Name: Une plate-forme microfluidique pour lisolement à haut débit unique cellule et Culture (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Découvrez une plateforme microfluidique pour l'isolement et la culture de cellules uniques à haut débit. Cette méthode utilise un flux doux et la gravité pour minimiser les dommages cellulaires et améliorer l'efficacité.

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Ce travail a été soutenu par une subvention des Instituts nationaux de recherche en santé (03-A1 BNMP11-014).

Remarque: Les modèles de photomasques pour notre fabrication de dispositif microfluidique ont été établis à l&#39;aide d&#39;un ordinateur de conception assistée (CAO). Les dessins ont ensuite été utilisés pour fabriquer des photomasques chrome en utilisant un service commercial. Les dispositifs PDMS ont été réalisés en utilisant des techniques de lithographie douce 11. 1. Fabrication de Maître Moisissures par Lithography <ol><li> Avant le processus de photolithographie 12, en utilisant les pastilles de silicium de 4 pouces en tant que substrat et déshydrater les pastilles dans un four conventionnel à 120 ° C pendant 10 min. </li><li> Nettoyer les plaquettes de silicium déshydratées en utilisant un traitement par plasma d&#39;oxygène à 100 watts pendant 30 secondes dans un filtre à plasma. </li><li> Préchauffer deux plaques de cuisson à 65 ° C et 95 ° C, respectivement, pour le processus de cuisson suivant. </li><li> Coat 5 g de résine photosensible négative (PR) sur les tranches de silicium nettoyées par une tournette; centrifuger à 1200 tours par minute (SU-8 50) pendant 30 secondes pour produire la couche de microcanaux. </li><li> Placer le RPplaquette revêtue sur une plaque de cuisson préchauffé à 65 ° C pendant 12 min et le transférer à une autre plaque de cuisson préchauffé à 95 ° C pendant 33 min (pour 100 um d&#39;épaisseur des modèles) pour effectuer un processus de cuisson douce. </li><li> Après la cuisson, placez le PR enduit plaquette de silicium sur le support d&#39;un masque d&#39;alignement semi-automatique et l&#39;aligner à une transparence photomasque 25400 dpi de résolution. </li><li> Exposer le PR revêtu de plaquette de silicium à la lumière UV (365 nm) à une dose de 500 mJ / cm2 pour créer le motif de la PR sur la plaquette de silicium. </li><li> Retirer la plaquette de l&#39;alignement et le placer sur une plaque chauffante pour la post-cuisson à 95 ° C pendant 12 min. </li><li> Faire tremper les tranches de SU-8 développeur (acétate d&#39;éther monométhylique du propylène glycol, PGMEA) solution pour laver PR non réticulés pendant 12 min et doucement à sec avec de l&#39;azote gazeux pour exposer les marques d&#39;alignement. </li><li> Encore une fois, le manteau 5 g de résine photosensible négative sur les tranches par une tournette; centrifuger à 700 tours par minute (SU-8 100) pendant 30 secondes et 1 200 tours par minute (SU-8 10) pendant 30 s à 300 &amp;# 181; m motif d&#39;épaisseur et 27 um d&#39;épaisseur modèle respectivement pour rendre la couche de micropuits. </li><li> Placez la tranche revêtue PR sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 4 minutes et à 95 ° C pendant 8 min (pour 27 um couche de capture-puits profond); et à 65 ° C pendant 40 min et à 95 ° C pendant 110 min (pour 300 um couche culture-puits profond). </li><li> Après refroidissement, placer le PR revêtu plaquette de silicium sur le masque d&#39;alignement équipé d&#39;une lumière UV. </li><li> Exposer le PR enduit plaquette de silicium à la lumière UV (365 nm) à une dose de 250 mJ / cm 2 (27 um d&#39; épaisseur modèle) et 700 mJ / cm 2 (pour 300 um d&#39; épaisseur motif). </li><li> Cuire les tranches à 95 ° C pendant 5 min (27 um de motif d&#39;épaisseur) et 30 min (300 um d&#39;épaisseur motif), respectivement. </li><li> Laver le PR non réticulé par le PGMEA pendant 6 min (27 um de motif d&#39;épaisseur) et 25 min (300 um d&#39;épaisseur motif), respectivement, puis les sécher avec de l&#39;azote gazeux. </li><li> Mesurer la hauteur du modèle figure surla tranche avec un profilomètre laser de balayage en plaçant la tranche sur la platine XY d&#39;un profilomètre laser de balayage. <ol><li> Ajuster le plan focal pour montrer clairement le modèle figure sur la plaquette en utilisant le &quot;vue de la caméra&quot; mode d&#39;observation sous un objectif 20X. </li><li> Changez le mode d&#39;observation de la &quot;vue de la caméra&quot; à &quot;vue laser&quot;, et définir les positions supérieures et inférieures des caractéristiques. </li><li> Réglez le mode de mesure, la zone, la qualité et z-hauteur jusqu&#39;à transparent (en haut), 1 ligne (1,024 x 1), de haute précision et 0,5 um, respectivement, puis appuyez sur le bas de départ pour commencer la mesure. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des dispositifs PDMS pour l&#39;isolement cellulaire unique <ol><li> Avant PDMS coulée, silaniser les moules de maître avec trichlorosilane pour créer une surface hydrophobe, ce qui le rend plus facile à décoller les PDMS répliques des moules maîtres. <ol><li> Placer les moules de maître et un bateau de pondération contenant200 pi de trichlorosilane dans un dessiccateur, et appliquer le vide (-85 kPa) pendant 15 min. </li><li> Arrêtez le vide, puis laisser les moules maîtres dans le dessiccateur à silaniser les moules maîtres à la température ambiante pendant au moins 1 h. </li><li> Retirer les moules de maître du dessiccateur et placer chaque moule maître dans un plat de 10 cm de Pétri. </li></ol></li><li> Mélanger une quantité totale de kit de polymère PDMS 17,6 g contenant une base et un agent de durcissement à un ratio de 10: 1, puis verser le PDMS sur le moule maître dans la boîte de Pétri. </li><li> Placez la boîte de Petri dans un dessiccateur et appliquer le vide (-85 kPa) pendant 1 heure pour éliminer les bulles d&#39;air dans les PDMS. </li><li> Retirer la boîte de Pétri du dessiccateur et le placer dans un four conventionnel à 65 ° C pendant 3-6 heures pour guérir les PDMS. </li><li> Retirer les répliques PDMS guéri des moules maîtres et de punch deux trous comme une entrée et une sortie aux deux extrémités du microcanal sur la matrice PDMS réplique de capture-bien par un perforateur avec diamètre intérieur de 0.75 mm pour le canal fluidique (figure 2A). </li><li> Utilisez du ruban adhésif pour nettoyer la surface des répliques PDMS, puis placer les répliques PDMS dans un nettoyeur à plasma pour un bref traitement par plasma d&#39;oxygène (100 watts pour 14 sec). </li><li> Retirer les répliques PDMS de la machine à plasma d&#39;oxygène. </li><li> Alignez un sommet (contenant les micropuits de capture) et un PDMS de fond (contenant les micropuits de culture) réplique à la main sous un stéréomicroscope et les mettre en contact. </li><li> Placez les PDMS répliques alignés dans un four à 65 ° C pendant 24 heures pour obtenir une liaison permanente entre les PDMS répliques pour former le dispositif final. </li><li> Faire tremper le dispositif PDMS dans un désionisée (DI) récipient rempli -eau et placez le récipient dans un dessiccateur sous vide (-85 kPa) pendant 15 minutes pour éliminer l&#39;air du microcanaux du dispositif PDMS. </li><li> Placer le dispositif de PDMS rempli d&#39;eau DI dans une hotte de culture tissulaire et en utilisant une lumière UV (longueur d&#39;onde de la lumière: 254 nm) pour la stérilisation du dispositif de 30 min. </li><li> Remplacer l&#39;eau DI dans le dispositif de PDMS avec une albumine de sérum bovin à 5% (BSA) dans une solution 1 x PBS et on incube à 37 ° C pendant 30 min pour empêcher les cellules de se coller à la surface du PDMS. Remarque: Le revêtement BSA est essentiel pour améliorer l&#39;efficacité du transfert de cellules isolées de la capture-bien à la culture puits. </li><li> Remplacer la solution de BSA à 5% dans le dispositif PDMS avec stérilisée solution PBS 1x. </li></ol> 3. Préparation de la suspension unicellulaire <ol><li> Culture de souches neurales KT98 des cellules et un carcinome humain cellules A549 et MDA-MB-435 nous en boîte de Petri dans l&#39; incubateur de culture cellulaire classique (37 ° C, 5% CO 2 et 95% d&#39; humidité) pour préparer des cellules pour l&#39;essai de cellules de dispositif PDMS . </li><li> Retirer et jeter le milieu de culture usé (milieu de base DMEM fourni avec 10% de sérum de veau fœtal et 1% des antibiotiques) à partir de la boîte de culture avec des cellules cultivées à 70 - 80% de confluence. </li><li> Lavez délicatement les cellules avec stérilisées PBS trois fois. &lt;/ Li&gt; <li> Retirer et jeter le PBS, et ajouter 2 ml d&#39;un mélange d&#39;enzyme recombinante avec protéolytiques, et les activités de DNase collagénolytique (s&#39;il vous plaît voir la liste des matériaux pour les informations détaillées). </li><li> Incuber la boîte de culture à la température ambiante pendant 5 min, puis appuyez sur la boîte de culture pour faciliter le détachement des cellules. </li><li> Ajouter 4 ml de PBS stérile pour disperser les cellules, puis transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 15 ml. </li><li> Centrifuger le tube à 300 g pendant 3 min et retirer le surnageant. </li><li> Resuspendre doucement le culot cellulaire dans 1 ml stérilisées PBS et compter le nombre de cellules vivantes en utilisant la méthode d&#39;exclusion au bleu Trypan norme 13. Remarque: Cette étape de remise en suspension est critique pour la préparation bien dissociées suspension à cellule unique pour améliorer l&#39;efficacité de l&#39;isolement de cellules isolées. </li></ol> 4. Isolation simple cellule et Culture clonale <ol><li> Charge 50 pi de suspension cellulaire à une concentration de 2,2 à 2,5 x10 <sup&gt; 6 cellules / ml dans le micro - canal du dispositif de PDMS par l&#39; intermédiaire du trou de sortie de l&#39;appareil avec une pipette à main. Remarque: Le chargement pipette de suspension cellulaire doit être arrêté et maintenu à la première position d&#39;arrêt afin d&#39;éviter l&#39;introduction de bulles d&#39;air dans le microcanal. </li><li> Chargez encore 50 pl de suspension cellulaire à travers le trou d&#39;entrée pour remplir uniformément jusqu&#39;à l&#39;ensemble microcanaux avec des cellules. </li><li> Sceller le trou de sortie d&#39;un bouchon (une ligne de 3 mm de long, 1 mm de diamètre en nylon coupe pêche) afin d&#39;éviter l&#39;écoulement induit par la pression hydrostatique des gouttelettes sur entrée et de sortie des trous. Remarque: Les bouchons ont été stérilisée par UV à l&#39;intérieur d&#39;une culture hotte de tissu avant utilisation. </li><li> Remplir une seringue stérile de 1 ml de milieu de culture, éjecter les bulles d&#39;air, et le mettre en place sur une pompe à seringue. </li><li> Branchez le moyen chargé seringue à l&#39;orifice d&#39;entrée du dispositif PDMS via une aiguille émoussée G 23 et une poly-tétrafluoroéthène (PTFE) tube. </li><li> Retirer le bouchon du trou de sortie et toutow un intervalle de temps de 2 minutes pour permettre aux cellules de se déposer dans les unicellulaires capture des puits par la force gravitationnelle. </li><li> Laver les cellules avec 300 pl non captées de milieu de culture à une vitesse de 600 pi / min entraîné par la pompe de la seringue d&#39;écoulement. </li><li> Attendre pendant 2 minutes afin de stabiliser l&#39;appareil, et sceller les orifices d&#39;entrée et de sortie avec des bouchons pour former un système de culture fermé. </li><li> Retournez le périphérique à la main pour transférer les cellules mono-capturées dans les puits de culture. </li><li> Placez le dispositif PDMS dans une boîte de culture de tissu de 100 mm, et ajouter 10 ml de PBS stérilisé autour du dispositif pour éviter le milieu de culture évaporation de la microcanaux. </li><li> Déplacer la boîte de culture à un incubateur classique de culture cellulaire (37 ° C, 5% CO 2 et 95% d&#39; humidité) pour la culture clonale des cellules unique. </li></ol> 5. Culture moyenne reconstitution <ol><li> Après 1 d de la culture, remplacer le milieu de culture dans le dispositif PDMS avec du milieu frais pour améliorer pr cellulaireoliferation. </li><li> Placer deux gouttes de milieu de culture au-dessus du dispositif PDMS à proximité des zones d&#39;entrée et de sortie des trous pour éviter l&#39;introduction de bulles d&#39;air dans le micro-canal tout en effectuant l&#39;étape suivante. </li><li> Poinçonner deux trous de la partie supérieure du dispositif PDMS à proximité des deux extrémités du microcanal comme une entrée et une sortie pour le microcanal. Note: Ne pas perforer la totalité des deux couches du dispositif de PDMS; à la place, il suffit de percer à travers la couche supérieure du PDMS. </li><li> Connecter une seringue en plastique de 1 ml contenant du milieu frais à l&#39;entrée par l&#39;intermédiaire d&#39;une aiguille émoussée G 23 et PTFE tube. </li><li> Débit moyen 120 pi frais dans l&#39;appareil pendant 5 minutes pour remplacer l&#39;ancien milieu. </li><li> Insérez deux bouchons pour sceller l&#39;entrée et de sortie des trous, et renvoyer l&#39;appareil à l&#39;incubateur de culture cellulaire. </li><li> Rafraîchir le milieu de culture tous les 2 j au cours de la période de culture en enlevant les bouchons d&#39;étanchéité, puis en répétant les étapes 05/04 à 05/05. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Systèmes de dispositifs à base de micropuits-6,14 ont été utilisés pour la manipulation de cellules isolées et de l&#39; analyse, comme à grande échelle cellule unique piégeage 6 et souches hématopoïétiques seule la prolifération des cellules 15. Bien que la taille bien, le nombre et la forme peut être ajustée pour des applications spécifiques, l&#39;efficacité de l&#39; isolement à cellule unique est toujours compromise lorsque la taille du puits est augmentée. 9,15 <p cl...

À l&#39;heure actuelle plaçant des cellules isolées individuellement dans un espace de culture est généralement réalisée en utilisant une dilution limitante ou une cellule activé par fluorescence (FACS). Pour de nombreux laboratoires, ce qui limite la dilution est une méthode commode, car il nécessite seulement une pipette et des plaques de culture de tissus, qui sont facilement disponibles. Dans ce cas, la suspension cellulaire est diluée en série jusqu&#39;à une densité cellulaire appropriée, et ensuite placée dans des puits de culture à l&#39;aide d&#39;une pipette manuelle. Ces cellules isolées compartimentés sont ensuite utilisés pour l&#39; analyse de cellules, telles que l&#39; hétérogénéité génétique de dépistage 1 et 2 , la formation de colonies. Cependant, cette méthode est faible débit et la main-d&#39;œuvre, sans avoir recours à un bras de robot d&#39;assistance, car la nature de la distribution de Poisson de la méthode de dilution limitante limite d&#39; événements monocellulaires à une probabilité maximale de 37% 3. machines FACS avec un bras robotisé intégré peuvent surmonter la limitation de la distribution de Poisson par précision placment une seule cellule dans une culture bien à un moment 4. Cependant, la contrainte de cisaillement mécanique élevée (ainsi, réduit la viabilité cellulaire) 5 et à l&#39; achat des machines et les coûts opérationnels ont limité son utilisation dans de nombreux laboratoires. Pour surmonter les limitations ci - dessus, les dispositifs micrométriques ont été développés pour charger très efficacement des cellules individuelles dans des micropuits 6. Cependant, les micropuits ne fournissent pas suffisamment d&#39;espace pour les cellules chargées de proliférer, en raison de la nécessité de rendre la taille de chaque micro-puits proche de celle d&#39;une cellule unique pour maximiser la probabilité de chargement unicellulaire. Que des analyses de culture sont nécessaires dans de nombreuses applications basées sur des cellules (par exemple, le dosage clonogénique 7), les grands micropuits (90-650 um de diamètre ou une longueur latérale) ont également été utilisées pour permettre les cultures cellulaires étendus. Cependant, comme la méthode de dilution limite, ils possèdent également de faibles rendements cellule de chargement unique, allant de 10 -. 30% 89 Auparavant, nous avons développé une plate - forme microfluidique à haut débit pour isoler des cellules uniques dans des micropuits individuels et démontrer son application dans le dosage clonogénique des cellules isolées. 10 Le dispositif a été fait avec poly-diméthylsiloxane (PDMS), et comprend deux ensembles de réseaux de micropuits avec différentes tailles de micropuits, qui peut largement améliorer l&#39;efficacité dans le chargement d&#39;une seule cellule dans un micropuits dont la taille est beaucoup plus importante que la cellule. En particulier, ce concept de «double puits» permet à la taille de la zone de culture pour être ajustée de manière flexible sans affecter l&#39;efficacité de capture de cellule unique, ce qui rend facile d&#39;ajuster la conception du dispositif en fonction de différents types de cellules et d&#39;applications. Cette méthode à haut rendement devrait être utile pour des expériences de culture cellulaire à long terme pour les études d&#39;hétérogénéité cellulaire et monoclonal établissement de la lignée cellulaire.

<table><tbody><tr><td>Logiciel AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>Réf. 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>Plaquette de silicium</td><td>Eltech corperation</td><td>SPE0039</td><td></td></tr><tr><td>Four conventionnel</td><td>YEONG-SHIN company</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>Système de traitement au plasma de paillasse</td></tr><tr><td>SU-8 50 photorésine négative</td><td>MicroChem</td><td>Y131269</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 100 photorésine négative</td><td>MicroChem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Synrex Co., Ltée.</td><td>SC-HMI 2 » ~ 6"</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>YOTEC company</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Aligneur Msak</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 développeur</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td> Profilomètre laser à balayage en <td>acétate de propylène glycol</td></tr><tr><td></td><td>monométhyl ether KEYENCE</td><td>VK-X 100</td><td></td></tr><tr><td>Trichlorosilane</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridécafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyle. Hasardeux. Corrosif pour les voies respiratoires, réagit violemment avec l’eau.</td></tr><tr><td>Dessiccateur</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>Dessiccateur sous vide peu encombrant 190&nbsp ; mm base blanche</td></tr><tr><td>Polydiméthylsiloxane (PDMS) kit</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core puncher</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15072</td><td>avec diamètre intérieur de 0,75 mm</td></tr><tr><td>Bande amovible</td><td>3M Company</td><td>Scotch Removable Tape 811</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Technologie Bersing</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM milieu basal</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Hyclone</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotiques</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>Glutamine-Pénicilline-Streptomycine</td></tr><tr><td>Mélange d’enzymes recombinantes</td><td>Technologie cellulaire innovante</td><td>AM-105</td><td></td></tr><tr><td>Colorant membranaire cellulaire Accumax DiIC12(3)</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>Utilisé comme traqueur de cellules</td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>Appareil de Harvard</td><td>703007</td><td></td></tr><tr><td>Plastique seringue (1 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>aiguilles émoussées de calibre 23</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>Tube en</td> polytétrafluoroéthylène (PTFE) TD21 <td></td></tr><tr><td></td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TFT-23T</td><td>diamètre intérieur, 0,51 &nbsp ; mm; diamètre extérieur, 0,82 mm</td></tr></tbody></table>

une plate-forme microfluidique pour l&#39;isolement à haut débit unique cellule et culture

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

L’étude de l’hétérogénéité des cellules uniques est cruciale pour de nombreuses questions biologiques, mais elle est techniquement difficile. Il est donc nécessaire de disposer d’une méthode simple, mais à haut débit, pour réaliser des expériences de culture sur cellule unique. Ici, nous rapportons une stratégie basée sur une puce microfluidique pour l’isolement de cellules uniques à haut rendement (~77 %) et démontrons sa capacité à effectuer une culture de cellules uniques à long terme (jusqu’à 7 jours) et une analyse de l’hétérogénéité cellulaire à l’aide d’un test clonogénique. Ces applications ont été démontrées avec des cellules souches neurales de souris KT98 et des cellules cancéreuses humaines A549 et MDA-MB-435. Une efficacité élevée d’isolement de cellule unique et une capacité de culture à long terme sont obtenues en utilisant différentes tailles de micropuits en haut et en bas du canal microfluidique. Le petit réseau de micropuits est conçu pour isoler avec précision les cellules uniques, et le grand réseau de micropuits est utilisé pour la culture clonale d’une seule cellule dans la puce microfluidique. Cette plateforme microfluidique constitue une approche attrayante pour les applications de culture unicellulaire, en raison de sa flexibilité d’espaces de culture cellulaire réglables pour différentes stratégies de culture, sans diminuer l’efficacité de l’isolation.

La plate - forme microfluidique pour l&#39; isolement et la culture de cellules isolées comprend un micro - canal (200 um de hauteur) avec deux ensembles de matrices de micro - puits (figure 2A). Les deux ensembles de réseaux de micropuits sont appelés comme la capture de puits (25 m de diamètre et 27 um de profondeur) et de la culture puits (285 m de diamètre et de 300 um de profondeur) pour l&#39;isolement de cellules isolées et de la culture, respectivement, et chaque...

Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement et la culture de cellules uniques avec une plateforme microfluidique, qui utilise un nouveau concept de conception de micropuits pour permettre l’isolement de cellules uniques à haute efficacité et la culture clonale à long terme.

Une plate-forme microfluidique pour l&#39;isolement à haut débit unique cellule et Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

L'objectif général de ce protocole est de démontrer la fabrication et le fonctionnement d'une puce microfluidique, permettant une isolation et une culture efficaces de cellules uniques. Cette méthode constitue un outil utile pour tout domaine susceptible de tirer profit de l'isolement et de la culture de cellules uniques. Le principal avantage de cette technique réside dans son efficacité élevée pour charger des cellules individuelles dans des réseaux de micropuits de grande taille.De plus, seul un écoulement doux et la force gravitationnelle sont utilisés pour faire fonctionner le dispositif, ce qui minimise les dommages cellulaires. L'application de cette technique vise le diagnostic final de maladies humaines telles que le cancer, dans lesquelles l'hétérogénéité cellulaire affecte la réponse de la cellule. Nous avons eu l'idée de développer cette méthode lors de la mise en place d'une lignée cellulaire en micropuits, car la méthode de dilution limitante était très longue et inefficace. Cette méthode permet désormais d'obtenir des informations sur l'analyse de cellules individuelles.Il peut également être appliqué à d'autres applications, telles que la mise en place et la temporalité de l'observation du parcours et du comportement de cellules individuelles. Pour commencer, fabriquez des moules-maîtres silanisés pour la couche d'isolement de cellules uniques et la couche de culture en micropuits, en utilisant la photolithographie standard décrite dans le protocole textuel accompagnant. Pour chaque moule-maître, mélangez 16 grammes de base de PDMS avec 1,6 gramme d'agent de réticulation dans un gobelet jetable, et remuez les mélanges jusqu'à homogénéité.Ensuite, placer les moules principaux dans des boîtes de Pétri de 150 millimètres et verser le PDMS sur les moules. Placer les boîtes de Pétri dans un dessiccateur et appliquer un vide pendant une heure pour éliminer les bulles d'air du PDMS. Après une heure, retirer les boîtes du dessiccateur et les placer dans un four conventionnel à 65 degrés Celsius pendant trois à six heures afin de polymériser le PDMS.Ensuite, retirez les boîtes du four et laissez-les refroidir à température ambiante. Une fois refroidies, décollez le réseau de puits de capture en PDMS durci et le réseau de culture en micropuits des moules maîtres, puis découpez les dispositifs à l’aide d’une lame de rasoir. Ensuite, utilisez un poinçon de 0,75 millimètre pour créer un trou à chaque extrémité du microcanal sur la couche du réseau de puits de capture.Utilisez du ruban adhésif pour nettoyer la surface qui deviendra la face interne du dispositif, puis placez les couches individuelles, face interne vers le haut, dans un nettoyeur à plasma pour un traitement bref au plasma d'oxygène. Une fois terminé, retirez les couches de PDMS du nettoyeur à plasma et utilisez un microscope stéréo pour aligner et assembler les couches supérieure et inférieure du dispositif. Placez le dispositif aligné dans un four à 65 degrés Celsius pendant 24 heures afin de créer une liaison permanente entre les couches de PDMS.Ensuite, placez le dispositif en PDMS lié dans de l'eau déionisée et mettez le récipient dans un dessiccateur sous vide pendant 15 minutes, afin d'éliminer l'air du microcanal du dispositif. Une fois tout l'air éliminé du dispositif, placez le dispositif en PDMS dans une hotte de culture tissulaire et utilisez une lumière UV pour stériliser la surface du dispositif pendant 30 minutes. Ensuite, remplacez l'eau déionisée dans le dispositif par de l'albumine sérique bovine à 5 % dans du PBS et incubez le dispositif à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Cela bloquera la surface et améliorera l'efficacité de transfert des cellules isolées des puits de capture vers les puits de culture. Après 30 minutes, remplacez la solution de blocage dans le dispositif par du PBS stérile. Préparez une suspension monocellulaire contenant 2,5 millions de cellules par millilitre et chargez une pipette avec 50 microlitres de la suspension.Ensuite, transférez les cellules dans le dispositif par le trou de sortie du dispositif. Chargez 50 microlitres supplémentaires de la suspension cellulaire et transférez-les dans le dispositif par le trou d'entrée afin de remplir uniformément tout le microcanal avec les cellules. Une fois chargé, utilisez un bouchon stérile fabriqué à partir d'un fil de pêche en nylon de un millimètre de diamètre pour sceller le trou de sortie du dispositif.Ensuite, remplir une seringue stérile d'un millilitre avec le milieu de culture, expulser toutes les bulles d'air résiduelles et insérer la seringue dans la pompe à seringue. Relier une aiguille émoussée de calibre 23 à la seringue et utiliser un tube en tétrafluoroéthylène polymérisé pour relier l'aiguille à l'orifice d'entrée du dispositif. Après avoir raccordé le tube, retirer le bouchon du trou de sortie et attendre deux minutes afin que les cellules s'installent dans les puits de capture individuelle sous l'effet de la force gravitationnelle.Ensuite, régler la pompe à seringue à 600 microlitres par minute. Retirer le bouchon de sortie et éliminer les cellules non capturées pendant 30 secondes. Attendre deux minutes pour que la pression se stabilise.Ensuite, retirez le tube de l'entrée du dispositif et obturez les orifices d'entrée et de sortie avec des bouchons afin de former un système de culture fermé. Retournez maintenant manuellement le dispositif pour transférer les cellules uniques capturées vers les micropuits de culture situés de l'autre côté du dispositif. Puis, placez le dispositif dans une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres, ajoutez 10 millilitres de PBS stérilisé autour du dispositif, et placez la boîte dans une étuve.Pour remplacer le milieu de culture, placez d'abord deux gouttes de milieu de culture sur le dispositif en PDMS près de l'entrée et de la sortie afin d'éviter d'introduire des bulles d'air dans le microcanal. Ensuite, utilisez un poinçon à biopsie de 0,75 millimètre pour percer deux trous depuis le haut du dispositif en PDMS, près des extrémités du microcanal. Veillez à ne percer que la couche supérieure du dispositif.Ensuite, remplissez une seringue en plastique de un millilitre contenant un milieu frais préalablement réchauffé, puis utilisez une aiguille émoussée de calibre 23 et un tube en PTFE pour la relier au nouveau port d'entrée. Faites circuler lentement environ 120 microlitres de milieu frais dans le dispositif pendant cinq minutes afin de remplacer l'ancien milieu. Une fois terminé, obturez les ports d'entrée et de sortie à l’aide de deux bouchons, puis remettez le dispositif dans l’incubateur de culture cellulaire.Le nombre de cellules qui se retrouvent dans les puits de capture varie entre environ 68 % et 85 %, selon le type de cellule. De plus, la majorité des puits de capture contiennent une seule cellule, et ce pour les trois types cellulaires. Après le transfert des cellules KT98 capturées vers les puits de culture, environ 77 % des puits contenaient une seule cellule, 16 % n'avaient aucune cellule, 6 % contenaient deux cellules, et moins de 1 % des puits avaient trois cellules ou plus.Au cours de sept jours, les cellules isolées individuellement ont présenté des profils de croissance hétérogènes. Alors que certaines cellules se sont multipliées, d'autres ne l'ont pas fait. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 20 minutes si elle est effectuée correctement.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser cette plateforme de culture endocrinienne à isolation de cellules uniques à haut débit pour améliorer la productivité de vos expériences sur cellules uniques. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à éviter l'entrée de bulles d'air dans le microcanal et à empêcher les cellules de s'agréger au fil du temps.

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