Plasmide dérivé d'ADN Strand Displacement Gates Réseaux de réaction d'exécution chimiques

L’objectif global de cette procédure est de dériver des portes de déplacement de brins d’ADN à partir de plasmides bactériens. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise le plasmide bactérien comme source très pure pour générer des portes d’ADN robustes. Mes collègues Sam Dip et moi-même ferons la démonstration de cette procédure pour commencer à produire en masse puis isoler des portes contenant de l’ADN à l’aide de kits d’isolement d’ADN comme décrit dans le protocole texte ci-joint et conformément aux instructions du fabricant suivant ellucian.

Mesurez la concentration d’ADN plasmidique à l’aide de techniques standard. Ensuite, digérez l’ADN en ajoutant quatre unités de l’enzyme de restriction PV U2 HF pour chaque milligramme du plasmide. Ensuite, ajoutez deux volumes équivalents d’éthanol absolu glacé à l’échantillon.

Incuber le mélange à moins 80 degrés Celsius pendant au moins une heure pour précipiter l’ADN. Ensuite, granulez l’ADN précipité en centrifugeant l’échantillon à 10 000 à 14 000 fois G et zéro degré Celsius pendant 30 minutes. Retirez le SNAT et ajoutez 1000 microlitres d’éthanol à 95 % à température ambiante à l’échantillon.

Ensuite, retournez l’échantillon 10 à 15 fois, centrifugez l’échantillon à 10 000 à 14 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Lorsque vous avez terminé, retirez le surnageant et faites sécher l’ADN à l’air libre sur une paillasse pendant 10 à 20 minutes. Lorsque vous retirez le surnageant de l’ADN précipité, veillez à ne pas déranger la pastille ou le rendement sera considérablement diminué.

Une fois sec, mettez en suspension la pastille d’ADN dans jusqu’à 200 microlitres d’eau sans nucléase et de vortex pour mélanger. L’ajout de plus de 200 microlitres d’eau permettra généralement de diluer l’échantillon pour l’utilisation. Dans les expériences cinétiques, mesurez l’ADN remis en suspension à l’aide d’un spectrophotomètre en suivant les instructions du fabricant.

Ajoutez ensuite quatre unités de l’enzyme d’entaille M-B-B-S-R-D, une par microgramme de plasmide, et ajoutez le tampon enzymatique correspondant. Incuber l’échantillon à 65 degrés Celsius pendant une heure pour digérer les portes articulaires. Ensuite, digérez les portes de fourche en ajoutant huit unités de l’enzyme d’entaille NT BST mb une par microgramme de plasmide et le tampon enzymatique correspondant.

Incuber l’échantillon à 55 degrés Celsius pendant une heure. Pour préparer les rapporteurs fluorescents, suspendez et quantifiez d’abord les échantillons comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Mélangez ensuite 10 microlitres du brin inférieur rapporteur avec 13 microlitres du brin supérieur dans un tampon EDTA en acétate de tris avec 12,5 millimolaires de magnésium.

Pour s’assurer que toute la flore est trempée, il faut ajouter un excédent de 30 % du brin étiqueté pour la trempe. Ensuite, anil le complexe rapporteur C à l’aide d’un thermocycleur. Refroidissez l’échantillon de 95 degrés Celsius à 20 degrés Celsius à raison d’un degré Celsius par minute.

Une fois terminé, stockez l’échantillon à quatre degrés Celsius après l’étalonnage. Commencez les mesures de fluorescence en réglant d’abord le contrôleur de température à 25 degrés Celsius pendant que la température se stabilise. Configurez les paramètres appropriés pour les mesures cinétiques dans le logiciel d’acquisition de données.

Après avoir ouvert le logiciel pour le fluorimètre spectral, réglez la largeur de glissement à 2,73 nanomètres pour l’excitation et l’émission monochrome. Réglez ensuite le temps d’intégration sur 10 secondes tous les 62 points de temps et réglez le temps total de mesure sur 24 heures. Enfin, réglez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission pour qu’elles correspondent à la forêt florale utilisée dans l’expérience.

Ensuite, ajoutez 410,2 microlitres d’eau sans nucléase et 52,8 microlitres de 10 tampons EDTA en acétate supplémentaires contenant 125 millimolaires de magnésium à une cellule de quartz synthétique. Ajoutez également deux microlitres de brins de poly T de 300 millimolaires, puis vortex la cellule de quartz synthétique pendant 10 à 15 secondes. Ensuite, à neuf microlitres des brins rapporteurs à 10 micromolaires et six microlitres de chaque brin auxiliaire à 10 micromolaires.

Ensuite, à 45 microlitres de l’articulation et de la fourche, dirigez-vous vers une micromolaire et mélangez doucement la solution en la pipetant de haut en bas au moins 20 fois. Enfin, à neuf microlitres de sulfate canalaire à 10 % de sodium, pour atteindre une concentration finale de 0,15 % SDS, mélangez doucement la réaction en pipetant de haut en bas au moins 20 fois, placez immédiatement les cellules synthétiques dans la chambre du fluter spectral et commencez la mesure cinétique. Après cinq minutes de mesure, ajoutez trois microlitres des brins d’entrée.

Ajoutez 10 micromolaires dans la cellule d’un quart synthétique. Pendant que le programme d’acquisition de données est en pause, mélangez doucement la réaction en la pipetant de haut en bas au moins 20 fois, puis fermez le couvercle de la lumière et continuez à enregistrer la cinétique de la réaction jusqu’à ce qu’elle atteigne une position stable. Les données cinétiques d’état pour les portes dérivées du plasma et les portes synthétisées sont présentées ici dans les expériences.

La concentration du brin de signal A est fixe tandis que la quantité du signal catalytique B est variée. Le signal C est utilisé pour lire la progression de la réaction sans l’interrompre. Le renouvellement du cycle catalytique est défini comme la quantité de signal C produite pour chaque catalyseur B à un moment donné.

Pour un système catalytique idéal, ce nombre de rotation doit augmenter linéairement avec le temps et être indépendant de la quantité de catalyseur tant que le substrat n’est pas limitant. Ici, on observe que le système synthétisé s’écarte de l’augmentation linéaire idéale du renouvellement beaucoup plus tôt que le système dérivé du plasma, indiquant la séquestration du catalyseur par une réaction secondaire indésirable. Les fuites de circuit des portes dérivées du plasma et des portes synthétisées sont comparées ici, et on observe que le rapport du signal de fuite utilisant des portes dérivées du plasma est inférieur d’environ 8 % à celui utilisant des portes synthétisées après 10 heures de réaction.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des portes d’ADN robustes à partir d’un plasmide bactérien et de tester les portes à l’aide de mesures de cinétique de fluorescence.