Une plate-forme microfluidique pour l'isolement à haut débit unique cellule et Culture

L'objectif général de ce protocole est de démontrer la fabrication et le fonctionnement d'une puce microfluidique, permettant une isolation et une culture efficaces de cellules uniques. Cette méthode constitue un outil utile pour tout domaine susceptible de tirer profit de l'isolement et de la culture de cellules uniques. Le principal avantage de cette technique réside dans son efficacité élevée pour charger des cellules individuelles dans des réseaux de micropuits de grande taille.

De plus, seul un écoulement doux et la force gravitationnelle sont utilisés pour faire fonctionner le dispositif, ce qui minimise les dommages cellulaires. L'application de cette technique vise le diagnostic final de maladies humaines telles que le cancer, dans lesquelles l'hétérogénéité cellulaire affecte la réponse de la cellule. Nous avons eu l'idée de développer cette méthode lors de la mise en place d'une lignée cellulaire en micropuits, car la méthode de dilution limitante était très longue et inefficace. Cette méthode permet désormais d'obtenir des informations sur l'analyse de cellules individuelles.

Il peut également être appliqué à d'autres applications, telles que la mise en place et la temporalité de l'observation du parcours et du comportement de cellules individuelles. Pour commencer, fabriquez des moules-maîtres silanisés pour la couche d'isolement de cellules uniques et la couche de culture en micropuits, en utilisant la photolithographie standard décrite dans le protocole textuel accompagnant. Pour chaque moule-maître, mélangez 16 grammes de base de PDMS avec 1,6 gramme d'agent de réticulation dans un gobelet jetable, et remuez les mélanges jusqu'à homogénéité.

Ensuite, placer les moules principaux dans des boîtes de Pétri de 150 millimètres et verser le PDMS sur les moules. Placer les boîtes de Pétri dans un dessiccateur et appliquer un vide pendant une heure pour éliminer les bulles d'air du PDMS. Après une heure, retirer les boîtes du dessiccateur et les placer dans un four conventionnel à 65 degrés Celsius pendant trois à six heures afin de polymériser le PDMS.

Ensuite, retirez les boîtes du four et laissez-les refroidir à température ambiante. Une fois refroidies, décollez le réseau de puits de capture en PDMS durci et le réseau de culture en micropuits des moules maîtres, puis découpez les dispositifs à l’aide d’une lame de rasoir. Ensuite, utilisez un poinçon de 0,75 millimètre pour créer un trou à chaque extrémité du microcanal sur la couche du réseau de puits de capture.

Utilisez du ruban adhésif pour nettoyer la surface qui deviendra la face interne du dispositif, puis placez les couches individuelles, face interne vers le haut, dans un nettoyeur à plasma pour un traitement bref au plasma d'oxygène. Une fois terminé, retirez les couches de PDMS du nettoyeur à plasma et utilisez un microscope stéréo pour aligner et assembler les couches supérieure et inférieure du dispositif. Placez le dispositif aligné dans un four à 65 degrés Celsius pendant 24 heures afin de créer une liaison permanente entre les couches de PDMS.

Ensuite, placez le dispositif en PDMS lié dans de l'eau déionisée et mettez le récipient dans un dessiccateur sous vide pendant 15 minutes, afin d'éliminer l'air du microcanal du dispositif. Une fois tout l'air éliminé du dispositif, placez le dispositif en PDMS dans une hotte de culture tissulaire et utilisez une lumière UV pour stériliser la surface du dispositif pendant 30 minutes. Ensuite, remplacez l'eau déionisée dans le dispositif par de l'albumine sérique bovine à 5 % dans du PBS et incubez le dispositif à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Cela bloquera la surface et améliorera l'efficacité de transfert des cellules isolées des puits de capture vers les puits de culture. Après 30 minutes, remplacez la solution de blocage dans le dispositif par du PBS stérile. Préparez une suspension monocellulaire contenant 2,5 millions de cellules par millilitre et chargez une pipette avec 50 microlitres de la suspension.

Ensuite, transférez les cellules dans le dispositif par le trou de sortie du dispositif. Chargez 50 microlitres supplémentaires de la suspension cellulaire et transférez-les dans le dispositif par le trou d'entrée afin de remplir uniformément tout le microcanal avec les cellules. Une fois chargé, utilisez un bouchon stérile fabriqué à partir d'un fil de pêche en nylon de un millimètre de diamètre pour sceller le trou de sortie du dispositif.

Ensuite, remplir une seringue stérile d'un millilitre avec le milieu de culture, expulser toutes les bulles d'air résiduelles et insérer la seringue dans la pompe à seringue. Relier une aiguille émoussée de calibre 23 à la seringue et utiliser un tube en tétrafluoroéthylène polymérisé pour relier l'aiguille à l'orifice d'entrée du dispositif. Après avoir raccordé le tube, retirer le bouchon du trou de sortie et attendre deux minutes afin que les cellules s'installent dans les puits de capture individuelle sous l'effet de la force gravitationnelle.

Ensuite, régler la pompe à seringue à 600 microlitres par minute. Retirer le bouchon de sortie et éliminer les cellules non capturées pendant 30 secondes. Attendre deux minutes pour que la pression se stabilise.

Ensuite, retirez le tube de l'entrée du dispositif et obturez les orifices d'entrée et de sortie avec des bouchons afin de former un système de culture fermé. Retournez maintenant manuellement le dispositif pour transférer les cellules uniques capturées vers les micropuits de culture situés de l'autre côté du dispositif. Puis, placez le dispositif dans une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres, ajoutez 10 millilitres de PBS stérilisé autour du dispositif, et placez la boîte dans une étuve.

Pour remplacer le milieu de culture, placez d'abord deux gouttes de milieu de culture sur le dispositif en PDMS près de l'entrée et de la sortie afin d'éviter d'introduire des bulles d'air dans le microcanal. Ensuite, utilisez un poinçon à biopsie de 0,75 millimètre pour percer deux trous depuis le haut du dispositif en PDMS, près des extrémités du microcanal. Veillez à ne percer que la couche supérieure du dispositif.

Ensuite, remplissez une seringue en plastique de un millilitre contenant un milieu frais préalablement réchauffé, puis utilisez une aiguille émoussée de calibre 23 et un tube en PTFE pour la relier au nouveau port d'entrée. Faites circuler lentement environ 120 microlitres de milieu frais dans le dispositif pendant cinq minutes afin de remplacer l'ancien milieu. Une fois terminé, obturez les ports d'entrée et de sortie à l’aide de deux bouchons, puis remettez le dispositif dans l’incubateur de culture cellulaire.

Le nombre de cellules qui se retrouvent dans les puits de capture varie entre environ 68 % et 85 %, selon le type de cellule. De plus, la majorité des puits de capture contiennent une seule cellule, et ce pour les trois types cellulaires. Après le transfert des cellules KT98 capturées vers les puits de culture, environ 77 % des puits contenaient une seule cellule, 16 % n'avaient aucune cellule, 6 % contenaient deux cellules, et moins de 1 % des puits avaient trois cellules ou plus.

Au cours de sept jours, les cellules isolées individuellement ont présenté des profils de croissance hétérogènes. Alors que certaines cellules se sont multipliées, d'autres ne l'ont pas fait. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 20 minutes si elle est effectuée correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser cette plateforme de culture endocrinienne à isolation de cellules uniques à haut débit pour améliorer la productivité de vos expériences sur cellules uniques. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à éviter l'entrée de bulles d'air dans le microcanal et à empêcher les cellules de s'agréger au fil du temps.