Perles de séparation et les cellules dans des dispositifs microfluidiques multi-canal en utilisant diélectrophorèse et à flux laminaire

L'objectif général de cette procédure est de manipuler des cellules et des billes à l'intérieur de dispositifs microfluidiques en utilisant la diélectrophorèse ou DEP à l'aide de cartes de circuits imprimés ou PCB. Cela est réalisé en concevant et en préparant tout d'abord les électrodes PCB et les canaux microfluidiques. La deuxième étape de la procédure consiste à préparer l'assemblage microfluidique PCB ainsi que les solutions de billes et de cellules.

La troisième étape de la procédure consiste à remplir les canaux avec un milieu de faible conductivité, puis à charger les billes et les cellules. La dernière étape de la procédure est de relier l'assemblage de circuit imprimé à l'amplificateur de puissance et au générateur de fonctions, puis d'initier la DEP. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant la séparation et la manipulation de cellules et de billes dans des dispositifs microfluidiques grâce à l'utilisation de la DEP.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car l'utilisateur doit comprendre les principes de la DEP afin de concevoir un électrode efficace fonctionnant avec un dispositif microfluidique pour la manipulation des cellules ou des billes souhaitées. En revanche, l'utilisation de circuits imprimés (PCB) comme électrodes rend la manipulation des cellules et des billes dans des dispositifs microfluidiques accessible à divers domaines scientifiques. La première étape de cette procédure consiste à concevoir les électrodes en circuit imprimé, ou PCB, avec la géométrie souhaitée afin de générer un champ électrique non uniforme.

Lorsque la conception est terminée, commandez les puces d'électrodes de circuit imprimé personnalisées auprès d'un fabricant commercial. Une fois que le circuit imprimé personnalisé est arrivé, ouvrez-le et inspectez-le pour cette démonstration. Le circuit imprimé mesure 8,4 centimètres de long sur 2,1 centimètres de large.

Les électrodes métalliques ont une largeur de cinq millimètres. Dans cet exemple, les électrodes comportent deux longues bandes métalliques et deux régions transversales de 4,5 millimètres de longueur où les électrodes sont entrelacées. Ces régions entrelacées génèrent un champ électrique fort et non uniforme afin d'établir une connexion entre le stimulateur et l'électrode du circuit imprimé.

Placer un fil de calibre 16 à l'extrémité de l'électrode. Utiliser un fer à souder chaud pour maintenir le fil en place sur la zone métallique du circuit imprimé. Cela chauffe le fil.

Tenez le fil de soudure contre le fil chauffé et laissez une petite quantité de soudure pénétrer dans le fil. Une fois le fil rempli de soudure, retirez le fer à souder tout en maintenant le fil en place pendant que la soudure refroidit. Répétez le processus de soudage pour l'autre connexion électrique sur le circuit imprimé.

L'étape suivante consiste à préparer des canaux microfluidiques avec le motif de branchement souhaité. À l'aide de techniques standard de microfabrication, créez un moule maître pour définir les canaux en utilisant une plaquette de silicium et une résine photosensible SU-8. Ce moule maître comporte un canal d'entrée et trois canaux cibles.

La largeur des canaux est de 100 micromètres et la hauteur des canaux est de 27 micromètres. Une fois le moule maître créé, mélanger l'élastomère polyméthyl LAANE ou PDMS avec un agent de réticulation selon un rapport massique de 10 à 1 pendant cinq minutes. Verser le PDMS liquide sur le moule maître SU huit préfabriqué et éliminer les bulles d'air en exposant le PDMS liquide au vide pendant trois minutes.

Répétez le processus sous vide si nécessaire afin d'éliminer complètement toutes les bulles. Un courant de gaz azote peut être utilisé pour éliminer les bulles excédentaires si besoin. Durcissez le PDMS dans une étuve à 70 degrés Celsius pendant deux heures.

Utilisez une lame de rasoir pour retirer le laboratoire P-D-M-S-S avec les canaux microfluidiques du wafer. Veillez à ne pas casser le wafer en gardant l'espace des canaux vers le haut. Utilisez un poinçon biopsique pour percer des trous permettant l'introduction de fluides et de cellules dans le dispositif microfluidique. Coupez.

Tout excès de PDMS. Inspectez le dispositif microfluidique pour vous assurer qu’il est exempt de poussière et de débris. Utilisez du ruban adhésif 3M Scotch Magic pour nettoyer le PDMS.

Exposer les canaux en PDMS et une lame de couverture numéro zéro, d'une épaisseur comprise entre 80 et 130 micromètres, au gaz de plasma pendant 1,5 minute. Retirer le dispositif en PDMS et la lame de couverture du nettoyeur à plasma dans une boîte de Pétri ; réaliser une liaison par plasma en plaçant les canaux microfluidiques en PDMS face vers le bas sur la lame de couverture. Chauffer l'ensemble microfluidique sur une plaque chauffante réglée à 100 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes. La dernière étape dans la préparation du dispositif microfluidique consiste à positionner les canaux en PDMS et la lame de couverture au-dessus des électrodes du circuit imprimé (PCB).

Commencez par déposer environ 10 microlitres d'huile minérale sur la carte PCB. Afin d'assurer un bon contact entre la carte PCB et la lame de couverture, placez l'ensemble du canal microfluidique, comprenant la lame de couverture, sur la carte PCB huilée, côté lame de couverture. En contactant délicatement l'huile, appuyez doucement sur l'ensemble microfluidique pour garantir un contact optimal et réduire au minimum les bulles d'air, qui pourraient nuire à la visualisation des cellules et des billes.

Une autre étape importante consiste à préparer le mélange de milieu à faible conductivité, composé de 8,5 % de saccharose et de 0,3 % de glucose (poids/volume) dans de l'eau déionisée. Le dispositif microfluidique est désormais prêt à l'emploi : à l'aide d'une pipette, remplissez chaque canal microfluidique avec 15 à 20 microlitres du milieu à faible conductivité, si nécessaire. Utilisez une aspiration sous vide pour éliminer les bulles d'air présentes dans les canaux.

L'étape suivante consiste à introduire les particules de test dans le dispositif microfluidique. Cette démonstration utilise une suspension de 550 billes de polystyrène par microlitre de milieu à faible conductivité, car les billes peuvent se déposer avec le temps ; suspendez donc les billes par agitation. Ensuite, à l’aide d’une pipette, introduisez 200 microlitres de la suspension de billes de polystyrène dans le canal.

L'étape suivante consiste à préparer les électrodes, à relier la sortie d'un générateur de fonctions à l'entrée d'un amplificateur de puissance CA, puis à connecter la sortie de l'amplificateur aux fils des électrodes. Recouvrir tous les fils électriques et les surfaces du dispositif avec du ruban isolant afin de protéger les utilisateurs d'une éventuelle exposition aux chocs électriques.

Régler le générateur de fonctions pour produire un signal sinusoïdal de sortie compris entre un et 1,5 mégahertz. Démarrer la DEP afin d'entamer le tri des cellules et des billes dans ce dispositif. Le canal d'entrée se trouve à droite, et les trois canaux cibles se séparent au niveau du jonction trifurquée.

Les électrodes PCB correspondent aux bandes noires sans écoulement laminaire et sans DEP. Les billes sont essentiellement stationnaires lors de l'initiation du DEP, mais en l'absence d'écoulement. Les billes migrent vers les électrodes PCB et s'éloignent de l'espace entre les électrodes lorsque l'écoulement laminaire est activé.

Mais lorsque le DEP est désactivé, les billes circulant dans les canaux d'entrée sont réparties entre les trois canaux cibles. Lorsque le DEP est activé et que l'écoulement laminaire est en marche, les billes sont dirigées de manière à ne circuler que dans le canal central. Dans les vidéos suivantes, le dispositif microfluidique a été tourné au-dessus des électrodes PCB, ce qui a entraîné un changement d'orientation des canaux.

En ce qui concerne les électrodes de PCB. Le canal d'entrée, qui était auparavant perpendiculaire aux électrodes de PCB, est désormais presque parallèle aux électrodes lorsque l'écoulement laminaire est activé. Mais en l'absence de DEP, les billes pénètrent également dans les trois canaux cibles.

Lorsque la DEP est initiée, les billes s'approchent du point de trifurcation et la force de DEP attire les billes dans le canal latéral situé au-dessus de l'électrode. Cette série d'images dans la vidéo montre un mélange de cellules d'adénocarcinome du côlon humain ou cellules HT 29 et de billes fluorescentes dans le dispositif microfluidique. Sur cette image DIC, la flèche ouverte indique la direction de l'écoulement laminaire, et les canaux sont délimités par des lignes en pointillés.

Les électrodes métalliques réfléchissantes apparaissent comme une bande claire en arrière-plan ; la microscopie à contraste interférentiel (DIC) est utilisée pour visualiser les billes en cours d'émission lumineuse. Intensité de l'échelle. Les images permettent de rendre les cellules plus visibles.

Cette figure est l'identique de l'autre image, sauf qu'elle est présentée sous forme d'image d'intensité en échelle de luminosité, afin de visualiser aussi bien les cellules que les billes. Les électrodes métalliques réfléchissantes apparaissent sous forme de bandes jaunes et vertes sur cette figure. Avec le DEP, les billes sortent par le canal droit, comme indiqué sur l'image DIC, tandis que les cellules HT29 sortent par les canaux central et gauche, comme montré sur l'image en échelle de luminosité avant l'activation du DEP. Une solution mixte de cellules et de billes s'écoule depuis un canal d'entrée vers trois canaux cibles distincts.

Après avoir induit la DEP, les billes et les cellules sont activées sélectivement vers des canaux distincts. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de commencer à mettre en œuvre l'électrophorèse à cadran pour la manipulation de cellules et de billes dans des dispositifs microfluidiques.