Microfluidique Buffer Exchange pour sans interférence Micro / Nanoparticules ingénierie cellulaire

L’objectif global de cette procédure est de démontrer une technologie de purification microfluidique pratique, efficace et à haut débit, pour séparer les nanoparticules libres des cellules, en suivant l’ingénierie cellulaire avec les nanoparticules. Le principal objectif de cette technologie est de permettre l’élimination rapide et efficace des nanoparticules non liées. Après la procédure de travail cellulaire, nous rassemblons toutes nos données. Cette technologie de purification microfluidique des cellules permet une séparation efficace basée sur la taille grâce aux effets de focalisation inertielle différentielle des cellules et des nanoparticules dans un micro-dispositif en spirale.

Il peut traiter jusqu’à 10 millions de cellules par concentration de mil, ce qui est très utile pour la médecine régénérative, ainsi que pour le traitement du volume de cellules de verrouillage. Cette technologie est très recherchée pour le domaine de l’ingénierie cellulaire, qui utilise souvent des nanoparticules pour travailler les cellules, à des fins d’imagerie ou de contrôle de la fonction. Hui Min Tay, un assistant de recherche de mon laboratoire, ainsi que le docteur David Yeo, chercheur postdoctoral du laboratoire du professeur Xi, feront la démonstration de la procédure.

Cultivez des cellules souches mésenchymateuses à plus de 80 % de confluence sur une plaque à six puits avant de marquer les cellules avec les nanoparticules. De même, cultivez des cellules THP-1 à une densité d’un million de cellules par millilitre. Ensuite, dissolvez un milligramme de nanoparticules de silice avec un millilitre de solution de colorant calcique de deux cents micromolaires.

Et remuez les particules pendant la nuit. Fabriquez également des nanoparticules de calcium AM PLGA en utilisant les méthodes décrites dans la référence présentée ici. Mélangez soit un milligramme de nanoparticules de calcium AM PLGA, soit 150 microgrammes de nanoparticules de silice de calcium dans une solution de poly-l-lysine à 01 % dans l’eau en pipetant la solution de haut en bas pendant une minute.

Et puis laissez-le incuber à température ambiante pendant 15 à 20 minutes. Ensuite, centrifugez les nanoparticules. Retirez l’excès de surnageant de poly-l-lysine et remettez les nanoparticules en suspension dans un millilitre du milieu de culture approprié pour le type de cellule à étiqueter.

Ajoutez 1 milligramme de nanoparticules marquées à un millilitre de milieu pour chaque million de cellules en culture. Pipetez soigneusement le mélange de cellules, de nanoparticules et de milieu pendant une minute. Ensuite, incubez le mélange pendant environ 24 heures.

Une fois marquées, dissociez et récoltez les cellules souches, puis mettez-les à nouveau en suspension à une concentration comprise entre 100 000 et 1 000 000 de cellules par millilitre pour le traitement microfluidique. Utilisez des cellules THP-1 marquées à la même concentration. Afin de fabriquer le dispositif microfluidique en spirale, préparez d’abord un moule maître de plaquette de silicone à l’aide de techniques de microfabrication standard.

Ensuite, mélangez soigneusement 30 grammes du prépolymère PDMS de base et trois grammes d’un agent de durcissement dans un bateau de pesée. Dégazez le mélange sous vide pendant 60 minutes pour éliminer les bulles d’air. Versez le mélange PDMS sur le moule maître, avec le motif du canal en spirale, avec précaution jusqu’à une hauteur de cinq à 10 millimètres.

Ensuite, dégazez le mélange pendant 60 minutes pour éliminer les bulles d’air. Répétez ce processus jusqu’à ce que toutes les bulles soient éliminées. Ensuite, placez la plaquette dans un four et assurez-vous qu’elle n’est pas inclinée pendant le durcissement, afin d’assurer une hauteur constante de l’appareil.

Durcissez le PDMS à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Une fois refroidi, découpez le dispositif en spirale PDMS à l’aide d’un scalpel et décollez soigneusement la plaque PDMS du moule maître. Ensuite, utilisez un scalpel pour couper les bords de l’appareil afin d’assurer une surface lisse pour le collage.

Ensuite, utilisez un poinçon de biopsie de 1,5 millimètre pour créer deux trous pour les entrées et deux trous pour les sorties. Lavez l’appareil avec de l’isopropanol pour enlever tous les débris. Et séchez l’appareil dans un four à 80 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ensuite, utilisez du ruban adhésif pour nettoyer la surface inférieure de l’appareil PDMS et un côté d’une lame de verre. Placez avec précaution la lame de verre et le dispositif PDMS dans une chambre à plasma avec les surfaces propres exposées. Allumez la puissance du plasma au maximum, abaissez la pression de la chambre jusqu’à ce qu’elle devienne rose et exposez les composants pendant 60 secondes.

Ensuite, retirez la glissière et le dispositif PDMS de la chambre. Et liez-les ensemble en pressant fermement les surfaces exposées au plasma. Assurez-vous qu’aucune bulle n’est coincée entre les deux surfaces.

Chauffez l’appareil collé sur une plaque chauffante réglée à 80 degrés Celsius pendant deux heures pour renforcer le lien. Coupez deux morceaux de tube de 15 à 20 centimètres de long pour les entrées et fixez une aiguille de calibre 23 à une extrémité de chaque tube. Ensuite, coupez deux morceaux du même tube de cinq à 10 centimètres de long pour les sorties et fixez-les aux trous de sortie de l’appareil.

Avant de prélever l’échantillon, amorcez manuellement le dispositif avec une seringue contenant 70 % d’éthanol jusqu’à ce qu’il s’écoule du tube de sortie. Laissez l’éthanol reposer dans l’appareil pendant au moins 30 secondes pour le stériliser. Ensuite, chargez 30 millilitres de PBS filtré avec 1 % de BSA dans une seringue de 60 millilitres.

Chargez également trois millilitres de cellules marquées dans une seringue de trois millilitres et vérifiez qu’aucune bulle d’air n’est piégée dans l’une ou l’autre seringue. Éliminez toutes les bulles d’air en éjectant doucement quelques gouttes de liquide hors de la buse. Connectez les embouts et la tubulure d’entrée de la seringue aux seringues et fixez les seringues aux pousse-seringues.

Insérez les tubes dans leurs entrées respectives de l’appareil et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles le long du tube. Une fois la fluidique maintenant configurée, montez l’appareil sur un microscope à contraste de phase inversé pour une imagerie en temps réel pendant le processus de tri des cellules. Fixez un petit bécher de déchets et deux tubes de 15 millilitres à proximité de l’appareil sur la platine du microscope.

Placez le tube de sortie des deux sorties de l’appareil dans le bécher à déchets. Maintenant, réglez le rapport de débit entre l’échantillon et le tampon de gaine de un à 10 en réglant le débit de la seringue d’échantillon à 120 microlitres par minute et de la seringue à gaine à 1 200 microlitres par minute. Faites fonctionner l’appareil pendant une minute et demie pour donner au débit une chance de se stabiliser.

Utilisez une caméra à grande vitesse pour confirmer la présence de cellules focalisées inertiellement près de la paroi interne du canal en fond clair avec contraste de phase. Une fois que le débit à l’état stable est atteint et que l’appareil fonctionne correctement, positionnez les tubes de sortie dans différents flacons pour recueillir des éluants séparés à la sortie de la cellule et à la sortie des déchets. Ce dispositif est capable de trier correctement une suspension marquée de cellules monocytaires THP-1 à partir de nanoparticules de silice fluorescentes.

Des efficacités de séparation élevées ont été obtenues, comme l’ont confirmé l’imagerie à grande vitesse et l’analyse par cytométrie en flux. La stratégie de purification en une seule étape permet la récupération continue d’une suspension marquée et de cellules adhérentes qui sont en suspension dans une solution tampon fraîche sans avoir besoin de centrifugation. Le dispositif est capable d’une séparation à haute efficacité avec des nanoparticules de silice et de PLGA et peut séparer jusqu’à 10 millions de cellules par millilitre avec le même rendement élevé.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de marquer les cellules avec des nanoparticules. Et comment purifier les cellules marquées en éliminant l’excès de particules non liées à l’aide de notre dispositif microfluidique spécialisé.