Développement d'un modèle organotypique multicellulaire en trois dimensions de la muqueuse intestinale humaine Grown Sous microgravité

L'objectif général de cette procédure est de décrire le développement d'un modèle organotypique tridimensionnel multi-cellulaire de la muqueuse intestinale humaine cultivé en microgravité fournie par des bioréacteurs à paroi tournante. Cette méthode présente un large potentiel en tant qu'outil de découverte dans les domaines de la santé et de la maladie, notamment pour l'étude des interactions avec les agents pathogènes, du trafic des antigènes et des processus inflammatoires.

Les principaux avantages de cette technique sont la reproduction de la diversité phénotypique du chat et l'utilisation de bioréacteurs à vaisseau D-12 qui permettent une diffusion efficace des nutriments et de l'oxygène. Commencez par dévisser le bouchon du port de remplissage du récipient de culture et ajoutez 50 millilitres de notre PMI. Une fois le récipient rempli, remettez le bouchon en place et essuyez tout milieu renversé avec de l'éthanol à 70 %.

Laisser le récipient en incubation pendant au moins 15 minutes jusqu’à toute la nuit à température ambiante. Lorsque vous êtes prêts de poursuivre, utilisez le port de remplissage pour éliminer le milieu de culture et ajouter 30 millilitres du milieu de culture 3-D dans le récipient. Remettez le bouchon sur le port de remplissage et essuyez à nouveau tout milieu renversé avec de l’éthanol à 70 %.

Retirer des flacons presque confluentes contenant des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine et des fibroblastes coliques humains à partir de l’incubateur et les laver deux fois avec du PBS. Ensuite, détacher les cellules en les recouvrant d'une solution de trypsine à 0,25 % contenant 0,05 % de trypsine EDTA. Une fois les cellules détachées, les recueillir dans un tube de 50 millilitres préchargé avec 30 millilitres de DMEM contenant 30 % de FBS.

Centrifuger le tube pendant 10 minutes pour former un culot cellulaire. Ensuite, resuspendre les cellules dans 30 millilitres de DMEM contenant 30 % de FBS. Puis, diluer 20 microlitres des cellules resuspendues avec 20 microlitres de colorant au bleu de trypan.

Chargez le compteur de cellules avec le mélange cellulaire et déterminez la concentration des cellules viables. Ensuite, remettez en suspension chaque type cellulaire à une concentration de 50 à 80 millions de cellules par millilitre dans du DMEM contenant 30 % de FCS. Commencez par placer le nombre approprié d'inserts de culture dans les puits d'une plaque de six puits.

Ensuite, préparez le mélange de collagène en ajoutant d'abord du DMEM 10x, du milieu de réconstitution 10x, de la L-glutamine à 200 millimolaire et du FBS inactivé par la chaleur dans un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez ensuite du collagène de type I bovin, de la laminine, du collagène de type IV, de la fibronectine, du protéoglycane sulfate d'héparine, puis ajoutez enfin de l'hydroxyde de sodium pour neutraliser le pH de la solution. Si, à un moment quelconque, le mélange prend une apparence acide de couleur jaunâtre, ajoutez quelques gouttes d'hydroxyde de sodium stérile à 1 normal pour neutraliser le mélange.

Fermer le tube et mélanger la solution en l'inversant plusieurs fois, tout en évitant la formation de bulles. Lorsqu'on ne mélange pas, garder la solution sur de la glace pour éviter sa polymérisation. Une fois mélangée, ajouter les suspensions cellulaires à la préparation de collagène et mélanger les tubes en les inversant doucement plusieurs fois pour éviter la formation de bulles.

Les replacer ensuite sur la glace. Ajouter quatre à cinq millilitres de la solution de collagène contenant les cellules dans chaque insert et laisser le collagène gélifier dans la hotte, avec le moins de mouvement possible, pendant une heure. Après une heure, transférer la plaque à six puits dans une étuve pendant une à deux heures supplémentaires.

Ensuite, remettez la plaque dans la hotte de culture tissulaire et utilisez une paire de forceps stériles et un scalpel pour découper aseptiquement la membrane de l'insert. Détachez le gel contenant les cellules de la membrane, puis découpez le gel détaché en petits carrés. Ajoutez les petits carrés de collagène contenant les cellules dans l'un des récipients de 50 millilitres pré-remplis en utilisant le port de remplissage.

Préparez ensuite une suspension de cellules épithéliales humaines HCT-8 comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. Resuspendez les cellules à une concentration de 10 millions de cellules par millilitre dans du DMEM contenant 30 % de FCS. Ajoutez alors un millilitre de la suspension de cellules HCT-8 dans le récipient de 50 millilitres en utilisant son orifice de remplissage.

Après avoir ajouté les cellules, ajouter 20 millilitres supplémentaires de milieu de culture 3-D dans le récipient afin qu’il soit presque plein. Remettre le bouchon en place et humidifier le bord du port de remplissage avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, insérer une seringue de cinq millilitres contenant trois à quatre millilitres de milieu de culture 3-D dans l’un des ports du récipient et une seringue vide de cinq millilitres dans l’autre port.

Éliminer toutes les bulles visibles en tirant dans la seringue vide, tandis qu'un volume à peu près équivalent de milieu est injecté par l'autre seringue dans le récipient. Une fois tout l'air éliminé, placer les récipients dans le bioréacteur, allumer l'appareil et régler la vitesse à 13 à 14 tours par minute. Ajuster la vitesse au besoin afin d'empêcher les cellules de toucher les parois du récipient.

Incubez les cellules en conditions de microgravité et changez le milieu de culture tous les trois à quatre jours. Pour le changement de milieu, utilisez la méthode de la double seringue afin de remplacer environ 30 millilitres du milieu utilisé par du milieu de culture 3-D frais. Après trois à cinq jours d'incubation, isolez les cellules mononucléées du sang périphérique comme décrit dans le protocole textuel accompagnant.

Ensuite, retirez le récipient du bioréacteur et ajoutez environ 20 millions de cellules composées de lymphocytes et de monocytes dans les récipients par le port de remplissage. Replacez les récipients dans le bioréacteur et poursuivez la culture pendant quatre à six jours supplémentaires. Vers le neuvième jour de culture, ajoutez 20 millions de cellules supplémentaires composées de lymphocytes et de monocytes dans le récipient et continuez la culture jusqu'à 12 jours supplémentaires.

À la fin de l'expérience, utiliser une pipette de transfert pour récupérer chaque petit fragment de gel, désormais appelé un construit, et les placer dans les puits d'une plaque à six puits contenant 10 millilitres de tampon au formol à 10 %. Fixer les construits pendant trois heures à température ambiante, puis procéder selon les protocoles standards d'encapsulation histologique, de sectionnement et de coloration. Les méthodes présentées dans cette vidéo permettent d'obtenir un modèle organotypique tridimensionnel multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine.

Dans un environnement de culture en micro-gravité, les cellules s'organisent bien et forment des structures ordonnées, semblables à des villosités, d'ici le jour 20. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six heures, à condition d'être exécutée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de respecter scrupuleusement les bonnes pratiques de culture cellulaire.

Il est essentiel de contrôler systématiquement les cellules quant à leur viabilité, à une éventuelle contamination par des mycoplasmes et aux modifications de leur comportement de croissance. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que l'immunohistochimie, peuvent être réalisées afin d'identifier des marqueurs de lignage et de différenciation cellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de développer un modèle organotypique tridimensionnel multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine cultivé en microgravité.