Name: Plasmide dérivé dADN Strand Displacement Gates Réseaux de réaction dexécution chimiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Découvrez comment dériver des portes de déplacement d'ADN à partir de plasmides bactériens et tester leur performance par cinétique de fluorescence. Cette méthode avance la programmation moléculaire.

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Les figures 1, 2, 3, 4, 6, 8 et Tableaux 2, 3, 10, 15, 16 sont modifiés à partir de 29 Réf. Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (NSF-CCF accorder 1.117.143 et 1.162.141 NSF-CCF à GS). Y.-JC a été soutenu par des bourses du gouvernement taiwanais. DTS a été soutenu par le Programme National Science Foundation Graduate Research Fellowship (de GRFP).

<ol><li>Zhang, D. Y., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+nanotechnology+using+strand-displacement+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions.</a> Nat. Chem. 3, 103-113 (2011).</li>
<li>Krishnan, Y., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+based+molecular+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid based molecular devices.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50, 3124-3156 (2011).</li>
<li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+DNA+strand+displacement+kinetics+using+toehold+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Control of DNA strand displacement kinetics using toehold exchange.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 17303-17314 (2009).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475, 368-372 (2011).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+up+digital+circuit+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Scaling up digital circuit computation with DNA strand displacement cascades.</a> Science. 332, 1196-1201 (2011).</li>
<li>Zadegan, R. M., Jepsen, M. D., Hildebrandt, L. L., Birkedal, V., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+fuzzy+and+boolean+logic+gates+based+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Construction of a fuzzy and boolean logic gates based on DNA.</a> Small. 11, 1811-1817 (2015).</li>
<li>Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-free+nucleic+acid+logic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzyme-free nucleic acid logic circuits.</a> Science. 314, 1585-1588 (2006).</li>
<li>Zadegan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+4+zeptoliters+switchable+3D+DNA+box+origami%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Construction of a 4 zeptoliters switchable 3D DNA box origami.</a> ACS Nano. 6, 10050-10053 (2012).</li>
<li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459, 73-76 (2009).</li>
<li>Zhang, D. Y., Hariadi, R. F., Choi, H. M., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+DNA+strand-displacement+circuitry+with+DNA+tile+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Integrating DNA strand-displacement circuitry with DNA tile self-assembly.</a> Nat. Commun. 4, (1965).</li>
<li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406, 605-608 (2000).</li>
<li>Green, S. J., Lubrich, D., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+hairpins%3A+fuel+for+autonomous+DNA+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">DNA hairpins: fuel for autonomous DNA devices.</a> Biophys. J. 91, 2966-2975 (2006).</li>
<li>Venkataraman, S., Dirks, R. M., Rothemund, P. W., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autonomous+polymerization+motor+powered+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">An autonomous polymerization motor powered by DNA hybridization.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 490-494 (2007).</li>
<li>Green, S. J., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+chemomechanical+cycles%3A+a+mechanism+for+autonomous+molecular+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Coordinated chemomechanical cycles: a mechanism for autonomous molecular motion.</a> Phys. Rev. Lett. 101, 238101(2008).</li>
<li>Omabegho, T., Sha, R., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bipedal+DNA+Brownian+motor+with+coordinated+legs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bipedal DNA Brownian motor with coordinated legs.</a> Science. 324, 67-71 (2009).</li>
<li>Turberfield, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fuel+for+free-running+nanomachines%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">DNA fuel for free-running nanomachines.</a> Phys. Rev. Lett. 90, 118102(2003).</li>
<li>Dirks, R. M., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+amplification+by+hybridization+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Triggered amplification by hybridization chain reaction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 15275-15278 (2004).</li>
<li>Seelig, G., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalyzed+relaxation+of+a+metastable+DNA+fuel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalyzed relaxation of a metastable DNA fuel.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 12211-12220 (2006).</li>
<li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318, 1121-1125 (2007).</li>
<li>Yin, P., Choi, H. M., Calvert, C. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+biomolecular+self-assembly+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming biomolecular self-assembly pathways.</a> Nature. 451, 318-322 (2008).</li>
<li>Chen, X., Briggs, N., McLain, J. R., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stacking+nonenzymatic+circuits+for+high+signal+gain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Stacking nonenzymatic circuits for high signal gain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 5386-5391 (2013).</li>
<li>Phillips, A., Cardelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programming+language+for+composable+DNA+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">A programming language for composable DNA circuits.</a> J. R. Soc. Interface. 6, Suppl 4. S419-S436 (2009).</li>
<li>Lakin, M. R., Youssef, S., Polo, F., Emmott, S., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+DSD%3A+a+design+and+analysis+tool+for+DNA+strand+displacement+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Visual DSD: a design and analysis tool for DNA strand displacement systems.</a> Bioinformatics. 27, 3211-3213 (2011).</li>
<li>Lakin, M. R., Youssef, S., Cardelli, L., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abstractions+for+DNA+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Abstractions for DNA circuit design.</a> J. R. Soc. Interface. 9, 470-486 (2012).</li>
<li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+and+modularity+properties+of+a+non-covalent+DNA+catalytic+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Robustness and modularity properties of a non-covalent DNA catalytic reaction.</a> Nucleic Acids Res. 38, 4182-4197 (2010).</li>
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<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+chemical+controllers+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Programmable chemical controllers made from DNA.</a> Nat. Nanotechnol. 8, 755-762 (2013).</li>
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<li>Cardelli, L., Csikasz-Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+switch+computes+approximate+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">The cell cycle switch computes approximate majority.</a> Sci. Rep. 2, 656(2012).</li>
<li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUPACK%3A+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Chem%22%5BJournal%5D)">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> J. Comput. Chem. 32, 170-173 (2011).</li>
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<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J. Vis. Exp. , e253(2007).</li>
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<li>Dalchau, N., Seelig, G., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+design+of+reaction-diffusion+patterns+using+DNA-based+chemical+reaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Computing+and+Molecular+Programming%22%5BJournal%5D)">Computational design of reaction-diffusion patterns using DNA-based chemical reaction networks.</a> DNA Computing and Molecular Programming. , 84-99 (2014).</li>
<li>Scalise, D., Schulman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+modular+reaction-diffusion+programs+for+complex+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Designing modular reaction-diffusion programs for complex pattern formation.</a> Technology. 2, 55-66 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Ce document décrit une méthode pour dériver portes ndsDNA d&#39;ADN plasmidique très pur. En outre, un protocole est présentée pour caractériser la performance de porte en utilisant un essai de cinétique de fluorescence. Les données expérimentales montrent que le système de plasmide dérivé surpasse son homologue synthétique même si le système de synthèse est assemblé à partir des brins purifiés en utilisant une électrophorèse sur gel de Polyacrylamide (PAGE). Probablement, l&#39;amélioration de la performance des portes dérivées du plasmide est principalement due à la très haute pureté de l&#39;ADN biologique. ADN synthétique contient un certain nombre d&#39;erreurs, en particulier des deletions qui se traduisent par des oligonucleotides d&#39;une longueur de tels produits secondaires n-1, et ne sont généralement pas complètement éliminé PAGE ou Chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) des procédures de purification. Des améliorations similaires à ceux rapportés ici ont également été observées dans une étude précédente d&#39;un amplificateur en épingle à cheveux catalysée qui a utilisé de l&#39;ADN provenant de sources biologiques 21. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Cependant, même l&#39;utilisation de portes dérivées du plasmide ne peut pas éliminer totalement les erreurs dans l&#39;exécution de la porte, pour lesquels il existe au moins deux raisons: d&#39;abord plus de digestion ou le manque de précision de coupe peut conduire à des portes avec un trop grand nombre entailles ou des entailles dans les mauvaises positions. Dans les deux cas, les portes sont plus susceptibles de participer à des réactions indésirables. Ces problèmes peuvent être assouplies en optimisant la quantité d&#39;enzyme utilisée (voir la figure 4). D&#39;autre part, dans ces expériences, la plupart des entrées auxiliaires et des brins de l&#39;ADN synthétique et sont donc contenues deletions et mutations. En principe, toutes les entrées et simple brin des brins auxiliaires peuvent également être obtenus à partir d&#39;ADN de phagemide à travers une digestion enzymatique coupure simple brin du génome viral m13 pré-codé 26. Peut-être que la performance du circuit peut être encore améliorée en utilisant ADNsb dérivé du génome bactérien. Bien que l&#39;utilisation de portes de plasmides dérivés n&#39;a été trouvée pour améliorer les performances du circuit, une analysedes temps de coût et de traitement a révélé que, bien que la production de portes de plasmide dérivé est légèrement meilleur marché (tableau 15), il prend 2-3 fois plus long temps de traitement par rapport à l&#39;assemblage et la purification des portes de oligos de synthèse dans le commerce (tableau 16). Les coûts primaires de portes de plasmides sont dérivés du gène de synthèse et l&#39;utilisation d&#39;enzymes de restriction. Pour 300 pmol de portes (suffisant pour 15 réactions à 30 nM), le coût estimé pour Rejoignez portes est d&#39;environ 170 $ et 200 $ pour Fork portes, la différence de coût étant due à l&#39;utilisation de différentes enzymes entailler. En revanche, la synthèse chimique des brins pour les mêmes coûts de grille autour de 260 $ y compris un supplément de purification PAGE. Le coût principal de l&#39;heure pour les portes dérivées du plasmide est dans la procédure de clonage, qui, tout comme la synthèse d&#39;ADN, peut être confiée à une société de synthèse de gènes. Cependant, une fois assemblées, les portes de plasmides dérivés présentent l&#39;avantage que les plasmides hôtes peuvent facilement être reproduits une peut être stocké sous forme de stocks de glycérol bactériennes. Cela permet de réutiliser les portes à plusieurs reprises. Pour l&#39;avenir, l&#39;amélioration de la performance des portes dérivées du plasmide pourrait permettre à un plus grand éventail de comportements dynamiques que d&#39;avoir été démontré expérimentalement à ce jour avec l&#39;ADN RRC. Par exemple, la récente 47,48 de travail théorique a suggéré que la répartition spatiale auto-organisés à la macro-échelle peuvent être réalisées avec les ADN RRC à travers un mécanisme de diffusion de réaction. La méthode présentée ici fournit un chemin viable pour la construction des composants moléculaires sous-jacents de ces matériaux d&#39;ADN auto-structuration. Bien que difficile, le développement de morphologies macro-échelle d&#39;une manière programmable aurait des implications importantes dans des domaines allant de la recherche sur les biomatériaux à la médecine régénératrice.

La prévisibilité de Watson-Crick a permis l&#39;ADN dynamique nanotechnologie à émerger comme un moyen programmable de concevoir des dispositifs moléculaires avec des propriétés dynamiques 1,2. En particulier, le déplacement de brin d&#39;ADN -, une réaction d&#39;hybridation compétitive programmable - est révélée être un mécanisme puissant pour l&#39;ingénierie des systèmes d&#39;ADN dynamiques. Dans une réaction de déplacement de brin d&#39;ADN, un oligonucléotide entrant déplace une &quot;sortie&quot; brin précédemment lié à un partenaire de liaison complémentaire. Plusieurs de ces réactions peuvent être enchaînés en plusieurs étapes cascades de réactions avec un degré élevé de contrôle sur l&#39;ordre et le moment de réaction individuelle étapes 3. ADN cascades de déplacement de brin ont été utilisées pour créer des circuits numériques et analogiques moléculaires 4-7, 8-10 nanostructures commutables, moteurs moléculaires autonomes 11-15, et amplificateurs catalytiques non-covalentes 13,16-21. En outre, DNA dispositifs utilisant des réactions de déplacement de brin peuvent être simulés et conçus pour des applications diverses en utilisant un logiciel de conception assistée par ordinateur 22-24. Actuellement, l&#39;ADN synthétisé chimiquement sert comme matériau principal pour nanotechnologie de l&#39;ADN. Toutefois, des erreurs dans le processus de synthèse de l&#39;ADN, et les oligonucléotides imparfaits qui en résultent, sont soupçonnés de limiter la performance des dispositifs dynamiques d&#39;ADN en provoquant des réactions erronées secondaires. Par exemple, des réactions «fuite» peuvent donner lieu à la libération d&#39;un oligonucléotide de sortie même en l&#39;absence d&#39;un déclencheur de réaction. Ces effets sont plus évidents dans cascades de réactions autocatalytiques où même une quantité minimale de fuite initial finira par conduire à la pleine activation de la cascade de 19,20. Inversement, les réactions ne parviennent souvent pas à atteindre le niveau attendu de l&#39;activation parce que certains composants ne déclenchent pas, même en présence de l&#39;entrée prévue de 7,25. Base d&#39;ADN pour faire la performance denanodispositifs comparables à leurs homologues biologiques à base de protéines, ces modes d&#39;erreur doivent être considérablement réduit. Plasmides bactériens ou autre ADN biologique pourraient servir de source relativement pas cher de l&#39;ADN de haute pureté pour les applications de la nanotechnologie. De grandes quantités d&#39;ADN peuvent être générés par la réplication dans les bactéries et les capacités intrinsèques de relecture des systèmes vivants assurer la pureté de l&#39;ADN résultant. En fait, plusieurs études récentes ont reconnu l&#39;utilité potentielle de l&#39;ADN biologique pour les applications des nanotechnologies 21,26-28. Cependant, la nature entièrement double brin de l&#39;ADN plasmidique a jusqu&#39;ici interdit son utilisation en tant que matériau pour la fabrication de dispositifs dynamiques de l&#39;ADN, qui se composent généralement de plusieurs oligonucleotides et contiennent à la fois des domaines double brin et simple brin. Dans un récent article 29 de cette question a été abordée et une nouvelle architecture de la porte d&#39;ADN qui se compose principalement de l&#39;ADN double brin entaillé (ndsDNA) était d&#39;introduireré. Surtout, systèmes de portes ndsDNA peuvent être conçus qui réalisent la dynamique spécifiées par tout réseau de réaction chimique formelle (CRN) 29. portes ndsDNA pourraient ainsi être utilisés, en principe, de créer des systèmes dynamiques qui présentent des oscillations et le chaos, bistabilité et de la mémoire, la logique booléenne ou comportements algorithmiques 30-38. Par exemple, Réf. 29 ont démontré une CRN trois réaction qui a fourni une mise en œuvre d&#39;un protocole moléculaire &quot;de consensus&quot;, un type d&#39;algorithme de calcul distribué 29,39,40. Ce travail d&#39;abord démontré une nouvelle utilisation pour le formalisme CRN comme un &quot;langage de programmation&quot; pour synthétiser rapidement les systèmes moléculaires fonctionnels (figure 1A). Ici, un protocole détaillé pour dériver portes ndsDNA de l&#39;ADN de plasmide est fourni. Le premier est un examen du processus de conception de la séquence. Puis suit une explication de la façon dont oligonucléotides synthétiques contenantles séquences de grille sont clonées dans des plasmides et la séquence vérifiées et amplifiés par culture bactérienne. Ensuite, il est montré comment ndsDNA portes peuvent être obtenues à partir des plasmides par traitement enzymatique (voir la figure 2). Enfin, un procédé pour tester le comportement de grille en utilisant les dosages cinétiques de fluorescence est décrite. Mécanisme réaction A titre d&#39;exemple, le protocole met l&#39;accent sur ​​la réaction chimique catalytique A + B-&gt; B + C. Les espèces A, B, et («signaux», figure 1B) C correspondent toutes à une autre molécule d&#39;ADN simple brin. Les séquences de ces molécules sont totalement indépendants et les brins ne réagissent pas directement avec l&#39;autre. Les séquences de tous les signaux ont deux domaines fonctionnels différents, à savoir, séquences qui agissent ensemble dans des réactions de déplacement de brins: 1) un domaine de prendre pied court (étiquettes TA, TB, TC) qui est utilisé pour l&#39;initiation de déplacement de brin reaction, et 2) un domaine de temps (étiquettes a, b, c) qui détermine l&#39;identité du signal. Interactions entre les brins de signaux sont médiés par ADN (ndsDNA) complexes de porte à double brin entaillés (appelé jointure AB et Fork BC) et les espèces simple brin auxiliaires (&lt;tr r&gt;, &lt;b tr&gt;, &lt;c tb&gt; et &lt;i tc &gt;). La réaction A + B- formel&gt; B + C est exécutée par une série d&#39;étapes de réaction de déplacement de brin, où chaque étape de réaction expose un pied pour une réaction ultérieure (figure 1B). Dans cet exemple, les signaux A et B sont d&#39;abord libre en solution tandis que le signal C est lié à la grille fourche. A la fin de la réaction B et C sont en solution. Plus généralement, les signaux qui sont liés à une porte sont inactifs alors que les signaux qui sont libres en solution sont actifs, ce qui signifie qu&#39;ils peuvent participer à une réaction de déplacement de brin queune entrée. L&#39;évolution dans le temps de la réaction est suivi en utilisant une stratégie de rapporteur fluorescent (figure 1C). 29 Dans des travaux antérieurs, il a été démontré que ce mécanisme de réaction ne réalise pas la stoechiométrie correcte mais également la cinétique de la réaction visée.

<table><tbody><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix avec tampon HF</td><td>NEB</td><td>M0531S</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>NEB</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>PstI-HF</td><td>NEB</td><td>R3140S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon formidable,</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0918-250G</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Hispeed Maxi-prep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>Nb.BsrDI</td><td>NEB</td><td>R0648L</td><td></td></tr><tr><td>Nt.BstNBI</td><td>NEB</td><td>R0607L</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blocs génomiques double brin</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorimètre Fluorolog-3</td>Cellules de quartz synthétiques <td>Horiba/Jobin Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>²</td><td>Starna</td><td>23-5.45-S0G-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel QIAGEN</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Squelettes plasmidiques</td><td>BioBrick</td><td>E0240-pSB1A2</td><td>Plasmide à nombre de copies élevé avec résistance à l’ampicilline. La séquence peut être trouvée à partir de http://parts.igem.org</td></tr></tbody></table>

plasmide dérivé d&#39;adn strand displacement gates réseaux de réaction d&#39;exécution chimiques

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

La nanotechnologie de l’ADN nécessite de grandes quantités d’ADN hautement pur comme matériau d’ingénierie. L’ADN plasmidique pourrait répondre à ce besoin puisqu’il est répliqué avec une grande fidélité, qu’il est facilement amplifié par culture bactérienne et qu’il peut être stocké indéfiniment sous forme de stocks de glycérol bactérien. Cependant, la nature double brin de l’ADN plasmidique a jusqu’à présent entravé son utilisation efficace pour la construction de nanostructures d’ADN ou de dispositifs contenant généralement des domaines simple brin ou ramifiés. Dans des travaux récents, il a été constaté que les portes de déplacement de brin d’ADN double brin (ndsDNA) pouvaient provenir de l’ADN plasmidique. Ce qui suit est un protocole qui détaille comment ces portes ndsDNA peuvent être codées efficacement dans les plasmides et peuvent être dérivées des plasmides par un petit nombre d’étapes de traitement enzymatique. Un protocole est également présenté pour tester les portes ndsDNA à l’aide de mesures de cinétique de fluorescence. Les portes NdsDNA peuvent être utilisées pour mettre en œuvre des réseaux de réactions chimiques (CRN) arbitraires et ainsi fournir une voie vers l’utilisation du formalisme CRN comme langage de programmation moléculaire prescriptif. Pour faire la démonstration de cette technologie, une cascade de réaction en plusieurs étapes avec cinétique catalytique est construite. De plus, il est montré que les composants dérivés des plasmides fonctionnent mieux que les composants identiques assemblés à partir d’ADN synthétique.

Ce protocole décrit une méthode permettant de dériver des portes de déplacement de brins d’ADN à partir de plasmides et de les tester à l’aide de mesures de cinétique de fluorescence. Les portes peuvent être composées de manière modulaire en systèmes à plusieurs composants pour se rapprocher du comportement des réseaux de réaction chimique (CRN) formels, démontrant ainsi une nouvelle utilisation des CRN en tant que langage de programmation moléculaire.

Plasmide dérivé d&#39;ADN Strand Displacement Gates Réseaux de réaction d&#39;exécution chimiques

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

L’objectif global de cette procédure est de dériver des portes de déplacement de brins d’ADN à partir de plasmides bactériens. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise le plasmide bactérien comme source très pure pour générer des portes d’ADN robustes. Mes collègues Sam Dip et moi-même ferons la démonstration de cette procédure pour commencer à produire en masse puis isoler des portes contenant de l’ADN à l’aide de kits d’isolement d’ADN comme décrit dans le protocole texte ci-joint et conformément aux instructions du fabricant suivant ellucian.Mesurez la concentration d’ADN plasmidique à l’aide de techniques standard. Ensuite, digérez l’ADN en ajoutant quatre unités de l’enzyme de restriction PV U2 HF pour chaque milligramme du plasmide. Ensuite, ajoutez deux volumes équivalents d’éthanol absolu glacé à l’échantillon.Incuber le mélange à moins 80 degrés Celsius pendant au moins une heure pour précipiter l’ADN. Ensuite, granulez l’ADN précipité en centrifugeant l’échantillon à 10 000 à 14 000 fois G et zéro degré Celsius pendant 30 minutes. Retirez le SNAT et ajoutez 1000 microlitres d’éthanol à 95 % à température ambiante à l’échantillon.Ensuite, retournez l’échantillon 10 à 15 fois, centrifugez l’échantillon à 10 000 à 14 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Lorsque vous avez terminé, retirez le surnageant et faites sécher l’ADN à l’air libre sur une paillasse pendant 10 à 20 minutes. Lorsque vous retirez le surnageant de l’ADN précipité, veillez à ne pas déranger la pastille ou le rendement sera considérablement diminué.Une fois sec, mettez en suspension la pastille d’ADN dans jusqu’à 200 microlitres d’eau sans nucléase et de vortex pour mélanger. L’ajout de plus de 200 microlitres d’eau permettra généralement de diluer l’échantillon pour l’utilisation. Dans les expériences cinétiques, mesurez l’ADN remis en suspension à l’aide d’un spectrophotomètre en suivant les instructions du fabricant.Ajoutez ensuite quatre unités de l’enzyme d’entaille M-B-B-S-R-D, une par microgramme de plasmide, et ajoutez le tampon enzymatique correspondant. Incuber l’échantillon à 65 degrés Celsius pendant une heure pour digérer les portes articulaires. Ensuite, digérez les portes de fourche en ajoutant huit unités de l’enzyme d’entaille NT BST mb une par microgramme de plasmide et le tampon enzymatique correspondant.Incuber l’échantillon à 55 degrés Celsius pendant une heure. Pour préparer les rapporteurs fluorescents, suspendez et quantifiez d’abord les échantillons comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Mélangez ensuite 10 microlitres du brin inférieur rapporteur avec 13 microlitres du brin supérieur dans un tampon EDTA en acétate de tris avec 12,5 millimolaires de magnésium.Pour s’assurer que toute la flore est trempée, il faut ajouter un excédent de 30 % du brin étiqueté pour la trempe. Ensuite, anil le complexe rapporteur C à l’aide d’un thermocycleur. Refroidissez l’échantillon de 95 degrés Celsius à 20 degrés Celsius à raison d’un degré Celsius par minute.Une fois terminé, stockez l’échantillon à quatre degrés Celsius après l’étalonnage. Commencez les mesures de fluorescence en réglant d’abord le contrôleur de température à 25 degrés Celsius pendant que la température se stabilise. Configurez les paramètres appropriés pour les mesures cinétiques dans le logiciel d’acquisition de données.Après avoir ouvert le logiciel pour le fluorimètre spectral, réglez la largeur de glissement à 2,73 nanomètres pour l’excitation et l’émission monochrome. Réglez ensuite le temps d’intégration sur 10 secondes tous les 62 points de temps et réglez le temps total de mesure sur 24 heures. Enfin, réglez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission pour qu’elles correspondent à la forêt florale utilisée dans l’expérience.Ensuite, ajoutez 410,2 microlitres d’eau sans nucléase et 52,8 microlitres de 10 tampons EDTA en acétate supplémentaires contenant 125 millimolaires de magnésium à une cellule de quartz synthétique. Ajoutez également deux microlitres de brins de poly T de 300 millimolaires, puis vortex la cellule de quartz synthétique pendant 10 à 15 secondes. Ensuite, à neuf microlitres des brins rapporteurs à 10 micromolaires et six microlitres de chaque brin auxiliaire à 10 micromolaires.Ensuite, à 45 microlitres de l’articulation et de la fourche, dirigez-vous vers une micromolaire et mélangez doucement la solution en la pipetant de haut en bas au moins 20 fois. Enfin, à neuf microlitres de sulfate canalaire à 10 % de sodium, pour atteindre une concentration finale de 0,15 % SDS, mélangez doucement la réaction en pipetant de haut en bas au moins 20 fois, placez immédiatement les cellules synthétiques dans la chambre du fluter spectral et commencez la mesure cinétique. Après cinq minutes de mesure, ajoutez trois microlitres des brins d’entrée.Ajoutez 10 micromolaires dans la cellule d’un quart synthétique. Pendant que le programme d’acquisition de données est en pause, mélangez doucement la réaction en la pipetant de haut en bas au moins 20 fois, puis fermez le couvercle de la lumière et continuez à enregistrer la cinétique de la réaction jusqu’à ce qu’elle atteigne une position stable. Les données cinétiques d’état pour les portes dérivées du plasma et les portes synthétisées sont présentées ici dans les expériences.La concentration du brin de signal A est fixe tandis que la quantité du signal catalytique B est variée. Le signal C est utilisé pour lire la progression de la réaction sans l’interrompre. Le renouvellement du cycle catalytique est défini comme la quantité de signal C produite pour chaque catalyseur B à un moment donné.Pour un système catalytique idéal, ce nombre de rotation doit augmenter linéairement avec le temps et être indépendant de la quantité de catalyseur tant que le substrat n’est pas limitant. Ici, on observe que le système synthétisé s’écarte de l’augmentation linéaire idéale du renouvellement beaucoup plus tôt que le système dérivé du plasma, indiquant la séquestration du catalyseur par une réaction secondaire indésirable. Les fuites de circuit des portes dérivées du plasma et des portes synthétisées sont comparées ici, et on observe que le rapport du signal de fuite utilisant des portes dérivées du plasma est inférieur d’environ 8 % à celui utilisant des portes synthétisées après 10 heures de réaction.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des portes d’ADN robustes à partir d’un plasmide bactérien et de tester les portes à l’aide de mesures de cinétique de fluorescence.

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