Name: Une puce microfluidique pour lanalyse chimique polyvalente de cellules isolées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse de cellules isolées par puce microfluidique pour la quantification des protéines intracellulaires. Cette technique utilise des immunoessais fluorescents pour étudier l'hétérogénéité cellulaire avec précision.

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Les auteurs tiennent à remercier Tom Robinson pour la relecture du manuscrit, C. Bärtschi et H. Benz pour la construction du système de contrôle de pression sur mesure. Nous tenons également à souligner l&#39;utilisation de la salle blanche PREMIER et le Centre de microscopie lumineuse (LMC), à la fois à l&#39;ETH Zürich. Le travail a été financé par Merck Serono et le Conseil européen de la recherche (ERC) dans le cadre du 7ème programme-cadre (ERC Starting Grant, projet no. 203428, nμLIPIDs).

Une. SU-8 de fabrication de Maître Préparer deux moules maîtres pour les canaux (fluidiques et de contrôle, pour les schémas et les dimensions, voir la figure 2) avec le protocole suivant, mais avec des schémas de masquage. Le procédé est représenté sur la figure 3a. <ol><li> Commencer par chauffage d&#39;une tranche de silicium de 4 pouces pendant 10 min à 180 ° C. Chargez la plaquette déshydraté sur un spin-coater et utiliser le protocole suivant pour spin-coating SU-8 2015: <ol><li> Spin plaquette à 100 tours par minute pendant 20 s (couvercle ouvert de spin-coater, distribuer SU-8 au cours de cette étape, fermer le couvercle après la distribution). </li><li> Spin plaquette à 500 rpm pendant 10 secondes (cela se généralise la résine sur toute la plaquette). </li><li> Spin tranche à 1750 tpm pendant 30 sec (définit la hauteur de la résistance à 20 um). </li></ol></li><li> Retirer résister à partir du bord de la plaquette avec de l&#39;acétone (utiliser un coton-tige) comme ce sera contraire s&#39;en tenir à la plaque de cuisson à l&#39;étape suivante. Transférer la tranche de ahotplate à 95 ° C et de la chaleur pendant 4 min. Après la cuisson douce, exposer la résine photosensible à travers un photomasque collé sur le verre sodocalcique dans un aligneur de masque avec une lumière UV (150 mJ / cm 2, mesurée à 365 nm). </li><li> Après l&#39;exposition, la plaquette chauffer à nouveau à 95 ° C pendant 5 minutes sur une plaque chauffante. Refroidir la plaquette à température ambiante et ensuite, plonger dans un bain de SU-8 développeur pendant 4 min. Secouer doucement pour enlever non exposée SU-8. Laver la tranche avec salle blanche classe isopropanol et sécher avec de l&#39;azote. Vérifiez sous un microscope si le développement a été un succès (en particulier les pièges de cellules). Si les cellules piégées sont complètement développés, la réflexion de la tranche de silicium doit être visible. Si nécessaire, de développer de nouveau sur la plaquette pendant quelques minutes. </li><li> Faire cuire la plaquette dans un four pendant 2 heures à 180 ° C pour éliminer tout solvant résiduel. Vérifiez la hauteur des canaux avec un profileur de l&#39;étape. Si la hauteur est différente de la hauteur désirée, répéter ce protocole à partir de l&#39;étape 1.1 avec une nouvelle plaquette etchanger le spin-vitesse (étape 1.1.3). Finaliser la fabrication du moule maître par silanisation avec la plaquette 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorodécyl-dimethylchloro-silane dans un dessiccateur pendant une nuit. </li></ol> 2. Fabrication de maître pour l&#39;impression par microcontact <ol><li> Afin de préparer des moules maîtres pour l&#39;impression par microcontact, déshydrater une plaquette de silicium pendant 10 min à 180 ° C. Spin-manteau 1 ml HDMS sur cette plaquette à 7500 tours par minute pendant 30 secondes (la résine adhère mieux sur une surface silanisée). Spin-manteau 2 ml de AZ1518 résistent positive avec ce protocole: <ol><li> Distribution statique du résist sur la plaquette. </li><li> Spin tranche de 5 secondes à 500 rpm. </li><li> Spin tranche de 60 sec à 4000 rpm. </li></ol></li><li> Après une cuisson douce 50 sec à 100 ° C sur une plaque chauffante, d&#39;exposer la résine photosensible à la lumière UV (21 mJ / cm 2 à 365 nm) à travers un photomasque et sur ​​un aligneur de masque. Développer la résistance dans un bain de AZ 726 pour 75 sec. Rincer la plaquette développé avec de l&#39;eau déminéralisée et coup dry avec de l&#39;azote. Éliminer le solvant résiduel par chauffage de la plaquette à 115 ° C pendant 50 sec. Silaniser la plaquette sous vide pendant une nuit. </li></ol> 3. Fabrication de la puce microfluidique Une conception d&#39;un dispositif à deux couches est utilisé pour ces expériences. Les deux couches sont préparées séparément et sont liés ensemble, avant que la puce est enfin collé sur une lame de verre (Figure 3b). Cette étape décrit la production de couches de PDMS et le timbre de PDMS pour l&#39;impression par microcontact. <ol><li> Préparer un mélange 10:01 de PDMS et d&#39;agent de durcissement. Préparez environ 80 g PDMS au total (en utilisant nos conceptions, cela se traduira par 10 jetons). Mélanger vigoureusement les deux parties et dégazer le PDMS jusqu&#39;à ce que le mélange soit sans bulles (~ 30 minutes). </li><li> Placez la tranche de la couche de contrôle à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Pétri avec du ruban adhésif sur le fond. Ensuite, versez ~ 50 g de PDMS sur le dessus et mettre la plaque pendant au moins 2 heures dans un four à 80 ° C pour assurer complètedurcissement du PDMS. Répétez la même procédure pour la tranche d&#39;impression par microcontact, pour cette ~ 20 g PDMS est nécessaire. </li><li> Spin-manteau PDMS sur la plaquette avec la couche de fluide à une vitesse de rotation de 2000 tours par minute pour former une couche d&#39;environ 40 um à haute PDMS. Guérir les PDMS dans un four pendant au moins 1 heure à 80 ° C. </li><li> Lorsque les deux parties sont guéris, enlever la couche de contrôle de la plaquette et les couper en morceaux avec une lame de rasoir. Percer des trous de connexion de la pression à l&#39;aide d&#39;un perforateur de biopsie de 1 mm. Pour le stockage, il est conseillé de mettre un morceau de ruban adhésif sur les canaux. </li><li> Pour lier les deux couches, prendre la tranche de spin-enduit et la partie supérieure et les placer dans un nettoyeur de plasma 23. Après un traitement au plasma, aligner rapidement les deux parties sous un microscope avec une grande distance de travail. Ajouter des PDMS de rechange autour des parties supérieures placées. Cette étape n&#39;est pas obligatoire, mais il facilite l&#39;élimination des PDMS à partir de la plaquette. Placer la plaquette dans une étuve à 80 ° C pendant au moins 1 h. </li><li> Utiliser un scalpel pour enlever soigneusement les PDMS de la plaquette et de couper les puces. Poinçonner des trous d&#39;accès pour les connexions fluidiques avec une biopsie poinçon de 1,5 mm. </li><li> La puce PDMS est maintenant terminée et peut être stocké pendant des mois. Facultatif: Si la puce est utilisée avec un réservoir, couper la partie supérieure d&#39;un embout de pipette 200 pi et d&#39;utiliser certaines de rechange, PDMS semi-durci à coller sur le dessus. Mettre la puce à nouveau dans le four à 80 ° C pendant au moins 1 heure. </li></ol> 4. Collage de verre diaporama Pour utiliser le dispositif pour les essais enzymatiques directs, la seule étape nécessaire après le collage est le blocage de surfaces. Pour ce protocole, procédez à A. Toutefois, pour utiliser la puce microfluidique pour des dosages immunologiques ou ELISA, s&#39;il vous plaît se référer à protocole B à restreindre les sites de liaison seulement à la lame de verre (pour la microscopie TIRF ou SPR). Si cette restriction n&#39;est pas important, reportez-vous à A, mais utiliser conjugués biotinylés à l&#39;étape 4.3 et passez à l&#39;étape 4.8dans le protocole B pour créer une surface entièrement fonctionnel. Avant d&#39;effectuer le protocole A et B: Il est conseillé de filtrer toutes les solutions de protéines utilisés avant de les introduire dans la puce. Débris et de protéines agrégats peuvent sinon bloquer pièges cellulaires, réduisant ainsi le nombre de chambres qui peuvent être utilisés pour l&#39;analyse. Pour ce faire, utiliser un appareil de filtre d&#39;adsorption non protéique pour filtrer toutes les solutions avant de les introduire dans les canaux. Protocole A (tests enzymatiques) <ol><li> Pour finaliser le dispositif microfluidique, lier les parties PDMS sur une lame de verre. Pour ce faire, d&#39;abord nettoyer une lame de verre avec du savon, de l&#39;eau distillée et d&#39;éthanol. Sécher la lame à l&#39;aide d&#39;un courant d&#39;azote. Nettoyer la partie PDMS avec du scotch. </li><li> Mettez la partie PDMS et la lame de verre nettoyé dans le filtre à plasma pendant 45 secondes à 18 W. Pour assurer une liaison étanche, mettre la puce sur une plaque chaude (100 ° C) pendant 5 min. </li><li> Après collage, remplissez la puce avec fLUID. Un moyen facile d&#39;y parvenir est d&#39;utiliser la force centrifuge. Couper la partie inférieure de 200 pi pointe de la pipette. Pour les canaux fluidiques, les remplir avec la solution de blocage (albumine de sérum bovin (4% p / v) ou la poly-L-lysine) de polyéthylène glycol greffé (0,05% p / v) et de placer les pointes dans les entrées. Remplissez les entrées de la couche de contrôle avec de l&#39;eau ou avec une solution iso-osmotique, par exemple PBS. Placer la puce dans la centrifugeuse (800 x g) pendant 5 min. Les chaînes doivent être maintenant remplis de liquide complètement. Si pas, répétez cette étape. </li><li> Incuber la solution de blocage pendant au moins 30 min à température ambiante. Laver la solution hors de la couche de fluide avec du PBS à un débit de 10 ul / min en utilisant une pompe à seringue. Le dispositif est maintenant prêt pour des expériences cellulaires. </li></ol> Protocole B (immunoessais) Pour un aperçu complet de la modification de surface de l&#39;étape 4.7 partir, s&#39;il vous plaît se référer au tableau 1. <ol start="5"><li> DansPDMS cubate timbres pour l&#39;impression par microcontact avec une solution BBSA / BSA (par exemple 1-100). Après 30 minutes, nettoyer les timbres avec de l&#39;eau distillée et sécher le timbre sous un courant d&#39;azote. Placez rapidement les timbres sur une lame de verre nettoyée (figure 4). </li><li> Exposer la lame de verre avec le tampon en même temps que la partie supérieure de la puce microfluidique à un plasma d&#39;oxygène pendant 45 secondes à la puissance maximale (18 W) dans un filtre à plasma. Après le traitement de plasma, retirez le timbre et aligner la surface imprimée sous les microchambres de l&#39;appareil. Placez la puce pendant 30 min sur une plaque chaude à 50 ° C. </li><li> Pour bloquer la surface restante, introduire une solution stérilisée par filtration de BSA (4% (p / v) dans du PBS) dans la puce avec une centrifugeuse (voir étape 4.2). Incuber pendant 1 heure et laver la solution de la couche de fluide avec du PBS (voir l&#39;étape 4.3). La puce peut alors être utilisé directement ou stocké pendant jusqu&#39;à 2 semaines à 4 ° C dans une boîte humide. </li><li> Pour un surfactant liaison entièrement fonctionnele, introduire l&#39;avidine (0,025% (p / v) dans du PBS) dans le réservoir. Utiliser un débit de 5 ul / min pendant 30 minutes pour retirer la solution de l&#39;avidine par l&#39;intermédiaire des canaux de fluide. Ensuite, rincez PBS pendant 10 min. Rincer soigneusement le réservoir. </li><li> Ensuite, ajouter la protéine G (0,0025% (p / v) dans du PBS) et rincer pendant 30 minutes supplémentaires. Laver avec du PBS pendant 10 minutes supplémentaires après. Ensuite, ajouter l&#39;anticorps d&#39;intérêt (0,0001% (p / v) dans du PBS) pendant 10 min. Après 10 min, arrêter l&#39;écoulement pendant 15 min pour permettre la liaison. Ensuite, laver avec du PBS pendant 10 min. </li></ol> 5. expériences sur les cellules Le protocole est écrit d&#39;une manière générale en raison de la variété de dosages possibles. A titre d&#39;exemple les réactifs nécessaires pour le test de toxicité sont donnés G6PDH. Le rendement initial de piégeage de cellule de l&#39;appareil est d&#39;environ 2,5%, soit 5 sur 200 cellules seront pris au piège. L&#39;occupation définitive des cellules piégées dépend fortement de la lignée cellulaire utilisée, le protocole de suspendrela lignée cellulaire et le moment où les cellules sont vidées par l&#39;intermédiaire du canal. Pour les cellules qui poussent naturellement en suspension (telles que U937), des cellules individuelles peuvent être trouvés dans environ 75% des chambres au bout de quelques minutes. Les autres chambres sont soit pas remplies, ou occupés par deux ou plusieurs cellules. En général, le taux d&#39;occupation à cellule unique est plus petite pour les lignées cellulaires adhérentes. Lors de l&#39;utilisation du protocole de mise en suspension plutôt légère présentée ici, le pourcentage diminue à environ 30% (HEK, les cellules MLT). Le maximum de l&#39;unité de cellules peut être amélioré par traitement à la trypsine des cellules, mais ce peut également modifier les résultats des expériences. En fonction de la molécule cible, l&#39;adsorption ou l&#39;absorption de PDMS peuvent influencer les résultats. L&#39;adsorption peut être réduite par les surfaces de blocage avec BSA ou PLL-g-PEG. L&#39;absorption est peu probable pour la plupart des biomolécules hydrophiles, mais il doit être vérifié pour les (petits) composants cellulaires lipophiles. <ol><li> Préparer les cellules selon le protocole spécifique (par exemple, </em&gt; de la toxicomanie). Pour les cellules en suspension, ajouter les cellules directement à la puce. Pour les lignées de cellules adhésives, en utilisant un tampon de dissociation sans enzyme pour produire une suspension de cellules. Filtrer les cellules avant de les introduire à la puce afin de réduire la quantité d&#39;agrégats de cellules. </li><li> Charger les cellules sur la puce en utilisant une pompe à seringue et l&#39;écoulement vers l&#39;avant, plutôt que de retirer la suspension de cellules. Utiliser un débit de 5 pl / min pour des lignées de cellules en suspension et des débits plus élevés de 10 à 20 pl / min pour les cellules adhérentes car écoulement pour réduire la fixation non spécifique des cellules sur les parois du canal. </li><li> Lorsque les pièges sont remplis, fermez les chambres. Si de nombreuses cellules adhèrent non spécifique à la surface, essayez de les laver avec un tampon de dissociation cellulaire à un débit de 10-30 l / min. </li></ol> Protocole A (tests enzymatiques) <ol start="4"><li> Retirer le tampon de lyse par la puce. Pour cet exemple, ce tampon est un tampon hypo-osmolaire ajoutée avec du Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, 1% (v / v) de Tween 20). Pour la lyse, les chambres s&#39;ouvrent et se ferment rapidement (soit 500 ms pour les débits de 10-50 l / min 7,21). Pour le dosage de la G6PDH, ajouter 2 mM de glucose-6-phosphate, NADP mM 0,5, 0,5 U / ml de diaphorase et de 0,3 mM de la résazurine dans le tampon de lyse. Commencer à surveiller la réaction cinétique immédiatement après la lyse. </li></ol> Remarque: Choisir tout tampon qui est adapté pour le dosage, cependant nu à l&#39;esprit que des détergents forts (tels que Triton, SDS) lyser les cellules seront immédiatement et conduire à une perte de l&#39;analyte lors de l&#39;ouverture de la chambre. Protocole B (immunoessais) Pour une brève description des expériences ELISA cellulaires (débits, l&#39;état de la chambre, etc), s&#39;il vous plaît se référer au tableau 1. <ol start="5"><li> Pour ELISA, ajouter le réactif de détection requis (par exemple l&#39;anticorps secondaire, un antigène marqué) directement vers le tampon de lyse. Le présent document a ajouté Tween 20 réduit l&#39;adsorption non spécifique. Lyse des cellules selon l&#39;étape 5.4. Incuber le mélange pendant 10-15 minutes pour permettre la liaison (temps d&#39;incubation en fonction de l&#39;antigène et de l&#39;anticorps utilisé). </li><li> Conjugués enzymatiques d&#39;anticorps qui adsorbées de façon non spécifique pour les parois des canaux peuvent conduire à une conversion du réactif de détection déjà à l&#39;intérieur du réservoir et les canaux. Pour réduire les problèmes de cette adsorption, rincer un inhibiteur de l&#39;enzyme permanent de détection utilisée par la puce pendant la période d&#39;incubation (chambres fermées, avant d&#39;ajouter le réactif de détection). Pour HRP, utiliser HCl 20 mM dans l&#39;eau pour inactiver les enzymes en permanence non spécifiquement adsorbées. </li><li> Après le temps d&#39;incubation, à introduire le réactif de détection (par exemple Amplex Red et du peroxyde d&#39;hydrogène pour HRP) à la puce. Ouvrez les chambres peu nouveau pour laver l&#39;anticorps secondaire nonbound loin et d&#39;ajouter le réactif de détection. Commencer à surveiller la réaction cinétique immédiatement. </li><li> Calibration: Immobiliserl&#39;anticorps dirigé contre la cible d&#39;intérêt. Fermer chambres. Préparer différentes concentrations de l&#39;analyte dans un tampon ou dans un lysat de cellules hors de la puce. Appliquer une concentration de la puce et échanger rapidement le volume à l&#39;intérieur des chambres (500 ms de temps d&#39;ouverture). Ce temps d&#39;ouverture est suffisamment courte pour assurer que se produit pas d&#39;accumulation supplémentaire de rinçage analyte, et seulement un nombre spécifique de molécules à partir du volume de la microchambre est détectée. De la concentration connue de l&#39;antigène à l&#39;intérieur de la solution et le volume de la chambre (625 pl), de calculer le montant à l&#39;intérieur de la chambre. Ensuite, passez à l&#39;étape 5.5 et introduire le fragment de détection. </li></ol>

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<li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.</li>
<li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc.+Tech%22%5BJournal%5D)">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).</li>
<li>Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+housekeeping+gene+encoding+glucose+6-phosphate+dehydrogenase+%28G6PD%29%3A+G6PD+is+dispensable+for+pentose+synthesis+but+essential+for+defense+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress.</a> EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

technologie microfluidique a ouvert des possibilités nouvelles et fascinantes pour l&#39;analyse unicellulaire. En particulier, la possibilité de piéger et d&#39;immobiliser les cellules individuellement par des outils microfluidiques a permis des études systématiques à court et à long terme sur les propriétés unicellulaires et réponse. De plus, l&#39;encapsulation des cellules dans des micro-gouttelettes de fréquences élevées, générées sur une puce, a permis des études de sécrétion des cellules simples, qui ne peuvent ...

De nombreuses études dans le passé ont révélé des différences de cellule à cellule dans une grande population de cellules 1-3, en particulier les processus de signalisation 4, ou les quantités de biomolécules telles que les protéines intracellulaires 5,6, des métabolites et des cofacteurs 7,8. Ces hétérogénéités sont considérés comme d&#39;une importance fondamentale pour l&#39;adaptation de la cellule et de l&#39;évolution 9, mais aussi jouer un rôle clé dans l&#39;émergence et le traitement de maladies telles que le cancer 10-13. Par conséquent, les études sur le niveau de la cellule sont d&#39;un grand intérêt dans la recherche biologique et pharmacologique, en particulier si ces études révèlent les différentes réponses cellulaires après traitement avec des substances chimiques bioactives. Au cours des dernières années, plusieurs plates-formes d&#39;analyse ont été mises au point qui facilite l&#39;analyse des cellules vivantes simples ou la composition chimique du contenu des cellules. Bien cellulaire activé par fluorescence (FACS) est l&#39;or standard pour analyse à très haut débit de cellules vivantes individuelles, le procédé ne peut pas être utilisé pour la quantification des composés intracellulaires ou sécrétées. L&#39;émergence de plates-formes microfluidiques a promis stratégies d&#39;analyse nouveaux pour le positionnement, le traitement et l&#39;observation des cellules individuelles. Une étape importante dans la microfluidique a été conclu avec l&#39;intégration des vannes flexibles PDMS réalisés par Quake et collègues 14,15. Ces vannes sont utiles car ils peuvent isoler des régions sur la puce, par exemple séparer deux cultures 16. En outre, ils sont particulièrement applicable pour l&#39;analyse d&#39;une seule cellule et d&#39;aider à réduire les problèmes de dilution analyte donc. La puissance de cette approche pour l&#39;analyse unicellulaire a été démontré récemment par Hansen et ses collègues, qui ont analysé l&#39;expression des gènes de centaines de cellules uniques en parallèle 17. Lorsque le ciblage des protéines et des métabolites, l&#39;analyse est très difficile en raison de l&#39;absence d&#39;un convenableModes de mplification, le grand nombre de différents composés présents, et de leurs variations de nature chimique. En outre, la plupart des biomolécules intracellulaires sont tenus d&#39;être présents à faible nombre de copies de l&#39;ordre de quelques dizaines de milliers 18, où la méthode d&#39;analyse utilisée doit avoir une haute sensibilité. Des dosages plus puissants, tels que des dosages immunologiques et des dosages immunoenzymatiques (ELISA) sont difficiles à intégrer dans des dispositifs microfluidiques, car ils nécessitent plusieurs étapes de lavage et d&#39;incubation ainsi que l&#39;immobilisation de surface. En raison de ces défis, il n&#39;est pas surprenant que seuls quelques exemples ont été signalés où des protéines ou des métabolites ont été quantifiés sur le niveau de la cellule. Par exemple, des études sur la sécrétion de composés fluorescents ont été rapportés 19,20. Récemment, la mise en œuvre par ELISA a été présenté pour l&#39;analyse des sécrétées (non fluorescentes) des protéines à partir d&#39;une culture cellulaire (cellules THP-1) 21 et seul (immune) cellules 10. Le ciblage des protéines intracellulaires, Shi et al. Mis au point un dispositif microfluidique qui a facilité l&#39;identification des protéines intracellulaires pour l&#39;analyse des voies de signalisation des cellules tumorales au moyen d&#39;un immuno-essai 11. Cependant, seules des quantités relatives de protéines ont été déterminées et aucune amplification enzymatique a été utilisée pour augmenter le signal pour les protéines de faible abondance. Récemment, nous avons été en mesure de combiner un micro-dispositif de piégeage seule cellule avec des essais de fluorescence 8 et immunoessais 22 (Figure 1). Les cellules sont passivement piégés dans des structures de haies micronisée, qui permettent l&#39;approvisionnement et l&#39;échange de milieu et d&#39;autres agents chimiques, sans aucun mouvement des cellules (rapide). Une soupape en forme d&#39;anneau autour de chaque piège permet l&#39;isolement de la cellule dans un très petit volume (&quot;la microchambre&quot;). Cette vanne est actionné immédiatement après l&#39;introduction d&#39;un tampon de lyse cellulaire (hypoosmolaire), ilnce prévenir molécules intracellulaires ou molécules sécrétées à diffuser à distance. Plus important, en raison de la petite taille du volume (625 pl) à grande dilution des molécules est évitée. En outre, étant donné que la lyse et l&#39;analyse sont effectuées dans la même position dans la puce, il n&#39;y a pas de perte d&#39;analytes dues au transport. La conception de la puce décrite ici comprend 8 rangées alternées de soit 7 ou 8 microchambres, totalisant 60 microchambres. Les chambres sont actionnés en rangées, de sorte que la contamination croisée le long d&#39;une ligne est exclue. La plate-forme peut être utilisée en combinaison avec des essais de fluorescence, ainsi que des dosages immunologiques (figure 1d). Dans ce dernier cas, nous avons établi des protocoles pour l&#39;immobilisation des anticorps, qui sont compatibles avec la production de puces et le processus d&#39;assemblage. D&#39;où la plate-forme ouvre la voie à des méthodes sensibles, fiables et quantifiables au niveau de la cellule unique. Jusqu&#39;à maintenant, nous avons utilisé le dispositif pour l&#39;analyse des ienzymes sécrétées (ntracellular et quantification relative par dosages enzymatiques), des cofacteurs intracellulaires, des protéines et des petites molécules (de quantification absolue par des analyses de point de terminaison ou ELISA). Dans ce qui suit, nous décrirons le processus de fabrication de puces au moyen de la lithographie molle multicouche et les protocoles pour la structuration des anticorps au moyen de l&#39;impression par microcontact et la chimie de surface. De plus, quelques exemples d&#39;utilisation de la puce et les opérations sont donnés.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nom du réactif Numéro de</td><td>catalogue</td> de <td>l’entreprise</td><td>Commentaires (facultatif)</td></tr><tr><td>SU-8 2015</td><td>MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td>n.a.1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ABCR (Karlsruhe, Allemagne)</td><td>AB103608</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &beta ;-D-N,N&prime ;-diacetylchitobioside hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9763</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Allemagne)</td><td>100014</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>AppliChem (Axon Lab AG)</td><td>A-2568</td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518</td><td>AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Allemagne)</td><td>n.a.AZ</td><td></td></tr> <tr><td>726 développeur</td><td>AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Allemagne)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-4503</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine, biotine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-8549</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de dissociation cellulaire</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Hexaméthyldisilazane (HDMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40215</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Fluka</td><td>84422</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Allemagne)</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>Développeur MR 600</td><td>Microresist technology GmbH (Berlin, Allemagne)</td><td>n.a.PBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG greffé</td><td>SuSoS, (D&uuml ; bendorf, Suisse)</td><td>n.a.PLL-g-PEG</td><td></td></tr> <tr><td>greffée de biotine</td><td>SuSoS, (D&uuml ; bendorf, Switzerland)</td><td>n.a.Chlorure</td><td></td></tr> de <tr><td>potassium</td><td>Fluka</td><td>60132</td><td></td></tr><tr><td>Protéine G, biotine</td><td>Sigma Fine Chemicals</td><td>41624</td><td></td></tr><tr><td>Plaquette de silicium</td><td>Si-Mat (Kaufering, Allemagne)</td><td>n.a.Sylgard</td><td></td></tr> <tr><td>184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>39100000</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>1610716</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>ÉQUIPEMENT :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nom de</td><td>l’entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires (facultatif)</td></tr><tr><td>0.22 &micro ; m Filtre à seringue PES</td><td>TRP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>1/1,5 mm perforateur de biopsie</td><td>Miltex, York PA</td><td>33-31AA/33-31A</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à cellules Trics 20 &micro ; m</td><td>Partec</td><td>04-004-2325</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Sigma 3-18K</td><td>Kuehner</td><td>n.a.Plaque</td><td></td></tr> <tr><td>chauffante HP 160 III BM</td><td>Sawatec, Sax, Suisse</td><td>n.a.MA-6</td><td></td></tr> <tr><td>aligneur</td><td>de masque Karl Suess</td><td>n.a.Multizoom</td><td></td></tr> <tr><td>AZ100M microscope</td><td>Nikon Corporation</td><td>n.a.Photomask</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Microlitho, Essex, Royaume-Uni</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma PDC-32G</td><td>Harrick</td><td>n.a.Spin</td><td></td></tr> <tr><td>coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE</td><td>Laurell</td><td>n.a.Spin</td><td></td></tr> <tr><td>Modules SM 180 BM</td><td>Sawatec, Sax, Switzerland</td><td>n.a.Step</td><td></td></tr> <tr><td>profiler Dektak XT Advanced</td><td>Bruker</td><td>n.a.Pompe</td><td></td></tr> <tr><td>à seringue neMESYS</td><td>Cetoni</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

une puce microfluidique pour l&#39;analyse chimique polyvalente de cellules isolées

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

On présente un dispositif microfluidique qui permet la détermination quantitative de plusieurs biomolécules intracellulaires dans des cellules individuelles en parallèle. A cette fin, les cellules sont piégées dans passivement au milieu d&#39;une microchambre. Lors de l&#39;activation de la couche de contrôle, la cellule est isolée du volume entourant dans une petite chambre. Le volume entourant peut alors être échangé sans affecter la cellule isolée. Toutefois, à la courte ouverture et la fermeture de la chambre, la solution dans la chambre peut être remplacé à quelques centaines de millisecondes. En raison de la réversibilité des chambres, les cellules peuvent être exposées à des solutions différentes de manière séquentielle dans un mode hautement contrôlable, par exemple pour l&#39;incubation, le lavage, et finalement, la lyse des cellules. Les microchambres hermétiques permettent le maintien du lysat, réduire et contrôler la dilution après lyse cellulaire. Depuis la lyse et l&#39;analyse se produisent au même endroit, haute sensibilité est conservée, car aucune autre dilution ou de la perte des analytes se produit pendant le transport. La conception de la microchambre permet donc l&#39;analyse fiable et reproductible de très petits nombres de copies de molécules intracellulaires (attomoles, zeptomoles) libérés à partir de cellules individuelles. En outre, de nombreuses chambres miniatures peuvent être disposés dans un format de réseau, ce qui permet l&#39;analyse de plusieurs cellules à la fois, étant donné que les instruments optiques appropriés sont utilisés pour la surveillance. Nous avons déjà utilisé la plate-forme pour les études de preuve de concept pour analyser les protéines intracellulaires, des enzymes, des cofacteurs et des seconds messagers manière quantifiable soit relative ou absolue.

Notre plate-forme est capable d&#39;analyser une série de intracellulaire ainsi que des molécules sécrétées présentes dans ou produit par des cellules individuelles. Ici, nous aimerions vous présenter les différentes études d&#39;exemple pour souligner la variété des tests possibles. Nous donnerons un exemple pour une enzyme sécrétée (figure 5a) ainsi que d&#39;une enzyme intracellulaire (Figure 5b) et de la protéine (Figures 5c et d). Pour d&#39;autres...

Dans cet article, nous présentons une puce microfluidique pour l&#39;analyse d&#39;une seule cellule. Il permet la quantification des protéines intracellulaires, des enzymes, des cofacteurs, et des seconds messagers à l&#39;aide de dosages ou des dosages immunologiques par fluorescence.

Une puce microfluidique pour l&#39;analyse chimique polyvalente de cellules isolées

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'analyser des lysats de cellules uniques à l'aide de tests de fluorescence ou d'immunodosages. Cela est réalisé en premier lieu en créant un dispositif microfluidique et en recouvrant la chambre interne d'anticorps. Ensuite, des cellules individuelles sont immobilisées dans les pièges et exposées à divers réactifs afin de provoquer une réponse cellulaire dans une deuxième étape.Une valve en forme d'anneau est rapidement fermée et le tampon de lyse est fait circuler à travers le dispositif. La valve en anneau est ensuite ouverte brièvement, ce qui permet la lyse des cellules à l'intérieur de la microchambre, autorisant ainsi les protéines libérées de se lier aux anticorps à une concentration élevée en raison du faible volume. Ensuite, la valve en forme d'anneau est ouverte.La chambre est lavée et les réactifs de détection sont introduits dans la microchambre fermée. L'augmentation de l'intensité de fluorescence est surveillée au fil du temps à l'aide d'un microscope à fluorescence ; les résultats démontrent la capacité de ce système à détecter de manière quantitative et fiable un analyte d'intérêt libéré par des cellules individuelles

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Droplet plates-formes basées microfluidiques sont des candidats prometteurs pour l'expérimentation à haut débit car ils sont capables de générer picolitres, auto-compartimentées vaisseaux moindre coût aux cadences kHz. Grâce à l'intégration rapide, sensible et haute résolution de fluorescence des méthodes spectroscopiques, les grandes quantités de données générées au sein de ces systèmes peut être efficacement extraite, exploité et utilisé.

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La puce microfluidique clinique est une technique d’analyse biomédicale importante qui simplifie le prétraitement des échantillons de sang cliniques des patients et colore immunofluorement les cellules tumorales circulantes (CTC) in situ sur la puce, permettant la détection et l’identification rapides d’un seul CTC.

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Découvrez une méthode d'analyse de cellules isolées par puce microfluidique pour la quantification des protéines intracellulaires. Cette technique utilise des immunoessais fluorescents pour étudier l'hétérogénéité cellulaire avec précision.

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