Microfluidique Buffer Exchange pour sans interférence Micro / Nanoparticules ingénierie cellulaire

L'objectif général de cette procédure est de démontrer une technologie de purification microfluidique pratique, efficace et à haut débit, permettant de séparer les nanoparticules libres des cellules après l'ingénierie cellulaire à l'aide de ces nanoparticules. Le principal avantage de cette technologie réside dans sa capacité à éliminer rapidement et efficacement les nanoparticules non liées après la manipulation cellulaire. À la suite de cette étape, nous rassemblons l'ensemble de notre sé-fa-tion. Cette technologie de purification cellulaire microfluidique permet une séparation efficace fondée sur la taille, grâce aux effets différentiels de focalisation inertielle des cellules et des nanoparticules dans un dispositif microfluidique en spirale.

Il peut traiter jusqu'à 10 millions de cellules par concentration mil, ce qui est très utile pour la médecine régénérative, ainsi que pour le traitement des cellules en volume serré. Cette technologie est très recherchée dans le domaine de l'ingénierie cellulaire, qui utilise souvent des nanoparticules pour marquer les cellules, à des fins d'imagerie ou de contrôle fonctionnel. La procédure sera démontrée par Hui Min Tay, assistante de recherche de mon laboratoire, ainsi que par le docteur David Yeo, chercheur postdoctoral du laboratoire du professeur Xi.

Cultiver les cellules souches mésenchymateuses à plus de 80 % de confluence dans une plaque de six puits avant de marquer les cellules avec les nanoparticules. De même, cultiver les cellules THP-1 à une densité d'un million de cellules par millilitre. Ensuite, dissoudre un milligramme de nanoparticules de silice dans un millilitre de solution de colorant calcique à deux cents micromoles.

Et agiter les particules toute la nuit. En outre, préparer des nanoparticules de PLGA chargées en calcium AM selon les méthodes décrites dans la référence indiquée ici. Mélanger soit un milligramme de nanoparticules de PLGA chargées en calcium AM, soit 150 microgrammes de nanoparticules de calcium-silice, dans une solution aqueuse de poly-l-lysine à 0,1 % en aspirant et en expulsant la solution plusieurs fois pendant une minute à l’aide d’une pipette.

Puis laissez incuber à température ambiante pendant 15 à 20 minutes. Ensuite, centrifugez les nanoparticules. Éliminez le surnageant excédentaire de poly-L-lysine et remettez en suspension les nanoparticules dans un millilitre de milieu de culture approprié pour le type cellulaire à marquer.

Ajoutez 1 milligramme de nanoparticules marquées à un millilitre de milieu pour chaque million de cellules en culture. Pipetez soigneusement le mélange de cellules, de nanoparticules et de milieu pendant une minute. Incubez ensuite le mélange pendant environ 24 heures.

Une fois marquées, dissocier et récolter les cellules souches, puis les resuspendre à une concentration comprise entre 100 000 et 1 000 000 cellules par millilitre pour le traitement microfluidique. Utiliser les cellules THP-1 marquées à la même concentration. Afin de fabriquer le dispositif microfluidique en spirale, préparer d'abord un moule maître en silicone à l'aide de techniques standard de microfabrication.

Ensuite, mélanger soigneusement 30 grammes du prépolymère de base PDMS et trois grammes d'agent de réticulation dans un récipient de pesée. Débarrasser le mélange des bulles d'air en appliquant le vide pendant 60 minutes. Verser délicatement le mélange de PDMS sur le moule maître, gravé avec le motif de canal en spirale, jusqu'à une hauteur de cinq à dix millimètres.

Ensuite, dégazer une heure le mélange pour éliminer toutes les bulles d'air. Répéter cette opération jusqu'à disparition complète des bulles. Puis, placer la plaquette dans un four, en veillant à ce qu'elle ne soit pas inclinée pendant le durcissement, afin d'assurer une hauteur constante du dispositif.

Polymérisez le PDMS à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Une fois refroidi, découpez le dispositif en spirale en PDMS à l’aide d’un scalpel et décollez soigneusement la lame de PDMS du moule maître. Ensuite, utilisez un scalpel pour tailler les bords du dispositif afin d’obtenir une surface lisse propice au collage.

Ensuite, utilisez un punch à biopsie de 1,5 millimètre pour créer deux trous pour les entrées et deux trous pour les sorties. Lavez l'appareil avec de l'isopropanol pour éliminer tout débris. Puis faites sécher l'appareil dans une étuve à 80 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ensuite, utilisez du ruban-cache pour nettoyer la surface inférieure du dispositif en PDMS et un côté d'une lame de verre. Placez soigneusement la lame de verre et le dispositif en PDMS dans une chambre à plasma, avec les surfaces nettoyées exposées. Activez la puissance du plasma au maximum, abaissez la pression dans la chambre jusqu'à ce que celle-ci prenne une couleur rose, puis exposez les composants pendant 60 secondes.

Ensuite, retirez la lame et le dispositif en PDMS de la chambre. Puis, assemblez-les en appuyant fermement les surfaces exposées au plasma l'une contre l'autre. Veillez à ce qu'aucune bulle ne soit piégée entre les deux surfaces.

Chauffer l'appareil assemblé sur une plaque chauffante réglée à 80 degrés Celsius pendant deux heures afin de renforcer l'adhérence. Couper deux morceaux de tube de 15 à 20 centimètres de longueur pour les entrées, et fixer une aiguille de calibre 23 à une extrémité de chaque tube. Ensuite, couper deux morceaux du même tube mesurant cinq à dix centimètres de longueur pour les sorties, et les fixer aux orifices de sortie de l'appareil.

Avant de traiter l'échantillon, amorcez manuellement l'appareil à l'aide d'une seringue contenant de l'éthanol à 70 % jusqu'à ce qu'il s'écoule par le tube de sortie. Laissez l'éthanol en contact avec l'appareil pendant au moins 30 secondes afin de le stériliser. Ensuite, chargez 30 millilitres de PBS filtré contenant 1 % de BSA dans une seringue de 60 millilitres.

Aussi, chargez trois millilitres de cellules marquées dans une seringue de trois millilitres et vérifiez qu'aucune bulle d'air n'est piégée dans l'une ou l'autre seringue. Éliminez toute bulle d'air en éjectant doucement quelques gouttes de liquide par l'embout. Connectez les embouts d'entrée et les tubulures aux seringues et fixez fermement les seringues sur les pompes à seringue.

Insérez les tubes dans leurs entrées respectives du dispositif et assurez-vous qu'il n'y ait aucune bulle dans les tubulures. Une fois la configuration de la fluidique terminée, fixez le dispositif sur un microscope inversé à contraste de phase pour l'imagerie en temps réel pendant le tri cellulaire. Placez un petit bécher de récupération et deux tubes de 15 millilitres près du dispositif sur la platine du microscope.

Placer les tubulures de sortie provenant des deux sorties de l'appareil dans le bécher de déchets. Ensuite, régler le rapport de débit entre l'échantillon et le tampon d'enrobage à un contre dix en fixant le débit de la seringue d'échantillon à 120 microlitres par minute et celui de la seringue d'enrobage à 1 200 microlitres par minute. Faire fonctionner l'appareil pendant une minute et demie afin de permettre au débit de se stabiliser.

Utilisez une caméra haute vitesse pour confirmer la présence de cellules focalisées par inertie près de la paroi interne du canal en champ clair avec contraste de phase. Une fois l'écoulement en régime permanent atteint et le dispositif fonctionnant correctement, positionnez les tubes de sortie dans différents flacons afin de recueillir séparément les éluats provenant de la sortie cellulaire et de la sortie des déchets. Ce dispositif est capable de trier correctement une suspension marquée de cellules monocytaires THP-1 à partir de nanoparticules de silice fluorescentes.

De hautes efficacités de séparation ont été obtenues, comme le confirment l'imagerie à grande vitesse et l'analyse par cytométrie en flux. La stratégie de purification en une seule étape permet la récupération continue d'une suspension marquée et de cellules adhérentes qui sont mises en suspension dans une solution tampon fraîche, sans nécessiter de centrifugation. L'appareil est capable de séparer efficacement à la fois des nanoparticules de silice et de PLGA, et peut séparer jusqu'à 10 millions de cellules par millilitre avec la même haute efficacité.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment marquer des cellules avec des nanoparticules, ainsi que comment purifier les cellules marquées en éliminant les particules non liées en excès à l’aide de notre dispositif microfluidique spécialisé.