Une puce microfluidique pour l'analyse chimique polyvalente de cellules isolées

L’objectif général de l’expérience suivante est d’analyser des lysats de cellules uniques à l’aide de fluorescences ou d’immunoessais. Ceci est réalisé en créant d’abord un dispositif microfluidique et en recouvrant la chambre interne d’anticorps. Ensuite, les cellules individuelles sont immobilisées dans les pièges et sont exposées à divers réactifs pour stimuler une réponse cellulaire dans un second temps.

Une vanne en forme d’anneau est rapidement fermée et un tampon de lyse s’écoule à travers l’appareil. La valve en forme d’anneau est ouverte pendant une courte période et les cellules sont lysées dans la micro-chambre, ce qui permet aux protéines libérées de se lier aux anticorps à une concentration élevée en raison de leur faible volume. Ensuite, la vanne en forme d’anneau est ouverte.

La chambre est lavée et les réactifs de détection sont introduits dans la micro-chambre fermée. L’augmentation de l’intensité de la fluorescence est suivie au fil du temps à l’aide d’un microscope à fluorescence, les résultats démontrent la capacité de ce système à détecter quantitativement et de manière fiable un analyte d’intérêt libéré par des cellules individuelles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’analyse de cellules A uniques.

En particulier, il s’agissait d’études systématiques sur la réponse cellulaire aux variations de l’environnement chimique. Nous pouvons voir des régulations à la hausse ou à la baisse des molécules intracellulaires à la suite du stimulus chimique. Cette technique présente deux avantages principaux.

La première est que nous pouvons exposer les cellules immobilisées à un environnement chimique défini qui est constant ou qui change périodiquement. Deuxièmement, nous pouvons réformer l’analyse hautement sensible et spécifique de l’État sans aucune contamination croisée ni perte d’analytes due au transport. Pour commencer, fabriquez les trois différentes plaquettes maîtresses SU Eight, comme décrit dans le protocole de texte ci-joint.

L’un sera utilisé pour créer la couche fluidique, un pour la couche de contrôle et un troisième pour le tampon de micro-contact. Ensuite, fabriquez les puces microfluidiques en commençant par la préparation d’un mélange de 10 pour un de PDMS et d’un agent de durcissement. Mélangez vigoureusement les deux parties et dégazez la solution pendant 30 minutes ou jusqu’à ce que le mélange ne bouillonne plus.

Ensuite, placez la plaquette dans la couche de contrôle à l’intérieur d’une boîte de Pétri et collez-la sur le fond. Versez environ 50 grammes de PDMS sur le dessus pour créer une couche de quatre à cinq millimètres d’épaisseur et placez la plaquette pendant au moins deux heures dans un four à 80 degrés Celsius pour assurer un durcissement complet du PDMS. Répétez la même procédure pour la plaquette d’impression par micro-contact, mais utilisez environ 20 grammes de PDMS au lieu de 50, ce qui permet d’obtenir une couche de PDMS de quatre à cinq millimètres d’épaisseur.

Pour préparer la couche inférieure, appliquez une couche PDMS de 40 microns de haut sur la plaquette avec la couche microfluidique. Utilisation d’une vitesse de rotation de 2000 tr/min pendant 60 secondes. Faites durcir la couche de PDMS dans un four pendant une heure à 80 degrés Celsius lorsque toutes les pièces ont durci.

Retirez la couche de contrôle de la plaquette et coupez-la en morceaux à l’aide de la lame de rasoir. Ensuite, percez les trous de raccordement à pression à l’aide d’une ponction de biopsie d’un millimètre et couvrez les canaux avec du ruban adhésif pour le stockage. Ensuite, retirez le PDMS de la plaquette d’impression par micro-contact et préparez des tampons de la taille de la surface de la chambre.

Rangez-les à l’abri de la poussière dans un tiroir jusqu’à utilisation. Placez ensuite la plaquette enduite d’essorage et la couche de contrôle de quatre à cinq millimètres d’épaisseur dans un nettoyant plasma. Exposez les morceaux à 18 watts pendant 45 secondes à l’aide d’un plasma d’oxygène à 0,75 millibar.

Après le traitement au plasma, alignez rapidement les deux couches au microscope avec une grande distance de travail. Ajoutez un peu de PDMS de rechange autour des parties supérieures placées afin de faciliter le retrait du PDMS de la plaquette. Placez ensuite la gaufrette dans un four à 80 degrés Celsius pendant au moins une heure.

Une fois durci, à l’aide d’un scalpel, retirez soigneusement le PDMS de la plaquette et découpez les trous d’accès au poinçon des micropuces pour les connexions fluidiques avec une ponction de biopsie de 1,5 millimètre. De plus, créez un réservoir dans la micropuce en coupant la partie supérieure d’une pointe de pipette de 200 microlitres et en utilisant des PDMS semi-durcis de rechange. Collez-le sur le dessus.

Ensuite, faites durcir la puce au four à 80 degrés Celsius pendant au moins une heure. Commencez par nettoyer une lame de verre et des pièces PDMS. Nettoyez une lame de verre avec du savon.

Rincez-le à l’eau distillée, puis à nouveau à l’éthanol. Séchez la lame à l’aide d’un jet d’azote. Utilisez du ruban adhésif pour enlever tous les débris et particules de poussière du PDMS.

Placez ensuite la partie PDMS et le verre nettoyé. Glissez-le dans le nettoyeur plasma pendant 45 secondes à 18 watts pour assurer une liaison étanche, placez la puce sur une plaque chauffante pendant cinq minutes après le traitement au plasma Après le collage, coupez la partie inférieure de quelques pointes de pipette de 200 microlitres. Remplissez-les de 10 à 15 microlitres de PBS filtré à 4 %BSA et placez-les dans les entrées de l’appareil.

Ensuite, utilisez des pointes coupées avec 10 à 15 microlitres de PBS ajoutés et mettez-les dans les canaux de contrôle. Ensuite, placez les puces dans la centrifugeuse et faites-les tourner à 800 fois la gravité pendant cinq minutes pour remplir les canaux de liquide. S’il reste de l’air dans l’un des canaux, répétez cette étape jusqu’à ce que les canaux soient complètement remplis.

Incuber la solution de blocage pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez la solution de la couche fluide avec du PBS à un débit de 10 microlitres par minute. À l’aide d’une pompe à seringue, le dispositif est maintenant prêt pour les expériences cellulaires afin de pré-imprimer la lame de verre pour les immunoessais, incuber des tampons d’impression par micro-contact PDMS avec 0,5 % de BSA biotinylé dans une boîte de Pétri propre.

Au bout d’une demi-heure, nettoyez soigneusement et rapidement les tampons avec de l’eau distillée et séchez-les sous un jet d’azote. Une fois secs, placez rapidement les tampons sur une lame de verre nettoyée pour déposer le BSA biotinylé à motifs. Ne déplacez pas le tampon après l’avoir placé et vérifiez que le tampon est en contact avec la glissière de verre.

Si ce n’est pas légèrement, appuyez sur le tampon, mais n’appuyez pas fort. Placez ensuite le tampon avec la partie supérieure de la puce microfluidique dans la chambre à plasma et exposez-les à un plasma d’oxygène à 18 watts pendant 45 secondes. Après le traitement au plasma, retirez le tampon de la lame de verre.

Respirer à la surface rendra le motif visible. Alignez les microchambres sur la surface imprimée. Une fois aligné, placez la puce sur une plaque chauffante à 50 degrés Celsius pendant 30 minutes pour bloquer la surface restante, introduisez une solution BSA filtrée stérile à 4 % dans du PBS dans la puce avec une centrifugeuse comme indiqué précédemment, incubez la micropuce pendant au moins 30 minutes, puis lavez la solution de la couche fluide avec du PBS à un débit de 10 microlitres par minute.

À l’aide d’un pousse-seringue, utilisez la puce directement ou conservez-la jusqu’à deux semaines à quatre degrés Celsius dans une boîte humide. Ensuite, créez une surface de liaison entièrement fonctionnelle en introduisant de l’avadon dans le PBS dans le réservoir. Versez ensuite la solution pour aspirer l’avadon à travers les canaux de fluide.

Rincez abondamment le réservoir et rincez les canaux avec du PBS. Ajoutez ensuite la protéine G dans le réservoir et tirez-la à travers les canaux. Lavez tout excès de protéine G en rinçant le réservoir et la puce avec du PBS.

Ensuite, ajoutez l’anticorps d’intérêt dans le réservoir et faites-le circuler à travers les canaux. Ensuite, arrêtez le flux pour permettre la liaison avant de laver les canaux avec du PBS par fluorescence, des analogues marqués peuvent être utilisés pour vérifier la qualité du processus d’impression avant d’introduire des cellules dans les canaux. Récoltez les cellules adhérentes telles que les cellules HE 2 9 3 montrées ici à l’aide d’un tampon de dissociation sans enzyme, puis filtrez-les pour réduire le nombre de grappes de cellules une fois filtrées, chargez-les dans une seringue.

À raison de 300 000 cellules par millilitre, chargez les cellules sur la puce en utilisant le flux direct sur la pompe à seringue pendant environ trois minutes à un débit de 10 à 20 microlitres par minute pour des cellules adhésives comme celles-ci afin d’éviter une fixation non spécifique des cellules lorsque les pièges sont remplis, fermez les chambres en pressurisant la couche supérieure avec trois barres. Examinez ensuite les chambres à l’aide d’un microscope. Si de nombreuses cellules n’ont pas spécifiquement adhéré à la surface à l’intérieur des chambres, ouvrez-les rapidement et essayez de les laver avec un tampon de dissociation cellulaire à un débit de 10 à 30 microlitres par minute.

Pour le dosage de la glucose six phosphate déshydrogénase ou G six PDH, ajoutez deux doses millimolaires de glucose, six doses de phosphate 0,5 millimolaire et une matrice de DIA DP de 0,5 unité par millilitre et une RIN de 0,3 millimolaire à un tampon de lyse et assurez-vous qu’il est bien mélangé. Une fois les canaux dégagés, aspirez le tampon de lyse G six PDH à travers la puce à un débit de 30 microlitres par minute. Au fur et à mesure que le tampon de lyse s’écoule, ouvrez et fermez rapidement les chambres, en les laissant ouvertes pendant 500 millisecondes pour permettre à la lyse d’entrer dans la chambre immédiatement après le début de la lyse afin de surveiller la réaction cinétique.

Dans cet exemple, un produit fluorescent peut être surveillé au fil du temps. On voit ici un ensemble de chambres qui ont été remplies de colorant alimentaire orange, puis fermées par pressurisation de la couche de contrôle au-dessus des micro-chambres. Après la fermeture de la chambre, un colorant alimentaire vert a été rincé à travers les canaux pour montrer l’étanchéité des chambres.

Chaque chambre contient un volume de seulement 625 picolitres de liquide qui maintient la concentration de molécules libérées par les cellules lys suffisamment élevée pour l’analyse. De plus, les vannes peuvent être ouvertes et fermées de manière à éliminer la contamination croisée entre les chambres. À l’intérieur de ces chambres, il est possible de mesurer des analytes tels que la quantité de lysosome libérée par une seule cellule U 9 37 activée par PMA, car elle catalyse enzymatiquement la production d’une molécule fluorescente à l’intérieur de la chambre.

Les lignes vertes représentent la variation de l’intensité de la fluorescence au fil du temps pour les chambres occupées par une cellule. L’intensité de fluorescence pour une chambre sans cellules est représentée par la ligne pointillée noire. À titre de comparaison, ce test montre l’effet d’une molécule toxique sur l’intégrité de la membrane en mesurant une enzyme intracellulaire G six PDH.

La ligne noire représente les échantillons de contrôle sans influence toxique, tandis que la ligne orange représente les cellules influencées par la toxine représentée. Voici un exemple d’immunodosage pour la protéine intracellulaire. Les anticorps anti-GFP ont été immobilisés à la surface et une fois les cellules lysées, la cinétique de liaison des protéines GFP a été visualisée à l’aide de la microscopie sur gazon.

Le temps 0,1 marque l’introduction du tampon de lyse au moment où la GFP 0,2 commence à s’accumuler à la surface, ce qui signifie que la lyse cellulaire s’est produite et que la GFP s’est diffusée à la surface. La liaison de la GFP aux anticorps est terminée au temps 0,3. Dans ce dernier exemple, des anticorps de détection couplés à la capture d’anticorps en surface, puis des anticorps de détection couplés à la HRP ont été ajoutés.

Une fois que tous les anticorps de détection non liés ont été éliminés, le réactif de détection a été introduit et la réaction s’est échelonnée dans le temps. Voici une comparaison de la quantité de GA DH anciennement intracellulaire dans des quantités animales entre les cellules U 9 37 et HEC 2 93 mesurées à l’aide de cette méthode. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des puces microfluidiques, de la modification de la surface pour permettre des immunoessais et, enfin, de l’utilisation de l’appareil pour l’analyse d’une seule cellule.

Cette méthode peut être utilisée pour aider à répondre à de nombreuses questions déclenchantes dans le domaine de la biologie unicellulaire.