Une plate-forme microfluidique pour l'isolement à haut débit unique cellule et Culture

L’objectif global de ce protocole est de démontrer la fabrication et le fonctionnement d’une puce microfluidique, qui permet l’isolement et la culture de cellules uniques à haut rendement. Cette méthode constitue un outil utile pour toute zone qui bénéficierait de l’isolement et de la culture de cellules uniques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est très efficace pour charger des cellules individuelles dans de grands réseaux de micropuits.

De plus, seuls un écoulement doux et la force gravitationnelle sont utilisés pour faire fonctionner l’appareil, ce qui minimise les dommages cellulaires. L’implication de cette technique est tournée vers le diagnostic final des maladies humaines telles que le cancer, dans lesquelles l’hétérogénéité cellulaire affecte la réponse de la cellule, nous avons donc eu l’idée de développer cette méthode lorsque nous établissions une lignée cellulaire de micropuits, car la méthode de dilution limite prenait beaucoup de temps et était inefficace. Aujourd’hui, cette méthode peut fournir des informations sur l’analyse de cellules individuelles.

Il peut également être appliqué à d’autres applications telles que l’établissement et le temps d’observation du parcours et du comportement des cellules individuelles. Pour commencer, fabriquez des moules maîtres silanisés pour la couche d’isolement de cellule unique et la couche de culture de micropuits, en utilisant la photolithographie standard décrite dans le protocole de texte ci-joint. Pour chaque moule maître, mélangez 16 grammes de base PDMS avec 1,6 gramme d’agent de durcissement dans un gobelet jetable et remuez les mélanges jusqu’à ce qu’ils soient combinés.

Ensuite, placez les moules maîtres dans des boîtes de Pétri de 150 millimètres et versez le PDMS sur les moules. Placez les boîtes de Pétri dans un dessiccateur et appliquez un vide pendant une heure pour éliminer les bulles d’air du PDMS. Au bout d’une heure, retirez la vaisselle du dessiccateur et placez-la dans un four conventionnel à 65 degrés Celsius pendant trois à six heures pour durcir le PDMS.

Ensuite, sortez les plats du four et laissez-les refroidir à température ambiante. Une fois refroidis, décollez le réseau de puits de capture PDMS durci et le réseau de culture à micropuits des moules maîtres et découpez les dispositifs à l’aide d’une lame de rasoir. Ensuite, utilisez un poinçon de 0,75 millimètre pour créer un trou à chaque extrémité du microcanal sur la couche de réseau de puits de capture.

Utilisez du ruban adhésif pour nettoyer ce qui deviendra la surface intérieure de l’appareil, puis placez les couches individuelles avec les surfaces intérieures vers le haut dans un nettoyeur plasma pour un bref traitement au plasma d’oxygène. Lorsque vous avez terminé, retirez les couches PDMS du nettoyeur plasma et utilisez un stéréomicroscope pour aligner et connecter les couches supérieure et inférieure de l’appareil. Placez l’appareil aligné dans un four à 65 degrés Celsius pendant 24 heures pour créer une liaison permanente entre les couches PDMS.

Ensuite, placez le dispositif PDMS collé dans de l’eau désionisée et placez le récipient dans un dessiccateur sous vide pendant 15 minutes, afin d’éliminer l’air du microcanal de l’appareil. Une fois tout l’air retiré de l’appareil, placez l’appareil PDMS dans une hotte de culture tissulaire et utilisez la lumière UV pour stériliser la surface de l’appareil pendant 30 minutes. Ensuite, remplacez l’eau désionisée dans l’appareil par 5 % d’albumine sérique bovine dans du PBS et incubez l’appareil à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Cela bloquera la surface et améliorera l’efficacité du transfert des cellules isolées des puits de capture vers les puits de culture. Après 30 minutes, remplacez la solution de blocage dans l’appareil par du PBS stérile. Préparez une suspension unicellulaire avec 2,5 millions de cellules par millilitre et chargez une pipette de 50 microlitres de suspension.

Ensuite, transférez les cellules dans l’appareil par le trou de sortie de l’appareil. Chargez encore 50 microlitres de suspension de cellules et transférez-les dans l’appareil par le trou d’entrée pour remplir uniformément tout le microcanal avec des cellules. Une fois chargé, utilisez un bouchon stérile fabriqué à partir d’une ligne de pêche en nylon d’un millimètre de diamètre pour sceller le trou de sortie de l’appareil.

Ensuite, remplissez une seringue stérile d’un millilitre avec du milieu de culture, éjectez toutes les bulles d’air résiduelles et placez-la dans le pousse-seringue. Connectez une aiguille émoussée de calibre 23 à la seringue et utilisez un tube en polytétrafluoroéthylène pour connecter l’aiguille à l’entrée de l’appareil. Après avoir connecté le tube, retirez le bouchon du trou de sortie et attendez deux minutes pendant que les cellules s’installent dans les puits de capture de cellule unique par la force gravitationnelle.

Ensuite, réglez le pousse-seringue à 600 microlitres par minute. Retirez la fiche de prise et lavez les cellules non capturées pendant 30 secondes. Attendez deux minutes que la pression se stabilise.

Retirez ensuite le tube de l’entrée de l’appareil et scellez les trous d’entrée et de sortie avec des bouchons pour former un système de culture fermé. Maintenant, retournez l’appareil à la main pour transférer les cellules individuelles capturées dans les micropuits de culture de l’autre côté de l’appareil. Ensuite, placez l’appareil dans une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres, ajoutez 10 millilitres de PBS stérilisé autour de l’appareil et placez la boîte dans un incubateur.

Pour remplacer le milieu de culture, placez d’abord deux gouttelettes de milieu de culture sur le dessus du dispositif PDMS près de l’entrée et de la sortie pour éviter d’introduire des bulles d’air dans le microcanal. Ensuite, à l’aide d’un perforateur à biopsie de 0,75 millimètre, percez deux trous à partir du haut du dispositif PDMS près des extrémités du microcanal. Assurez-vous de ne percer que la couche supérieure de l’appareil.

Ensuite, remplissez une seringue en plastique d’un millilitre contenant du milieu fraîchement préchauffé et utilisez une aiguille émoussée de calibre 23 et un tube en PTFE pour la connecter à l’orifice d’entrée nouvellement créé. Versez lentement environ 120 microlitres de milieu frais dans l’appareil pendant cinq minutes pour remplacer l’ancien milieu. Lorsque vous avez terminé, scellez les orifices d’entrée et de sortie à l’aide de deux bouchons et remettez l’appareil dans l’incubateur de culture cellulaire.

Le nombre de cellules qui se retrouvent dans les puits de capture varie d’environ 68 % à 85 % selon le type de cellule. De plus, la plupart des puits de capture ne contiennent qu’une seule cellule, pour les trois types de cellules. Après le transfert des cellules KT98 capturées vers les puits de culture, environ 77 % des puits n’avaient qu’une seule cellule, 16 % n’avaient pas de cellules, 6 % avaient deux cellules et moins de 1 % des puits avaient trois cellules ou plus.

Pendant sept jours, des cellules isolées ont présenté des schémas de croissance hétérogènes. Alors que certaines cellules se sont multipliées, d’autres ne l’ont pas fait. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 minutes environ si elle est exécutée correctement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser cette plateforme de culture endocrinienne d’isolement de cellule unique à haut débit pour augmenter la productivité de vos expériences sur cellule unique. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter que des bulles d’air ne pénètrent dans le microcanal et d’empêcher les cellules de s’agréger au fil du temps.