Name: Génération et manipulation d’organoïdes intestinaux de rat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Découvrez la génération d'organoïdes intestinaux de rat avec manipulation génétique par infection lentivirale et transfection. Ce modèle robuste facilite l'étude de la biologie intestinale avec pertinence physiologique pour la recherche.

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Nous remercions les membres des laboratoires Sumigray et Ameen pour leurs discussions approfondies. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation Charles H. Hood pour la santé de l’enfant et une subvention de la Fondation de la fibrose kystique (004741P222) à KS et par l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales des National Institutes of Health à NA sous le numéro d’attribution 2R01DK077065-12.

Isolement des cryptes intestinales de rat et génération d’organoïdes intestinaux

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<li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106(2020).</li>
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</ol>

Le développement d’un modèle d’organoïde intestinal de rat préserve les caractéristiques fonctionnelles importantes trouvées dans l’organe in vivo et constitue un outil prometteur pour les essais précliniques, le dépistage de médicaments et les tests fonctionnels. Ce modèle in vitro peut être utilisé en parallèle d’études précliniques in vivo en gastro-entérologie, pour lesquelles les rats sont souvent un modèle privilégié en raison de leur plus grande taille intestinale, de leurs aspects physiologiques communs avec les humains et, dans certains cas, de meilleurs modèles de maladies38. Ici, un protocole robuste étape par étape pour l’isolement des cryptes intestinales de rat, la génération et la culture à long terme d’organoïdes intestinaux de rat, ainsi que les applications en aval, y compris les tests fonctionnels de gonflement de la forskoline, l’immunofluorescence de la monture entière, la culture monocouche 2D et la manipulation génétique lentivirale est décrit. Les organoïdes intestinaux de rat sont susceptibles d’être pertinents dans de nombreux contextes de maladie où la physiopathologie des modèles murins est inappropriée et peuvent fournir un meilleur modèle pour la physiologie intestinale humaine par rapport aux organoïdes intestinaux de souris.
Pour établir des cultures organoïdes à longue durée de vie qui peuvent être passées et étendues, il est essentiel d’identifier les facteurs de croissance clés nécessaires au maintien de la prolifération épithéliale intestinale. Les organoïdes de souris sont le plus souvent cultivés dans un simple cocktail d’EGF, de R-spondine et de Noggin, bien qu’il ait été rapporté que Noggin n’est pas nécessaire pour la culture d’organoïdes intestinaux39. Les milieux conditionnés peuvent remplacer les facteurs de croissance recombinants et les lignées cellulaires les plus couramment utilisées sont les cellules L-WRN, qui sécrètent les cellules Wnt3a, Rspondin-3 et Noggin39, L-Wnt3a et HA-Rspondin1-Fc 293T40. Les milieux conditionnés au L-WRN sont suffisants pour soutenir non seulement la croissance des organoïdes intestinaux de souris39 , mais aussi la croissance des organoïdes intestinaux de plusieurs animaux de ferme et animaux de compagnie, y compris les chiens, les chats, les poulets, les chevaux, les vaches, les moutons et les porcs12. Cependant, les organoïdes intestinaux humains sont très différents dans leurs besoins en facteurs de croissance, car ils nécessitent des formulations de milieux distinctes pour leur phase de croissance d’expansion (c’est-à-dire la progression des petits vers les grands sphéroïdes) par rapport à leur phase de différenciation (c’est-à-dire la génération et la maturation de types cellulaires différenciés)10. Les besoins en milieux des organoïdes intestinaux de rat reflètent étroitement ceux des milieux de croissance d’expansion pour les organoïdes intestinaux humains, mais, notamment, les organoïdes de rat sont capables à la fois de croissance et de différenciation dans cet environnement de milieu, ce qui simplifie considérablement leurs exigences de culture. Alors que nos premières tentatives se sont concentrées sur l’établissement et la croissance d’organoïdes intestinaux de rat dans des milieux conditionnés au L-WRN, la culture à long terme était ténue et les lignées d’organoïdes intestinaux de rat souffraient d’un manque de robustesse (données non présentées). Cela peut être dû au fait que les lignées cellulaires L-WRN sont conçues pour sécréter de la R-spondine 3, tandis que la lignée cellulaire 293T-Rspo1 recommandée ici est conçue pour sécréter de la R-spondine 1. Il est possible que les organoïdes de rat et d’homme préfèrent la R-spondine 1, ce qui pourrait expliquer l’échec des lignées organoïdes de rat dans les milieux conditionnés en L-WRN.
Pour récapituler le plus fidèlement possible le contexte in vivo , il est important de développer des conditions de culture d’organoïdes qui permettent la survie, le maintien et la prolifération des cellules souches, et qui peuvent maintenir le renouvellement cellulaire et les événements de différenciation simultanés en types cellulaires distincts. Par conséquent, les concentrations de protéines recombinantes et/ou de protéines dans les milieux conditionnés doivent être étroitement titrées et contrôlées pour atteindre cet équilibre parfait. En particulier, des niveaux optimaux de Wnt sont essentiels pour éviter la perte de cultures d’organoïdes intestinaux. Trop peu de Wnt dans les milieux conditionnés seront incapables de soutenir la croissance, ce qui entraînera une perte de cellules souches et la mort subséquente des organoïdes ; La suractivation de Wnt rendra les organoïdes kystiques et indifférenciés10. Bien que cela ne soit pas détaillé ici, il est fortement recommandé de tester chaque lot de milieux conditionnés L-Wnt3a et 293T-Rspo1 à l’aide d’un test de luciférase rapporteur Wnt, tel qu’une lignée cellulaire Topflash41. Des études antérieures ont décrit qu’un lot optimal de support L-Wnt3a devrait entraîner une augmentation du signal de 15 fois à 12,5 % et une augmentation de 300 fois du signal à 50 %, par rapport à 1 % de L-Wnt3a10. Étant donné que les organoïdes de rat sont plus sensibles que les organoïdes de souris aux exigences de culture, en particulier aux niveaux d’activation de Wnt, ces étapes supplémentaires de contrôle de la qualité aident grandement à faciliter la robustesse et la fiabilité des cultures d’organoïdes de rat. Étant donné qu’il n’existe pas de ligne rapporteur similaire pour tester l’activité de Bmp et les concentrations relatives de Noggin dans les milieux conditionnés par Noggin, il est conseillé d’utiliser Noggin recombinant lorsque cela est possible pour contrôler avec précision les niveaux de Noggin. Alors que les organoïdes intestinaux de souris peuvent être cultivés et maintenus en l’absence de Noggin39, cela n’a pas été tenté pour les cultures d’organoïdes intestinaux de rat.
Au-delà des exigences de la culture cellulaire, la réussite de l’établissement initial d’une lignée organoïde de rat dépend de manière critique de l’épuisement efficace des villosités différenciées pendant l’isolement de la crypte. Des niveaux élevés de contamination par les villars provoquent la mort des cryptes, probablement en raison de signaux provenant des cellules mourantes ou de la séquestration de facteurs essentiels. Pour épuiser ces villosités différenciées des préparations épithéliales de manière précise et cohérente, il est recommandé d’effectuer des isolements épithéliaux à l’aide d’un stéréoscope. L’examen visuel de l’épithélium libéré permet de savoir clairement quand jeter le PBS et le remplacer (figure 1). Les cryptes ne doivent pas être collectées tant qu’il n’y a pas suffisamment de villosités. Les cellules de Villar sont différenciées en phase terminale et ne peuvent pas générer d’organoïdes en culture. De plus, le passage ultérieur d’organoïdes intestinaux de rat et leur utilisation pour toute application en aval nécessitent des soins délicats. L’incubation dans des réactifs de dissociation pendant de plus longues périodes (10 min) entraîne une mort cellulaire importante et une perte de la lignée organoïde.
Ici, un protocole simple et rapide pour générer des monocouches intestinales à partir d’organoïdes de rat est décrit. Les substrats EME et collagène I ont des effets différents sur l’épithélium, qui peuvent être exploités en fonction de l’objectif de l’étude. L’EME permet l’adhésion rapide et efficace de cellules individuelles et la formation de projections cellulaires. En revanche, le revêtement de la surface avec du collagène I retarde ces processus. Une fois que les monocouches atteignent environ 80 % de confluence, les cellules cultivées sur EME recommencent à générer des structures organoïdes 3D. Cependant, ils ne disposent pas d’un soutien physique et chimique suffisant pour poursuivre leur croissance. Ce retour à l’état organoïde peut être évité en maintenant des monocouches dans l’EME à une confluence de 50 % à 80 %. L’ajout d’EME dilué à la surface apicale des monocouches favorise la récupération rapide et la formation d’organoïdes de novo, générant des régions de convergence plus rapidement et plus facilement. Sur une surface de collagène I, les cellules peuvent former une monocouche uniforme et générer de petits amas. Cependant, l’ajout de collagène I sur les monocouches n’est pas suffisant pour induire la formation d’organoïdes. L’EME doit être dilué lors de l’ajout à la surface de la monocouche, car il y aura une résistance mécanique plus forte que l’organoïde naissant devra surmonter. Cependant, cette EME diluée ne permet pas la formation robuste de gros organoïdes. Tous les organoïdes de rat générés de novo qui se détachent naturellement de la surface doivent être immédiatement retirés et transférés dans de l’EME non dilué afin que le soutien structurel et la croissance puissent être restaurés. En raison de la petite taille des organoïdes à cette étape, le passage des organoïdes n’est pas recommandé tant qu’une croissance robuste n’a pas été établie. La signification biologique sous-jacente de la raison pour laquelle l’EME peut soutenir la reformation des organoïdes, mais si le collagène I peut ou ne peut pas le faire, n’est pas claire. Cependant, il a été rapporté que les cellules cultivées dans le collagène 3D ne peuvent pas former d’organoïdes bourgeonnés42,43 ou soutenir l’entretien à long terme. Les produits EME disponibles dans le commerce sont des mélanges hétérogènes de protéines extracellulaires, principalement de la laminine et du collagène IV44. Par conséquent, la composition distincte des protéines et la capacité d’une cellule épithéliale à s’engager dans la matrice extracellulaire à l’aide de différents complexes cellulaires pourraient permettre un remodelage dans l’EME, mais pas dans le collagène I. La question de savoir si les monocouches dérivées du collagène I peuvent être placées dans l’EME pour soutenir la formation et la croissance d’organoïdes n’a pas été testée.
La manipulation génétique du modèle d’organoïde intestinal de rat est décrite ici, et les protocoles de transduction lentivirale d’organoïdes 3D et de transfection transitoire de monocouches 2D sont décrits. Pour pallier la faible efficacité de la transduction des organoïdes lentiviraux, un protocole a été développé pour la transfection transitoire de monocouches 2D. La morphologie plate et les domaines apicaux exposés des monocouches facilitent l’accès aux virus et aux complexes contenant de l’ADN. L’expression d’un rapporteur EGFP utilisant le vecteur pLJM1-EGFP a été utilisée pour la validation de cette technique. L’expression rapporteure de la GFP a été observée après 24 h et a été maintenue pendant 5 à 6 jours dans les monocouches. Les études futures portant sur la transduction lentivirale des monocouches sont susceptibles d’avoir une efficacité supérieure à celle de la transduction organoïde 3D. En utilisant les protocoles ci-dessus, les organoïdes 3D peuvent être reformés à partir de monocouches 2D infectées pour faciliter la création de lignées stables. Avec soin, les lignées d’organoïdes intestinaux de rat peuvent être maintenues avec succès pendant plus d’un an, rester stables sur de nombreux passages, cryoconservées, décongelées avec succès et génétiquement modifiées à l’aide de la transduction lentivirale, répondant ainsi au besoin d’un modèle d’organoïde intestinal in vitro accessible et traitable qui conserve une pertinence physiologique pour les humains.

L’architecture épithéliale et la composition cellulaire de l’intestin grêle humain sont complexes, reflétant leurs fonctions physiologiques. Le rôle principal de l’intestin grêle est d’absorber les nutriments des aliments qui passent par sa lumière1. Pour maximiser cette fonction, la surface intestinale est organisée en protubérances en forme de doigts appelées villosités, qui augmentent la surface d’absorption, et en invaginations en forme de coupe appelées cryptes, qui abritent et isolent les cellules souches. Au sein de l’épithélium, divers types de cellules absorbantes et sécrétoires spécialisées sont générés pour remplir des fonctions distinctes1. En raison de cette complexité, il a été difficile de modéliser des tissus comme l’intestin dans des lignées cellulaires immortalisées à haut passage transformé. Cependant, l’étude des cellules souches, en particulier des cellules souches adultes et de leurs mécanismes de différenciation, a permis le développement de cultures d’organoïdes intestinaux en 3D. L’utilisation de modèles organoïdes a transformé le domaine, en partie en raison de leur récapitulation de certains composants architecturaux et de l’hétérogénéité des types cellulaires trouvés dans l’intestin intact. Les organoïdes intestinaux peuvent être cultivés in vitro à long terme en raison du maintien de la population active de cellules souches2.
Les organoïdes intestinaux sont rapidement devenus un modèle adaptable pour étudier la biologie des cellules souches, la physiologie cellulaire, les maladies génétiques et la nutrition3,4, ainsi qu’un outil pour développer de nouvelles méthodes d’administration de médicaments5. En outre, les organoïdes dérivés des patients sont utilisés pour la modélisation des maladies, la découverte de médicaments et le dépistage de traitements personnalisés, entre autres 6,7,8,9. Cependant, les organoïdes intestinaux humains présentent encore des défis. La disponibilité des tissus, les exigences relatives à l’approbation du comité d’examen institutionnel et les questions éthiques limitent l’utilisation généralisée d’échantillons humains. De plus, les organoïdes intestinaux humains générés à partir de cryptes intestinales nécessitent deux conditions de culture distinctes pour le maintien de cellules souches indifférenciées ou pour induire la différenciation de types de cellules matures10. Cela contraste avec l’in vivo, où les cellules souches et les types de cellules différenciées matures sont simultanément présents et générés/maintenus en continu1. D’autre part, les organoïdes intestinaux de souris, qui sont cultivés dans un cocktail moins complexe de facteurs de croissance, n’ont pas besoin de ce changement dans la composition du milieu et peuvent maintenir les cellules souches et les cellules différenciées dans le même contexte de milieu 2,11. Cependant, les différences clés dans l’intestin de la souris par rapport aux humains peuvent faire des organoïdes de souris un modèle sous-optimal dans de nombreux cas. Dans l’ensemble, de nombreux organoïdes intestinaux provenant de grands mammifères, y compris les chevaux, les porcs, les moutons, les vaches, les chiens et les chats, ont été générés avec succès dans des conditions de culture plus proches des organoïdes intestinaux de souris que les conditions de culture des organoïdes intestinaux humains12. Les différences dans les conditions des facteurs de croissance entre les organoïdes de souris et les organoïdes humains reflètent probablement des différences dans la composition de la niche des cellules souches et des exigences différentes pour la survie, la prolifération et le maintien des cellules souches. Par conséquent, il est nécessaire de disposer d’un système organoïde modèle facilement accessible qui 1) ressemble beaucoup à la composition des cellules intestinales humaines, 2) contient des cellules souches ayant des besoins en facteurs de croissance comme ceux des organoïdes intestinaux humains, et 3) est capable de maintenir en permanence des compartiments indifférenciés et différenciés. Idéalement, le système devrait provenir d’un modèle animal préclinique couramment utilisé, de sorte que les expériences in vivo et in vitro puissent être corrélées et utilisées en tandem.
Les rats sont un modèle préclinique couramment utilisé pour les études de physiologie et de pharmacologie intestinales en raison de leur physiologie intestinale et de leur biochimie très similaires à celles des humains13, en particulier en ce qui concerne la perméabilité intestinale14. Leur taille relativement plus grande que celle des souris les rend plus aptes aux interventions chirurgicales. Bien que des modèles animaux de grande taille, y compris des porcs, soient parfois utilisés, les rats sont un modèle plus abordable, nécessitent moins d’espace pour l’élevage et ont des souches standard facilement disponibles dans le commerce15. L’un des inconvénients de l’utilisation de modèles de rats est que la boîte à outils génétique pour les études in vivo n’est pas bien développée par rapport à celle des souris, et que la génération de nouvelles lignées de rats, y compris les knock-outs, les knock-ins et les transgéniques, est souvent d’un coût prohibitif. Le développement et l’optimisation d’un modèle robuste d’organoïdes intestinaux de rat permettraient des manipulations génétiques, des traitements pharmacologiques et des études à plus haut débit dans un modèle accessible qui conserve une pertinence physiologique clé pour les humains. Cependant, les avantages d’un modèle d’organoïde de rongeur par rapport à un autre dépendent fortement du processus ou du gène particulier étudié ; Certains gènes trouvés chez l’homme peuvent être des pseudogènes chez la souris, mais pas chez le rat16,17. De plus, les sous-types cellulaires spécifiques à l’espèce sont de plus en plus dévoilés par le RNAseq18,19,20 unicellulaire. Enfin, les modèles de maladies intestinales chez le rat et la souris présentent souvent des variations considérables dans les phénotypes21,22, de sorte que le modèle qui récapitule le plus fidèlement les symptômes et le processus pathologique observés chez l’homme doit être sélectionné pour un travail en aval. La génération d’un modèle d’organoïde intestinal de rat offre aux chercheurs une flexibilité et un choix supplémentaires dans le choix du système modèle le plus approprié à leur situation. Ici, les protocoles existants23,24 sont développés pour la génération d’organoïdes intestinaux de rat et un protocole est décrit pour la génération et le maintien d’organoïdes intestinaux de rat à partir du duodénum ou du jéjunum. En outre, plusieurs applications en aval, y compris l’infection lentivirale, la coloration de la monture entière et les tests de gonflement de la forskoline, sont décrites.

<table><tbody><tr><td>Matrice de culture 3D Collagène de rat I</td><td>Cultrex/R& D Systems</td><td>3447-020-01</td><td></td></tr><tr><td>70 & micro ; Filtre à cellules m</td><td>Corning/Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2942-20ML</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), sans sérum</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>100-1061</td><td></td></tr><tr><td>Cellules Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T R</td><td>& D Systems</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>16-000-044</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin I (humain)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de dissociation cellulaire douce</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>100-0485</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel à facteur de croissance réduit, sans rouge de phénol</td><td>Corning</td><td></td><td></td>356231</tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB06021</td><td></td></tr><tr><td>Lanoline</td><td>Beantown Chemical</td><td>144255-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>L-Wnt3a cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplément (100X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acétylcystéine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Sérum Réduit Moyen</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td>film transparent</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>pLJM1-EGFP</td><td>Addgene</td><td>19319</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de polyéthylénimine (PEI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>764965</td><td></td></tr><tr><td>p-phénylènediamine&nbsp ;</td><td>Acros Organics/Thermo Fisher</td><td>417481000</td><td></td></tr><tr><td>Puromycine</td><td>VWR</td><td>J593-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Protéine humaine recombinante FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B-250ug</td><td></td></tr><tr><td>Protéine humaine recombinante IGF-1</td><td>Biolegend</td><td>B356441</td><td></td></tr><tr><td>Protéine humaine recombinante Noggin</td><td>R & D Systems</td><td>6057-NG-100</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante Protéine EGF</td><td>Thermo Fisher</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Rat Dawley</td> Charles <td>River Laboratories</td><td>Souche 001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bioanalytique américaine</td><td>AB02025-00500</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorhydrate</td> <td>Y27632Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr></tbody></table>

génération et manipulation d’organoïdes intestinaux de rat

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids

Lors de l’utilisation d’organoïdes pour évaluer la physiologie et les décisions relatives au destin cellulaire, il est important d’utiliser un modèle qui récapitule étroitement les contextes in vivo . En conséquence, les organoïdes dérivés des patients sont utilisés pour la modélisation des maladies, la découverte de médicaments et le dépistage de traitements personnalisés. Les organoïdes intestinaux de souris sont couramment utilisés pour comprendre les aspects de la fonction/physiologie intestinale et de la dynamique/décision de destin des cellules souches. Cependant, dans de nombreux contextes de maladie, les rats sont souvent préférés aux souris comme modèle en raison de leur plus grande similitude physiologique avec les humains en termes de physiopathologie de la maladie. Le modèle du rat a été limité par le manque d’outils génétiques disponibles in vivo, et les organoïdes intestinaux de rat se sont avérés fragiles et difficiles à cultiver à long terme. Ici, nous nous appuyons sur des protocoles précédemment publiés pour générer de manière robuste des organoïdes intestinaux de rat à partir du duodénum et du jéjunum. Nous donnons un aperçu de plusieurs applications en aval utilisant des organoïdes intestinaux de rat, y compris les tests de gonflement fonctionnel, la coloration de la monture entière, la génération de monocouches entéroïdes 2D et la transduction lentivirale. Le modèle organoïde de rat fournit une solution pratique au besoin du domaine d’un modèle in vitro qui conserve une pertinence physiologique pour l’homme, peut être rapidement manipulé génétiquement et est facilement obtenu sans les obstacles impliqués dans l’obtention d’organoïdes intestinaux humains.

Les organoïdes duodénaux et jéjunaux de rat ont été générés à l’aide du protocole décrit à la section 2. Il est très important pendant les étapes d’isolement de la crypte que les villosités soient efficacement épuisées du PBS. Si trop de villosités sont plaquées dans l’EME avec des cryptes, cela peut entraîner la mort de toute la culture et l’échec de l’établissement d’une lignée organoïde. Pour cette raison, il est utile d’isoler les cryptes sous une lunette de dissection, ce qui permet de confirmer visuellement l’épuisement du villar. La figure 1 représente des fragments de villar et des cryptes représentatifs (figure 1A). Notez la taille significativement plus petite des cryptes par rapport aux villosités (Figure 1B). Après le placage, les cryptes se développeront en sphéroïdes au cours des prochains jours et commenceront à bourgeonner et à se différencier entre le 4e et le 7e jour (figure 2). Une fois que les organoïdes ont atteint un stade de bourgeonnement important, ils doivent être passés. Pendant le passage, il est important de perturber suffisamment les organoïdes pour séparer les bourgeons de la crypte, afin que le nombre d’organoïdes puisse être augmenté (Figure 3B).
La récupération réussie des organoïdes après congélation dépend fortement de l’état dans lequel ils sont congelés. Les organoïdes à l’état indifférencié hautement prolifératif se rétablissent avec la plus grande efficacité. Par conséquent, nous recommandons de les induire pour qu’ils soient sphériques et kystiques au lieu d’être bourgeonnés et différenciés. Pour y parvenir, Wnt peut être hyperactivé en augmentant la quantité du ligand Wnt R-spondine dans le milieu et en incluant du nicotinamide dans le milieu, dont il a été démontré qu’il favorise la formation d’organoïdes et la survie cellulaire dans plusieurs systèmes de culture30,31. La figure 3A montre une culture d’organoïdes saine seulement 2 jours après la décongélation. L’inclusion de BSA dans les milieux pendant la décongélation a également contribué à la survie des cultures d’organoïdes intestinaux de rat, qui se sont avérées plus délicates que les organoïdes intestinaux de souris.
Bien que la culture d’organoïdes 3D soit souvent préférée parce qu’elle récapitule une partie de l’architecture intestinale normale, elle rend d’autres approches, notamment l’imagerie en direct, les transfections et les transductions lentivirales, plus difficiles sur le plan technique. L’utilisation de monocouches 2D générées à partir d’organoïdes3D 32 (Figure 4) permet une introduction plus efficace des plasmides. Alors que les organoïdes intestinaux 3D sont traditionnellement résistants aux transfections transitoires, les plasmides codant pour l’EGFP peuvent être introduits avec succès à l’aide de méthodes de transfection à base de lipides. L’approche la plus rentable utilisant l’IPE est décrite à l’étape 6.1 (figure 5), mais l’électroporation et les réactifs de transfection disponibles dans le commerce ont également donné des résultats comparables (données non présentées). Les études futures se concentreront sur la question de savoir si ces approches peuvent être utilisées pour introduire des constructions CRISPR dans des monocouches.
Il était important de pouvoir reformer les organoïdes 3D à partir de monocouches 2D après la transfection afin qu’ils puissent être maintenus comme une ligne passable avec les composants architecturaux 3D des cryptes. Il est intéressant de noter que les monocouches 2D plaquées sur l’EME se sont facilement reformées en petits sphéroïdes lorsque l’EME a été rajoutée au sommet des cellules, alors qu’un substrat de collagène I n’était pas suffisant pour la reformation des structures 3D (Figure 6).
Bien que les transfections transitoires soient utiles pour de nombreuses études, la formation de lignées stables est souvent plus utile, nécessitant l’introduction de lentivirus dans les cellules. Des organoïdes intestinaux de rats ont été infectés par des lentivirus en modifiant des protocoles précédemment publiés (Figure 7). Une étape clé du protocole est la perturbation des organoïdes en petits agrégats ou en amas de cellules. Si les cultures ne sont pas efficacement perturbées et que les organoïdes restent intacts, les particules lentivirales ne pénètrent pas dans les cellules. Après l’infection, les organoïdes doivent se rétablir et repousser. Le protocole décrit ici permet l’absorption des particules virales par 10 % à 48 % (moyenne : 19,4 % ± 6,5 %) des cellules avant la sélection.
La coloration complète des organoïdes peut s’avérer difficile en raison de l’élimination incomplète des résidus d’EME ou de la pénétrance incomplète des anticorps. Le protocole décrit ici permet la coloration robuste des organoïdes. La visualisation des organoïdes au microscope confocal peut également s’avérer difficile s’ils sont trop éloignés de la lamelle. En utilisant VALAP, un puits avec une certaine hauteur est créé de sorte que les organoïdes ne sont pas écrasés par la lamelle, mais sont toujours autorisés à se déposer près de la lamelle pour faciliter l’imagerie. La figure 8 montre une coloration représentative contre le canal anionique apical, le régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR) et la phalloïdine pour marquer la F-actine.
Enfin, les organoïdes ont une utilité dans les essais fonctionnels. Des organoïdes dérivés de patients atteints de fibrose kystique ont été utilisés pour dépister la fonction CFTR, car le traitement par l’agoniste de l’AMPc, la forskoline, induit une sécrétion liquidienne robuste médiée par CFTR, provoquant un gonflement des organoïdes 29,33-37. L’un des objectifs de ce travail était d’identifier et de développer un modèle organoïde pouvant être utilisé en parallèle d’études précliniques in vivo. Par conséquent, nous avons cherché à déterminer si les organoïdes intestinaux de rat subissent un gonflement induit par la forskoline. En effet, dans les 30 minutes suivant le traitement à la forskoline, les organoïdes de rat ont gonflé, avec un effet maximal observé à 120 min (Figure 9).
<img alt="Interaction cellulaire dans une image de microscopie montrant des protozoaires engloutissant des bactéries, étude du processus biologique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Fragments de Villar et cryptes lors de l’isolement épithélial. (A) Image représentative de fragments de Villar dans une solution d’EDTA pendant le protocole d’isolement de la crypte. Des pointes de flèches jaunes marquent les fragments de villar. Les flèches rouges représentent des cryptes attachées à un fragment de villar. Notez la différence dans les tailles relatives. (B) Image à fort grossissement d’une seule crypte (flèche rouge) afin que la morphologie puisse être visualisée. Barres d’échelle : 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Images microscopiques de développement des organoïdes, jours 0 à 7, montrant la progression de la croissance et les changements morphologiques." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : Progression des organoïdes intestinaux chez le rat. Les cryptes du jéjunum des rats ont été plaquées dans l’EME immédiatement après l’isolement (A, B). En 2 jours, les cryptes sont devenues des sphéroïdes (C,D). Au jour 5, ils ont commencé à initier les bourgeons de la crypte (E, F), qui se sont élaborés et ont grandi au jour 7 (G). Barres d’échelle : 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Images de microscopie de culture cellulaire comparant la morphologie 2 jours après décongélation et après le passage ; analyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 : Organoïdes après décongélation et passage. (A) Les organoïdes jéjunaux de rat ont été décongelés selon les protocoles décrits après la cryoconservation. Notez la présence à la fois de sphéroïdes et d’organoïdes bourgeonnés seulement 2 jours après la décongélation. (B) La même lignée organoïde représentée en A immédiatement après le passage selon le protocole décrit. Notez la différence de taille relative entre les structures de A et B et la présence de domaines uniques de type crypte dans B. Barres d’échelle : 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Migration cellulaire dans le temps dans l’EME, Collagène I ; Images microscopes, 24h à 5j, résultats expérimentaux." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 : Formation de monocouches 2D à partir d’organoïdes 3D. (A-C) Progression monocouche 2D sur EME. (D-F) Progression monocouche 2D sur collagène I. Au jour 5, chaque condition a donné ~80% de confluence. Barres d’échelle : 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Images de microscopie, visualisation pLJM1-EGFP ; morphologie cellulaire, analyse de l’expression des protéines de fluorescence." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figure 5 : Transfection transitoire d’une monocouche 2D. Image représentative d’une monocouche 2D cultivée sur EME transfectée transitoirement avec un plasmide pLJM1-EGFP à l’aide de PEI. (A) fond clair, (B) fluorescence (GFP), (C) superposition. La ligne pointillée rouge marque la limite de la monocouche. Barres d’échelle : 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Image au microscope des structures cellulaires ; comparaison de la matrice de collagène ; Analyse matricielle EME et Collagen I." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figure 6 : Reformation d’organoïdes 3D à partir de monocouches 2D sur EME. (A) Formation d’organoïdes 3D à partir de monocouches 2D cultivées sur EME. Les organoïdes se forment efficacement 5 jours après l’ajout d’EME à la surface apicale de la monocouche. Notez l’abondance de cellules mortes entourant les petits sphéroïdes 3D. (B) Persistance des monocouches 2D 5 jours après l’ajout du collagène I à la surface apicale des monocouches 2D cultivées sur du collagène I. Barres d’échelle : 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Image de microscopie confocale ; expression de la GFP nucléaire dans les amas de cellules, analyse du marquage fluorescent." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig07.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> Figure 7 : Infection lentivirale d’organoïdes 3D. Les organoïdes du jéjunum de rat ont été infectés par des particules lentivirales GFP nucléaires en utilisant le protocole décrit. Après récupération et croissance pendant 5 jours, les organoïdes ont été fixés et contre-colorés avec du DAPI. (A) DAPI : gris ; nucléaireGFP : vert. (B) nucléaireGFP :vert. La ligne pointillée rouge marque la limite de l’organoïde. Barres d’échelle : 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Images de microscopie confocale, coloration CFTR et Phalloïdine des structures cellulaires, analyse de fluorescence." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig08.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> Figure 8 : Immunofluorescence de la monture entière des organoïdes intestinaux de rat. (A) CFTR, (B) phalloïdine, et (C) immunofluorescence de la monture entière fusionnée des organoïdes jéjunaux de rat. A noter l’enrichissement apical de la coloration CFTR dans les organoïdes (gris en A, magenta en C). La phalloïdine marque la Factine et marque de manière proéminente le bord apical du pinceau (gris en B, cyan en C). Barres d’échelle : 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Microscopie time-lapse du processus de diffusion, 0-120 min, diagramme avec analyse des limites en points rouges." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig09.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 9"> Figure 9 : Les organoïdes intestinaux de rat gonflent lors de la stimulation de la forskoline. Évolution temporelle représentative du gonflement des organoïdes intestinaux de rat après l’ajout de l’agoniste de l’AMPc, la forskoline. Le temps de 0 min représente le point de temps immédiatement avant l’ajout de 10 μM de forskoline. Les images montrent le même organoïde à des intervalles de temps de 30 minutes. Un gonflement maximal a été observé 120 min après l’ajout de forskoline. La ligne rouge pointillée délimite l’organoïde. La matière sombre au milieu de la lumière organoïde est composée de cellules mortes. Barres d’échelle : 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig09large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Recette AdDMEM+. Ingrédients pour fabriquer le média AdDMEM+ standard, qui est le média de base dans toutes les méthodes présentées ici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table1_Re.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Recette des milieux organoïdes intestinaux de rat (rIOM). Recette détaillée du milieu organoïde intestinal standard du rat, y compris le solvant et les conditions de stockage des protéines recombinantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table2_RE.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 3 : Solutions. Recettes et instructions pour faire d’autres solutions utilisées tout au long du protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table3_resub2_Re.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 4. Milieu organoïde intestinal de rat pour la culture monocouche 2D (rIOM2D). Recette modifiée de milieux de culture organoïdes optimisés pour la croissance 2D de monocouches. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table4_resub2_RE.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Nous présentons ici un protocole permettant de générer des organoïdes intestinaux de rat et de les utiliser dans plusieurs applications en aval. Les rats sont souvent un modèle préclinique privilégié, et le système organoïde intestinal robuste répond au besoin d’un système in vitro pour accompagner les études in vivo .

Génération et manipulation d’organoïdes intestinaux de rat

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. ...

Dans cette étude, nous avons établi un modèle d’organoïde intestinal de rat qui est robuste dans la culture cellulaire à long terme. Nous démontrons également les premières manipulations génétiques réussies utilisant à la fois l’infection lentivirale et la transfection transitoire. Ce modèle est un excellent outil pour manipuler la biologie intestinale chez le rat où les outils génétiques disponibles in vivo sont limités.Les organoïdes intestinaux de rat étaient auparavant difficiles à cultiver à long terme. En générant un modèle d’organoïde de rat robuste et génétiquement manipulable, nous offrons aux chercheurs une flexibilité et un choix supplémentaires pour sélectionner le modèle d’organoïde le mieux adapté à leur situation particulière. Les organoïdes intestinaux de souris sont utilisés pour étudier le comportement, le destin et la physiologie des cellules souches, mais ils peuvent être un modèle sous-optimal.Puisqu’il existe des différences essentielles entre la biologie de la souris et celle de l’homme. D’autre part, les organoïdes intestinaux humains peuvent être difficiles à obtenir et ont des exigences complexes en matière de culture cellulaire. Le modèle organoïde de rat que nous décrivons ici conserve une pertinence physiologique clé pour la biologie humaine, tout en étant considérablement plus facile d’accès et d’entretien que les organoïdes intestinaux humains.Le développement et l’optimisation du modèle d’organoïdes intestinaux de rat permettent des manipulations génétiques, des traitements pharmacologiques et des études de biologie intestinale à plus haut débit et un modèle accessible présentant une pertinence physiologique clé pour les humains. De plus, ces organoïdes de rat permettront d’étudier la physiologie spécifique à l’espèce, le destin cellulaire, les variations phénotypiques et les modèles de maladies dans l’intestin.

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Dans ce protocole vidéo, nous expliquons étape par étape la transduction lentivirale dans les organoïdes de l’épithélium intestinal primaire et le traitement et l’analyse en aval de ces cultures par RT-PCR quantitative, ARN-microarray et immunohistochimie.

Un protocole pour Lentiviral transduction et analyse aval de intestinale organoïdes

Nous décrivons des instructions étape par étape à : 1) engineerly organoids intestinal utilisant des nanoparticules magnétiques pour la transduction lenti- ou rétroviral, et, 2) produisent des sections congelées des organoïdes machinés. Cette approche fournit un outil puissant pour modifier efficacement l'expression des gènes chez les organoïdes pour l'étude des effets en aval.

Génie génétique des organoïdes intestinaux de souris primaires utilisant les vecteurs viraux de transduction magnétique de nanoparticule pour la section congelée

Ce protocole permet de différencier les cellules pluripotentes humaines en organoïdes intestinaux. Le protocole imite le développement humain normal en différenciant les cellules en une population d’endoderme définitif, d’endoderme de l’intestin postérieur, puis d’épithélium intestinal. Cela rend le protocole adapté à la fois à l’étude du développement intestinal et aux applications de modélisation des maladies.

Génération d’organoïdes intestinaux dérivés de hiPSC pour des applications de modélisation du développement et des maladies

Nous présentons ici deux protocoles qui permettent la modélisation des interactions apicales-spécifiques intestinales. Les monocouches intestinales organoïdes-dérivées et les cultures d’interface air-liquide (ALI) facilitent la génération d’épithélium bien différencié accessible des côtés luminal et basolatéral, tandis que les organoïdes intestinaux inversés à polarité exposent leur côté apical et se présentent à des analyses à haut débit.

Méthodes de culture pour étudier les interactions spécifiques aux apicales à l’aide de modèles organoïdes intestinaux

Ici, des méthodes détaillées pour générer, maintenir et caractériser des organoïdes de l’intestin grêle et du côlon dérivés de cellules souches pluripotentes humaines sont décrites. Ces méthodes sont conçues pour améliorer la reproductibilité, étendre l’évolutivité et réduire le temps de travail nécessaire au placage et au passage des organoïdes.

Génération, maintenance et caractérisation d’organoïdes intestinaux et coliques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines

Ce protocole décrit un modèle apico-out d’entérocolite nécrosante (ECN) dans une boîte utilisant des entéroïdes intestinaux grêles à polarité inversée, permettant l’accès à la surface apicale. Nous fournissons un protocole de coloration immunofluorescente pour détecter la perturbation épithéliale liée à l’ECN et une méthode pour déterminer la viabilité des entéroïdes à sortie apicale soumis au protocole NEC-in-a-dish.

In vitro Modèle entéroïde apical-out de l’entérocolite nécrosante

Nous décrivons un protocole pour isoler les cryptes de l’intestin grêle murin et cultiver des organoïdes intestinaux 3D à partir des cryptes. De plus, nous décrivons une méthode pour générer des organoïdes à partir d’une seule cellule souche intestinale en l’absence d’une niche cellulaire sous-épithéliale.

La culture 3D d’organoïdes à partir de cryptes intestinales murines et d’une seule cellule souche pour la recherche organoïde

Cette étude décrit un protocole pour générer des monocouches 2D d’organoïdes porcins dérivés de l’intestin grêle et du gros intestin. La croissance de ces monocouches est marquée par l’augmentation des valeurs TEER, indiquant une intégrité épithéliale robuste. De plus, ces monocouches présentent des réponses sécrétoires physiologiques dans les expériences en chambre d’Ussing après l’application de forskoline.

Organoïdes intestinaux porcins bidimensionnels reflétant les propriétés physiologiques de l’intestin natif

Ici, nous décrivons un protocole pour générer des organoïdes intestinaux apical-out à partir de cultures d’organoïdes standard enrobées de matrice. Il décrit également l’incorporation ultérieure de l’EdU dans les cellules à prolifération active et la quantification semi-automatique des cellules positives à l’EdU.

Génération d’organoïdes intestinaux apical-out et évaluation du taux de prolifération des organoïdes à l’aide du marquage EdU

Nous décrivons un protocole simple pour développer des organoïdes épithéliales mucociliary des cellules profondes d’ectoderm isolées des embryons de Xenopus laevis. Les progéniteurs multipotents régénèrent les précurseurs épithéliales des cellules gobelet et permettent un suivi en direct de l’initiation et de la progression des transitions cellulaires à la surface des organoïdes.

Organoïdes épithéliales mucociliaires des cellules embryonnaires de Xenopus : génération, culture et imagerie vivante haute résolution

Découvrez la génération d'organoïdes intestinaux de rat avec manipulation génétique par infection lentivirale et transfection. Ce modèle robuste facilite l'étude de la biologie intestinale avec pertinence physiologique pour la recherche.

Génération et manipulation d’organoïdes intestinaux de rat

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