Développement d'un modèle organotypique multicellulaire en trois dimensions de la muqueuse intestinale humaine Grown Sous microgravité

L’objectif global de cette procédure est de décrire le développement d’un modèle organotypique multicellulaire 3D de la muqueuse intestinale humaine cultivée en microgravité fournie par des bioréacteurs à cuve à paroi rotative. Cette méthode a un large potentiel en tant qu’outil de découverte dans les domaines de la santé et de la maladie. Y compris les interactions avec les agents pathogènes, le trafic d’antigènes et les processus inflammatoires.

Les principaux avantages de cette technique sont l’imitation de la diversité phénotypique du chat et l’utilisation des bioréacteurs à cuve D-12 qui permettent une diffusion efficace des nutriments et de l’oxygène. Commencez par dévisser le bouchon de l’orifice de remplissage du récipient de culture et ajoutez 50 millilitres de notre PMI. Une fois le récipient plein, remettez le bouchon et essuyez tout produit renversé avec de l’éthanol à 70 %.

Laissez le récipient incuber pendant au moins 15 minutes à toute la nuit à température ambiante. Lorsque vous êtes prêt à continuer, utilisez l’orifice de remplissage pour jeter le milieu de culture et ajoutez 30 millilitres de milieu de culture 3D dans le récipient. Replacez le capuchon sur l’orifice de remplissage et essuyez à nouveau tout fluide renversé avec de l’éthanol à 70 %.

Retirez de l’incubateur les flacons proches du confluent contenant des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine et des fibroblastes du côlon humain et lavez-les deux fois avec du PBS. Ensuite, détachez les cellules en les recouvrant d’une solution de trypsine à 0,25 % avec de l’EDTA à 0,05 %. Une fois les cellules détachées, collectez-les dans un tube de 50 millilitres préchargé avec 30 millilitres de DMEM contenant 30 % de FBS.

Centrifugez le tube pendant 10 minutes pour granuler les cellules. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans 30 millilitres de DMEM contenant 30 % de FBS. Ensuite, diluez 20 microlitres des cellules remises en suspension avec 20 microlitres de colorant bleu trypan.

Chargez l’hémocytomètre avec le mélange de cellules et comptez la concentration de cellules viables. Ensuite, mettez à nouveau en suspension chaque type de cellule à 50 à 80 millions de cellules par millilitre dans du DMEM contenant 30 % de FBS. Tout d’abord, placez le nombre approprié d’inserts de culture dans les puits d’une plaque à six puits.

Ensuite, préparez le mélange de collagène en ajoutant d’abord 10x DMEM, 10x Reconstitution Media, 200 millimolaires de L-glutamine et FBS inactivé par la chaleur dans un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez ensuite du collagène bovin de type un, de la laminine, du collagène de type quatre, de la fibronectine, du protéoglycane de sulfate d’héparine et enfin ajoutez de l’hydroxyde de sodium pour neutraliser le pH de la solution. Si, à tout moment, le mélange développe un aspect acide de couleur jaunâtre, ajoutez quelques gouttes d’hydroxyde de sodium stérile 1 normal pour neutraliser le mélange.

Fermez le tube et mélangez la solution en la retournant plusieurs fois tout en évitant la formation de bulles. Lorsque vous ne mélangez pas, gardez la solution sur de la glace pour éviter qu’elle ne polymérise. Une fois mélangés, ajoutez les suspensions cellulaires à la préparation de collagène et mélangez les tubes en inversant doucement les tubes plusieurs fois pour éviter la formation de bulles.

Remettez-les ensuite sur la glace. Ajoutez quatre à cinq millilitres de solution de collagène contenant des cellules dans chaque insert et laissez le collagène se gélifier dans la hotte avec peu ou pas de mouvement pendant une heure. Au bout d’une heure, transférez la plaque à six puits dans un incubateur pendant une à deux heures supplémentaires.

Ensuite, remettez la plaque dans le capuchon de culture tissulaire et utilisez une paire de pinces stériles et un scalpel pour couper aseptiquement la membrane de l’insert. Détachez la cellule contenant le gel de la membrane, puis coupez le gel détaché en petits carrés. Ajoutez la petite cellule contenant des carrés de collagène dans l’un des récipients préremplis de 50 millilitres à l’aide de l’orifice de remplissage.

Ensuite, préparez une suspension de cellules épithéliales humaines HCT-8 comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement. Remettez les cellules en suspension à une concentration de 10 millions de cellules par millilitre dans du DMEM contenant 30 % de FBS. Ensuite, ajoutez un millilitre de suspension de cellules HCT-8 dans le récipient de 50 millilitres à l’aide de son orifice de remplissage.

Après avoir ajouté les cellules, ajoutez 20 millilitres supplémentaires de milieu de culture 3D dans le récipient afin qu’il soit presque plein. Remettez le capuchon en place et mouillez la lèvre de l’orifice de remplissage avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, placez une seringue de cinq millilitres contenant trois à quatre millilitres de milieu de culture 3D dans un port du récipient et une seringue vide de cinq millilitres dans l’autre orifice.

Éliminez toutes les bulles visibles en tirant dans la seringue vide pendant qu’environ le même volume de fluide est injecté par l’autre seringue dans le récipient. Une fois tout l’air éliminé, placez les cuves dans le bioréacteur, allumez l’alimentation et réglez la vitesse à 13 à 14 rotations par minute. Ajustez la vitesse si nécessaire pour éviter que les cellules n’entrent en contact avec les parois du vaisseau.

Cultivez les cellules en microgravité et changez de milieu de culture tous les trois à quatre jours. Pour changer de milieu, utilisez la méthode à seringue double pour remplacer environ 30 millilitres du milieu utilisé par un milieu de culture 3D frais. Après trois à cinq jours de culture, isolez les cellules mononucléées du sang périphérique comme décrit dans le protocole de texte ci-joint.

Retirez ensuite le récipient du bioréacteur et ajoutez environ 20 millions de cellules composées de lymphocytes et de monocytes aux récipients par l’orifice de remplissage. Remettez les récipients dans le bioréacteur et cultivez pendant quatre à six jours supplémentaires. Vers le neuvième jour de la culture, ajoutez 20 millions de cellules supplémentaires composées de lymphocytes et de monocytes dans le vaisseau et poursuivez les cultures jusqu’à 12 jours supplémentaires.

À la fin de l’expérience, utilisez une pipette de transfert pour récolter chaque petit fragment de gel, maintenant appelé construction, et placez-les dans les puits d’une plaque à six puits contenant 10 millilitres de tampon de formol à 10 %. Fixez les constructions pendant trois heures à température ambiante, puis procédez avec les protocoles standard d’enrobage histologique, de sectionnement et de coloration. Les méthodes présentées dans cette vidéo produisent un modèle organotypique multicellulaire en 3D de la muqueuse intestinale humaine.

Dans la culture en microgravité, les cellules deviennent bien différenciées et forment des caractéristiques ordonnées, semblables à des villosités, au 20e jour. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six heures si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de respecter de bonnes directives de culture cellulaire.

Il est crucial de contrôler systématiquement la viabilité des cellules, la contamination par les mycoplasmes et les changements dans le comportement de croissance cellulaire. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme l’immunohistochimie peuvent être réalisées afin d’identifier les marqueurs de lignée et de différenciation cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer un modèle organotypique 3D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine cultivée en microgravité.