Simultanée électrophysiologique Enregistrement et micro-injections d'agents inhibiteurs dans le cerveau des rongeurs

L'objectif général de cette procédure est de concevoir une canule d'injection abordable permettant d'injecter des neurotransmetteurs par microinjection dans le colliculus supérieur du rat tout en enregistrant l'activité neuronale multi-unitaire. Cette opération s'effectue en deux étapes : premièrement, la fabrication d'une pipette en verre à l'aide d'une capillaire en verre et d'un tireur de micropipettes vertical ; deuxièmement, l'insertion d'un fil d'argent dans la capillarité, une section du fil dépassant par l'extrémité non effilée.

Ensuite, un adhésif est utilisé pour créer un joint étanche entre la pipette en verre et une aiguille hypodermique. Les étapes finales consistent à remplir la pipette avec une solution de GABA colorée en bleu ciel de Chicago, raccordée à une microsyringe remplie d'huile minérale et fixée à un micro-injecteur. En définitive, cette conception d'un dispositif d'injection composé de pièces accessibles et abordables peut être utilisée pour inactiver des structures cérébrales profondes tout en enregistrant l'activité neuronale de la zone inactivée avant, pendant et après l'injection d'un médicament.

Plusieurs avantages distinguent cette technique des autres méthodes existantes, telles que les impulsions de pression gazeuse et les systèmes d'injection photique. L'un de ces avantages est qu'il s'agit d'une méthode économique permettant un contrôle fonctionnel de la délivrance du médicament, limitant ainsi les lésions tissulaires provoquées par une sur-injection. Un autre avantage offert par ce système est une capacité d'enregistrement combinée, permettant un contrôle efficace de la composante temporelle de la désactivation neuronale.

Pour préparer les pipettes d'injection d'enregistrement, tirez d'abord une capillaire de sept centimètres avec un diamètre externe d'un millimètre sur un appareil vertical de modèle Cop 720 ou similaire. Réglez le chauffage sur 18 et le solénoïde sur 1. Ensuite, portant des gants, cassez manuellement la pointe pour créer une ouverture et vérifiez au microscope que le diamètre interne se situe entre 30 et 40 micromètres.

Mesurez cela à l’aide de la règle du viseur. Cela produira une impédance relativement faible de 0,3 à 0,6 mégohms. Ensuite, à partir de l’extrémité non conique, insérez un fil d’argent dans la pipette sur une longueur d’environ sept centimètres, en laissant dépasser un à deux centimètres du fil hors de la pipette.

Courbez ce surplus de fil orthogonalement par rapport au capillaire. Ensuite, prenez une aiguille hypodermique de calibre 30 et appliquez un adhésif plastique souple sur la tige. Insérez ensuite lentement l'aiguille dans la pipette.

Au maximum possible. Ajouter plus d'adhésif pour créer un joint étanche au niveau de la jonction entre la pipette et l'aiguille. Avec la pointe de la pipette orientée vers le haut, laisser l'ensemble sécher pendant environ 12 heures.

Après avoir anesthésié le rat et l’avoir placé dans un cadre stéréotaxique, appliquez un onguent ophtalmique et rasez-lui entièrement la tête. Après l’application d’un anesthésique local et la confirmation d’un niveau chirurgical d’anesthésie, procédez à l’incision du cuir chevelu le long de la ligne médiane à l’aide d’un bistouri de taille 10. Cela permettra d’exposer les sutures coronale et sagittale.

Ensuite, à l’aide d’une spatule chirurgicale, identifier les repères anatomiques Lambda et bgma. Ajuster la position de la tête afin que ces points de repère soient alignés au même niveau dans un plan horizontal. Puis, positionner à zéro un fin pointeur rigide, tel qu’un tube en verre, sur le bgma.

Ensuite, ajustez la position du tube à un emplacement d'intérêt en utilisant les coordonnées provenant du bgma. Utilisez le marqueur pour dessiner un carré autour de la zone cible destinée à la craniotomie. Puis, à l’aide de la perceuse stérilisée chirurgicale, retirez lentement l’os le long des marques.

Commencez par exercer le moins de pression possible et maintenez le foret en mouvement afin d'éviter les lésions tissulaires induites par la chaleur due au frottement lorsque l'os devient mince ; retirez soigneusement la section carrée à l’aide de pinces. La Dora MA n’a pas besoin d’être retirée, car l’injection la pénétrera par la suite. Maintenez le cortex exposé irrigué avec du liquide céphalorachidien.

Préparez l'injection en remplissant d'abord une seringue de cinq à dix microlitres avec de l'huile minérale. Ensuite, préparez le médicament d'intérêt avec un colorant dans du sérum physiologique. Ici, 0,5 % de bleu Chicago sky est mélangé avec 300 micromolaire de GABA.

Remplissez maintenant la pipette d'injection en chargeant d'abord une seringue d'un millilitre avec une solution préparée, puis en utilisant la seringue pour charger la pipette. Lorsque vous retirez la seringue, maintenez une légère pression sur le piston afin qu'un vide ne retire pas la solution du canal d'injection. Vérifiez la présence de fuite de liquide aux points susceptibles de fuir.

Épongez tout liquide en excès et vérifiez à nouveau les fuites. Fixez ensuite la microsyringe contenant de l'huile minérale au canal d'injection. Essuyez ensuite toute solution en excès.

Avec de la gaze. Vérifiez la pointe d'injection. Il doit être possible de faire passer de petites gouttes de solution à travers celle-ci ; sinon, elle est obstruée ou alors fixez fermement l'injecteur à un système de pompe micro.

Ensuite, déplacez la position de l'aiguille d'injection aux coordonnées cibles et abaissez l'électrode vers le colliculus supérieur, qui peut être identifié par l'enregistrement des potentiels évoqués visuels. Pendant la descente de l'électrode, appliquez une légère pression positive en effectuant une injection à faible débit afin d'éviter tout colmatage. Interrompez l'injection lorsque la structure est atteinte.

Après l'insertion de l'injection, recouvrez le cortex exposé avec de l'agar chaud pour éviter la dessiccation. Après le positionnement final de l'électrode, attendez 30 minutes afin de permettre la stabilisation du tissu environnant l'électrode. Ensuite, injectez de 400 à 800 nanolitres de solution à un débit de 40 nanolitres par minute jusqu'à une activation de l'activité neuronale dans le colliculus supérieur ; l'électrode doit alors montrer une réduction des pics durant l'injection de la solution inhibitrice.

Des potentiels évoqués visuels ont été obtenus dans le colliculus supérieur. Après un éclair de 300 millisecondes appliqué à l’œil controlatéral lors de l’injection de GABA, l’activité en pointes en réponse à un stimulus lumineux a été supprimée pendant 45 à 60 minutes. Lors de cette procédure, il est important de vérifier la présence de fuites pendant le chargement et de s’assurer que la solution du médicament s’écoule librement à travers l’extrémité d’injection.