Une puce microfluidique pour l'analyse chimique polyvalente de cellules isolées

L'objectif général de l'expérience suivante est d'analyser des lysats de cellules uniques à l'aide de tests de fluorescence ou d'immunodosages. Cela est réalisé en premier lieu en créant un dispositif microfluidique et en recouvrant la chambre interne d'anticorps. Ensuite, des cellules individuelles sont immobilisées dans les pièges et exposées à divers réactifs afin de provoquer une réponse cellulaire dans une deuxième étape.

Une valve en forme d'anneau est rapidement fermée et le tampon de lyse est fait circuler à travers le dispositif. La valve en anneau est ensuite ouverte brièvement, ce qui permet la lyse des cellules à l'intérieur de la microchambre, autorisant ainsi les protéines libérées de se lier aux anticorps à une concentration élevée en raison du faible volume. Ensuite, la valve en forme d'anneau est ouverte.

La chambre est lavée et les réactifs de détection sont introduits dans la microchambre fermée. L'augmentation de l'intensité de fluorescence est surveillée au fil du temps à l'aide d'un microscope à fluorescence ; les résultats démontrent la capacité de ce système à détecter de manière quantitative et fiable un analyte d'intérêt libéré par des cellules individuelles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'analyse de cellules uniques.

En particulier, il manquait des investigations systématiques sur la réponse cellulaire aux variations de l'environnement chimique. Nous pouvons observer des régulations à la hausse ou à la baisse de molécules intracellulaires en conséquence d'un stimulus chimique. Cette technique présente deux avantages principaux.

La première consiste à exposer les cellules immobilisées à un environnement chimique défini, constant ou changeant périodiquement. Deuxièmement, nous pouvons effectuer une analyse hautement sensible et spécifique de l'échantillon sans aucune contamination croisée ni perte d'analytes due au transport. Pour commencer, fabriquez les trois différents wafers maîtres en SU-8 comme décrit dans le protocole textuel accompagnant.

Un sera utilisé pour créer la couche fluidique, un pour la couche de commande et un troisième pour le tampon de microcontact. Ensuite, fabriquez les puces microfluidiques en commençant par la préparation d'un mélange de PDMS et d'un agent de réticulation dans un rapport de 10 à 1. Mélangez vigoureusement les deux composants et dégazez la solution pendant 30 minutes, ou jusqu'à ce que le mélange soit exempt de bulles.

Ensuite, placez la plaquette dans la couche de commande à l'intérieur d'une boîte de Pétri et fixez-la au fond à l'aide de ruban adhésif. Versez environ 50 grammes de PDMS par-dessus afin de former une couche de quatre à cinq millimètres d'épaisseur, puis placez la plaquette pendant au moins deux heures dans un four à 80 degrés Celsius afin de garantir une réticulation complète du PDMS. Répétez la même procédure pour la plaquette de micro-impression par contact, mais utilisez environ 20 grammes de PDMS au lieu de 50, ce qui donne également une couche de PDMS de quatre à cinq millimètres d'épaisseur.

Pour préparer la couche inférieure, appliquez par rotation une couche de PDMS de 40 micromètres d'épaisseur sur la tranche avec la couche microfluidique. Utilisez une vitesse de rotation de 2000 tr/min pendant 60 secondes. Durcissez la couche de PDMS dans une étuve pendant une heure à 80 degrés Celsius, une fois que toutes les parties sont durcies.

Retirez la couche de contrôle du wafer et découpez-la en morceaux à l’aide d’une lame de rasoir. Ensuite, percez des trous de raccordement pour la pression à l’aide d’une poinçonneuse biopsique d’un millimètre de diamètre et recouvrez les canaux avec du ruban adhésif pour le stockage. Puis, retirez le PDMS situé au-dessus du wafer de micro-impression par contact et préparez des tampons de la taille de la zone de la chambre.

Les conserver sans poussière dans un tiroir jusqu'à utilisation. Ensuite, placer la plaquette recouverte par centrifugation et la couche de contrôle de quatre à cinq millimètres d'épaisseur dans un nettoyeur à plasma. Exposer les pièces à 18 watts pendant 45 secondes en utilisant un plasma d'oxygène à 0,75 millibar.

Après le traitement au plasma, alignez rapidement les deux couches sous un microscope doté d'une grande distance de travail. Ajoutez un peu de PDMS supplémentaire autour des pièces supérieures placées afin de faciliter le retrait du PDMS de la plaquette. Ensuite, placez la plaquette dans un four à 80 degrés Celsius pendant au moins une heure.

Une fois durci, utilisez un scalpel pour retirer soigneusement le PDMS de la plaquette et découper les puces afin de percer des trous d'accès pour les raccordements fluidiques à l'aide d'une aiguille à biopsie de 1,5 millimètre. En outre, créez un réservoir dans la puce en coupant la partie supérieure d'une pointe de pipette de 200 microlitres et en utilisant un excès de PDMS partiellement durci. Collez-la sur le dessus.

Ensuite, polymériser la puce au four à 80 degrés Celsius pendant au moins une heure. Commencez par nettoyer une lame de verre et les pièces en PDMS. Nettoyez une lame de verre avec du savon.

Rincez-le avec de l'eau distillée, puis à nouveau avec de l'éthanol. Séchez la lame à l'aide d'un courant d'azote. Utilisez du ruban adhésif pour éliminer toute saleté et toutes particules de poussière du PDMS.

Ensuite, placez la pièce en PDMS et le verre nettoyé. Faites-les glisser dans le nettoyeur à plasma pendant 45 secondes à 18 watts afin d'assurer une liaison étanche, puis placez la puce sur une plaque chauffante pendant cinq minutes après le traitement au plasma. Après la liaison, coupez la partie inférieure de quelques embouts de pipette de 200 microlitres. Remplissez-les avec 10 à 15 microlitres de PBS filtré contenant 4 % de BSA et insérez-les dans les entrées du dispositif.

Ensuite, utilisez des pointes coupées avec 10 à 15 microlitres de PBS ajoutés et placez-les dans les canaux de contrôle. Puis, insérez les puces dans la centrifugeuse et centrifugez-les à 800 ×g pendant cinq minutes afin de remplir les canaux de liquide. Si de l'air persiste dans l'un des canaux, répétez cette étape jusqu'à ce que les canaux soient complètement remplis.

Incuber la solution de blocage pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Puis rincer la solution de la couche fluide avec du PBS à un débit de 10 microlitres par minute. À l’aide d’une pompe à seringue, l’appareil est désormais prêt pour les expériences cellulaires afin de pré-imprimer la lame de verre pour les dosages immunologiques ; incuber les matrices de micro-impression par contact en PDMS avec 0,5 % de BSA biotinylée dans une boîte de Pétri propre.

Après une demi-heure, nettoyez soigneusement et rapidement les tampons avec de l'eau distillée et séchez le tampon sous un flux d'azote. Une fois sec, placez rapidement les tampons sur une lame de verre propre pour déposer l'albumine sérique bovine biotinylée selon le motif désiré. N'effectuez aucun déplacement du tampon après son placement et vérifiez qu'il est bien en contact avec la lame de verre.

S'il ne l'est pas légèrement, tapotez le poinçon, mais n'appuyez pas fortement. Ensuite, placez le poinçon ainsi que la partie supérieure de la puce microfluidique dans la chambre à plasma et exposez-les au plasma d'oxygène à 18 watts pendant 45 secondes. Après le traitement au plasma, retirez le poinçon de la lame de verre.

Respirer sur la surface rendra le motif visible. Aligner les micro-chambres sur la surface imprimée. Une fois l'alignement effectué, placer la puce sur une plaque chauffante à 50 degrés Celsius pendant 30 minutes afin de bloquer la surface restante, introduire une solution de BSA stérile filtrée à 4 % dans du PBS dans la puce à l’aide d’une centrifugeuse comme indiqué précédemment, incuber la micropuce pendant au moins 30 minutes, puis éliminer la solution de la couche fluide avec du PBS à un débit de 10 microlitres par minute.

À l’aide d’une pompe à seringue, utilisez la puce directement ou conservez-la jusqu’à deux semaines à quatre degrés Celsius dans une boîte humide. Ensuite, créez une surface de liaison entièrement fonctionnelle en introduisant de l’avadon dans du PBS dans le réservoir. Faites circuler la solution afin de faire passer l’avadon à travers les canaux fluidiques par la suite.

Rincez soigneusement le réservoir et rincez les canaux avec du PBS. Ajoutez ensuite de la protéine G dans le réservoir et faites-la circuler à travers les canaux. Éliminez l'excès de protéine G en rinçant le réservoir et la puce avec du PBS.

Ensuite, ajoutez l'anticorps d'intérêt dans le réservoir et faites-le circuler à travers les canaux. Arrêtez ensuite l'écoulement pour permettre la liaison, puis rincez les canaux avec du PBS. Des analogues marqués de manière fluorescente peuvent être utilisés pour vérifier la qualité du processus d'impression avant d'introduire les cellules dans les canaux. Récupérez les cellules adhérentes, telles que les cellules HEK 293 illustrées ici, à l'aide d'un tampon de dissociation sans enzyme, puis filtrez-les afin de réduire le nombre d'agrégats cellulaires. Une fois filtrées, chargez-les dans une seringue.

À raison de 300 000 cellules par millilitre, chargez les cellules sur la puce en utilisant un flux direct sur la pompe à seringue pendant environ trois minutes à un débit de 10 à 20 microlitres par minute pour des cellules adhésives telles que celles-ci, afin d'éviter l'attachement non spécifique des cellules lorsque les pièges sont remplis ; fermez ensuite les chambres en pressurisant la couche supérieure avec trois bars. Examinez ensuite les chambres à l’aide d’un microscope. Si de nombreuses cellules se sont fixées non spécifiquement à la surface interne des chambres, ouvrez-les rapidement et tentez de les éliminer par lavage avec un tampon de dissociation cellulaire à un débit de 10 à 30 microlitres par minute.

Pour le dosage de la glucose-6-phosphate déshydrogénase ou G6PDH, ajouter 2 millimolaires de glucose, 6-phosphate 0,5 millimolaire et un ADP 0,5 unités par millilitre sur des puces DIA ainsi que 0,3 millimolaire de RIN à un tampon de lyse et s'assurer qu'il est bien mélangé. Une fois les canaux dégagés, faire passer le tampon de lyse G6PDH à travers la puce à un débit de 30 microlitres par minute. Pendant l'écoulement du tampon de lyse, ouvrir et fermer rapidement les chambres, en les laissant ouvertes pendant 500 millisecondes afin de permettre au tampon de lyse d'entrer immédiatement dans la chambre ; commencer alors la surveillance de la réaction cinétique juste après la lyse.

Dans cet exemple, un produit fluorescent peut être surveillé au fil du temps. On voit ici un réseau de chambres remplies de colorant alimentaire orange, puis fermées en pressurisant la couche de commande située au-dessus des microchambres. Après la fermeture des chambres, un colorant alimentaire vert a été lavé à travers les canaux afin de montrer l'étanchéité des chambres.

Chaque chambre contient un volume de seulement 625 picolitres de fluide, ce qui maintient la concentration des molécules libérées par les cellules lys suffisamment élevée pour l'analyse. De plus, les valves peuvent être ouvertes et fermées de manière à éliminer toute contamination croisée entre les chambres. Dans ces chambres, il est possible de mesurer des analytes tels que la quantité de lysosome libérée par une seule cellule U 9 37 activée par le PMA, qui catalyse enzymatiquement la production d'une molécule fluorescente à l'intérieur de la chambre.

Les lignes vertes représentent la variation de l'intensité de fluorescence au fil du temps pour les chambres occupées par une cellule. L'intensité de fluorescence pour une chambre sans cellules, représentée par la ligne pointillée noire, est également indiquée. À titre de comparaison, cet essai montre l'effet d'une molécule toxique sur l'intégrité membranaire en mesurant une enzyme intracellulaire, la G6PDH.

La ligne noire représente les échantillons témoins sans influence toxique, tandis que la ligne orange représente les cellules influencées par la toxine indiquée. Voici un exemple de dosage immuno-enzymatique pour une protéine intracellulaire. Des anticorps GFP anti-GFP ont été immobilisés à la surface et, une fois les cellules lysées, la cinétique de liaison des protéines GFP a été visualisée à l’aide de la microscopie TURBIDIMÉTRIQUE.

Le temps 0,1 marque l'ajout du tampon de lyse. À l'instant 0,2, la GFP commence à s'accumuler à la surface, ce qui indique que la lyse cellulaire s'est produite et que la GFP s'est diffusée vers la surface. La liaison de la GFP aux anticorps est terminée à l'instant 0,3. Dans cet exemple final, le GDH libéré s'est lié aux anticorps de capture à la surface, puis des anticorps de détection couplés à la peroxydase de raifort (HRP) ont été ajoutés.

Une fois que tous les anticorps de détection non liés ont été éliminés par lavage, le réactif de détection a été introduit et la réaction a été laissée se poursuivre pendant un certain temps. Voici une comparaison de la quantité de GA DH précédemment intracellulaire en quantités animales entre les cellules U 9 37 et HEC 2 93 mesurée à l’aide de cette méthode. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des puces microfluidiques, de la modification de la surface pour permettre des immunodosages, et enfin, de l’utilisation de l’appareil pour l’analyse de cellules individuelles.

Cette méthode peut être utilisée pour aider à répondre à de nombreuses questions fondamentales dans le domaine de la biologie unicellulaire.