Développement et validation d'une méthode de PCR quantitative pour équidé herpèsvirus-2 Diagnostics dans respiratoires Fluides

L’objectif global de la méthode qPCR est d’évaluer la charge virale de l’herpèsvirus-2 équin dans des échantillons biologiques de chevaux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du diagnostic des maladies respiratoires chez le cheval, des données quantitatives sur de nouvelles aides d’interprétation pour les praticiens. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est sensible, spécifique et rapide.

Un autre avantage est le développement selon la norme AFNOR NF U47-600, qui est le représentant français au comité international de normalisation. La démonstration de la procédure sera assurée par Erika Hue, une jeune chercheuse de mon unité. Pour extraire les acides nucléiques d’un échantillon biologique de fluides respiratoires, sous une hotte, commencez par ajouter 140 microlitres d’échantillon biologique à 560 microlitres de solution de lyse et incubez à température ambiante pendant 10 minutes.

Ajoutez 560 microlitres d’éthanol à l’échantillon et appliquez 630 microlitres de la solution totale sur une colonne de silice et une centrifugeuse. Appliquez les 630 microlitres restants dans la colonne de silice et centrifugez à nouveau. Une fois l’échantillon appliqué sur la colonne, utilisez 500 microlitres chacun des tampons de lavage AW1 et AW2 pour laver la colonne deux fois.

Ensuite, pour éluer les acides nucléiques de la colonne, ajoutez 50 microlitres d’élution à température ambiante ou de tampon AVE. Fermez le capuchon et laissez incuber à température ambiante pendant une minute. Puis centrifuger à 6 000 g pendant une minute.

Pour amplifier l’ADN, après avoir titré les amorces et la sonde conformément au protocole de texte, préparez 22,5 microlitres de mélange réactionnel pour chaque réaction en ajoutant 12,5 microlitres de mélange maître PCR, 20 amorces micromolaires avant et inverse, 10 micromolaires de la sonde et suffisamment d’eau ultra-pure nécessaire pour atteindre 22,5 microlitres. Pour éviter toute contamination, préparez toujours le mélange réactionnel PCR dans une zone spécifique. Aliquote 22,5 microlitres du mélange de réaction approprié à chaque puits de réaction d’une plaque de 96 puits.

Inclure des contrôles négatifs pour l’extraction et la PCR afin de s’assurer qu’aucun des réactifs n’est contaminé par de l’ADN indésirable. Ajoutez ensuite 2,5 microlitres de l’échantillon, du contrôle négatif d’extraction, du contrôle négatif PCR ou de l’échantillon de contrôle positif dans les puits de réaction correspondants. Utilisez ensuite un joint de plaque adhésif pour couvrir la plaque.

Et centrifuger à 6 000 g pendant 10 secondes. Placez la plaque dans un système de PCR en temps réel. Sélectionnez ensuite le modèle pour la mise en page du test et les paramètres du programme PCR indiqués ici, puis démarrez l’exécution.

Après avoir transféré les données brutes du système de PCR en temps réel vers une feuille de calcul, définissez le seuil dans les graphiques d’amplification au-dessus de la ligne de base et dans la région de croissance exponentielle pour obtenir le cycle de seuil pour chaque échantillon. Tracez chaque standard de point défini sous la forme d’une courbe standard pour obtenir la linéarité. Calculez ensuite le nombre de copies pour les différents échantillons sur la base de la courbe standard.

Pour déterminer la limite de détection des résultats de la qRT-PCR, distribuez 90 microlitres d’eau ultra-pure dans six tubes. Pour préparer six dilutions en série dix fois plus élevées du plasmide afin de cibler la zone de réduction, commencez par transférer 10 microlitres de la dilution de travail du plasmide dans le tube avec 90 microlitres d’eau ultra-pure. Vortex brièvement et centrifugez le tube.

Transférez ensuite 10 microlitres du tube au tube d’eau suivant. Après le vortex et la centrifugation, répétez le transfert jusqu’à ce que tous les tubes d’eau reçoivent le plasmide. Après avoir amplifié l’ADN dans les six dilutions en série décuplées, comme décrit plus haut dans cette vidéo, déterminez la zone d’atténuation, qui est la dernière dilution du plasmide qui produit un signal positif et la première dilution sans détection.

Pour préparer six dilutions en série doubles, distribuez 25 microlitres d’eau ultra-pure dans six tubes. À partir de la dernière dilution du plasmide qui a donné un signal positif des dilutions décuplées, transférez 25 microlitres du tube dans le premier tube d’eau. Vortex et centrifugeuse avant de préparer les cinq dilutions restantes comme nous venons de le démontrer.

Amplifiez l’ADN à partir des deux dilutions en série comme décrit précédemment dans cette vidéo. Après avoir amplifié l’ADN des trois essais indépendants, calculez le nombre de répétitions positives sur 24 répétitions pour chaque niveau de concentration plasmidique. Déterminez le niveau de détail avec un niveau de confiance de 95 % ou le niveau de détection de 95 % de PCR, c’est-à-dire le niveau qui permet de détecter 23 répétitions positives sur 24 répétitions.

Pour déterminer le niveau de détail de la méthode, préparez cinq dilutions en série doubles en commençant par 25 microlitres de dilution de travail plasmidique qui est quatre fois plus concentrée que la dernière concentration à partir d’une dilution dupplant qui a donné un signal positif. Le plasmide utilisé dans l’étape d’amplification provient d’une dilution de travail plasmidique préparée dans une zone spécifique pour éviter la contamination. C’est une étape cruciale.

Transférez 5 microlitres de chaque dilution de plasmide dans quatre tubes avec 135 microlitres de la ressource négative pour obtenir quatre répétitions des cinq étalons positifs. Effectuez l’extraction des quatre répétitions pour les cinq étalons positifs et effectuez la procédure d’amplification comme décrit précédemment dans cette vidéo. Comptez le nombre de réplicats positifs sur huit répétitions pour chaque niveau de concentration plasmidique.

Enfin, déterminez la méthode LOD, qui est le dernier niveau auquel huit répétitions sur huit sont positives. La méthode quantitative RT-PCR décrite dans cette vidéo détecte et quantifie l’herpèsvirus-2 équidé dans les fluides respiratoires. Dans cette expérience, des dilutions en série décuplées ont été effectuées pour estimer la zone de réduction, qui se situe entre les dilutions 10 puissance moins 9e et 10 puissance moins 10.

La valeur LOD PCR a été déterminée à l’aide d’une nouvelle dilution en série double dans la zone de réduction. Pour déterminer la plage de linéarité et la LOQ PCR, la valeur LOD PCR a été utilisée pour commencer la gamme de six dilutions en série décuplées entre 2,6, la valeur LOD PCR, et 260 000 copies par 2,5 microlitres d’échantillon. La PCR LOQ est la concentration la plus faible dans la plage de linéarité.

La caractérisation de l’ensemble de la méthode est la validation de toutes les étapes nécessaires à l’obtention de données qRT-PCR, de l’extraction de l’ADN de l’échantillon respiratoire, à l’amplification et à la quantification de la cible. La performance quantitative de la méthode analytique qRT-PCR entière a été évaluée et validée à l’aide d’un profil de précision représenté dans ce graphique. Les charges du génome viral EHV2 dans 172 échantillons d’écouvillons nasaux de chevaux atteints de troubles respiratoires ont été quantifiées comme indiqué ici.

Les charges du génome viral étaient plus élevées chez les jeunes chevaux, la charge la plus élevée détectée étant de 1,9 fois 10 à 11 copies par millilitre. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux heures par étape d’amplification, et le total des étapes de validation peut être réalisé en moins de quatre semaines si elle est bien réalisée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter tout risque de contamination, en particulier lorsque vous travaillez avec une solution plasmidique.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que le séquençage peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’identification du génome. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer l’extraction et l’amplification de l’ADN et de caractériser leurs réserves de PCR. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons biologiques comme les agents pathogènes peut être extrêmement dangereux.

Certaines précautions telles que le travail avec une cagoule et une zone de niveau de sécurité adaptée doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.