer la méthode de DL, qui correspond au dernier niveau auquel huit réplicats sur huit sont positifs. La méthode de RT-PCR quantitative décrite dans cette vidéo détecte et quantifie l'herpèsvirus équin-2 dans les fluides respiratoires. Dans cette expérience, des dilutions sérielles décimales ont été réalisées afin d'estimer la zone d'atténuation, située entre les dilutions 10 à la puissance -9 et 10 à la puissance -10.

La valeur de la PCR de DL a été déterminée à l'aide d'une nouvelle dilution sérielle par doublement dans la zone de réduction. Pour déterminer la plage de linéarité et la PCR de DQ, la valeur de la PCR de DL a été utilisée comme point de départ d'une gamme de six dilutions sérielles d'un facteur dix, allant de 2,6, la valeur de la PCR de DL, à 260 000 copies par 2,5 microlitres d'échantillon. La PCR de DQ correspond à la concentration la plus faible dans la plage de linéarité.

La caractérisation de l'ensemble de la méthode consiste à valider toutes les étapes nécessaires pour obtenir des données de qRT-PCR, depuis l'extraction de l'ADN de l'échantillon respiratoire jusqu'à l'amplification et la quantification de la cible. La performance quantitative de l'ensemble du procédé analytique de qRT-PCR a été évaluée et validée à l'aide d'un profil d'exactitude représenté sur ce graphique. Les charges du génome viral EHV2 dans 172 échantillons de prélèvements nasaux provenant de chevaux présentant des troubles respiratoires ont été quantifiées comme indiqué ici.

Les charges génomiques virales étaient plus élevées chez les jeunes chevaux, la charge la plus élevée détectée étant de 1,9 fois 10 à la puissance 11 copies par millilitre. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux heures par étape d'amplification, et l'ensemble des étapes de validation peut être effectué en moins de quatre semaines si elle est correctement réalisée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'éviter tout risque de contamination, en particulier lorsqu'on travaille avec une solution de plasmide.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes telles que le séquençage peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'identification du génome. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment extraire et amplifier de l'ADN, ainsi que caractériser leurs réserves de PCR. N'oubliez pas que travailler avec des échantillons biologiques tels que des agents pathogènes peut être extrêmement dangereux.

Certaines précautions, telles que travailler sous une hotte et dans une zone de niveau de sécurité adapté, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.