Imagerie cellulaire Viabilité sur Echafaudages non transparents - Utilisation de l'exemple d'un roman en maille de titane Implant

L’objectif général de cette expérience est de visualiser la microstructure et l’adhésion cellulaire d’un implant de noyau de titane tricoté non transparent, à l’aide de techniques d’imagerie fluorescente. Cette méthode fait progresser l’analyse de l’ingénierie tissulaire avec des échafaudages non transparents. L’un des avantages de cette technique est que l’on peut suivre la viabilité cellulaire ainsi que la prolifération sur l’échafaudage avec une culture à l’air libre.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la coloration fluorescente et, plus tard, la visualisation sont difficiles. Les propriétés individuelles de l’échafaudage, telles que la taille des pores, peuvent affecter le timing et/ou la fluorescence de l’échafaudage peut affecter le choix des fluorophores que vous utilisez. Placez jusqu’à cinq échafaudages de six ou sept millimètres d’épaisseur dans un tube de 50 millilitres et lavez-les à l’eau trois fois pendant 20 minutes par lavage.

Faites-le à température ambiante avec une agitation douce. Ensuite, lavez les échafaudages dans 30 millilitres de solution Triton X-100 à 1 % dans les mêmes conditions. Ensuite, effectuez deux autres lavages à l’eau.

Maintenant, sonicez séquentiellement les échafaudages avec un réactif à 99 % d’acétone, à 99 % d’isopropanol et à 99 % d’éthanol. Effectuez chaque étape de sonication deux fois pendant cinq minutes par sonication. Ensuite, sonisez l’échafaudage trois fois de plus dans l’eau pendant un total de 15 minutes.

Terminez en plaçant les échafaudages sur un mouchoir non pelucheux et en les faisant sécher à l’air libre pendant la nuit à température ambiante. Le lendemain, autoclavez les échafaudages pendant 15 minutes à 121 degrés Celsius et 15 PSI. Pour confirmer que le nettoyage a fonctionné, utilisez la fluorescence indirecte.

Chargez un puits d’une plaque de 12 puits avec 2000 microlitres de la solution de coloration soufre-rhodamine B fraîchement préparée, et à l’aide d’une pince, transférez un échafaudage dans ce puits. Ensuite, capturez des images négatives de l’échafaudage à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un ensemble de filtres cubiques LED RFP et recherchez des impuretés à fort grossissement. À l’aide de l’enceinte de biosécurité, transférez les échafaudages propres dans les puits d’une plaque de 24 puits.

Ajoutez 500 microlitres de milieu de culture à 37 degrés Celsius dans chaque puits et laissez tremper l’échafaudage pendant 15 minutes. Pendant ce temps, préparez 500 000 cellules SEP1 infectées par Ad-GFP par 1 millilitre de milieu. Après 15 minutes, aspirez complètement le fluide des échafaudages et asseyez-les avec 100 microlitres de suspension de cellule.

Ensuite, incubez-les pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après la brève incubation, ajoutez 500 microlitres supplémentaires de milieu de culture et incubez les échafaudages pendant 24 heures. Le lendemain, changez le milieu de culture pour éliminer les cellules non adhérentes.

Ensuite, évaluez l’adhérence et la propagation des cellules sur les échafaudages, à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un ensemble de filtres cubiques LED GFP. Pour une coloration morte vivante, plaquez d’abord les cellules SEP1 sur l’échafaudage comme précédemment. Après 24 à 48 heures, aspirez complètement le milieu de culture et lavez les échafaudages avec du DPBS pendant cinq minutes à température ambiante.

Maintenant, colorez les cellules à l’aide d’un milieu de culture contenant Calcein AM, Hoechst 33342 et l’homodimère Ethidium. Ces trois fluorophores sont tous sensibles à la lumière, il est donc essentiel de garder les cellules dans l’obscurité pour aller de l’avant. Incuber les cellules pendant 30 minutes avec les fluorophores pour obtenir une répartition uniforme dans tout l’échafaudage.

Les caractéristiques spécifiques de l’échafaudage affecteront ce temps d’incubation. Après l’incubation, lavez les cellules trois fois avec du DPBS en utilisant un millilitre par puits. Exécutez chaque lavage pendant cinq minutes à température ambiante.

Immédiatement après les lavages, documentez les échafaudages à l’aide de la microscopie à fluorescence. Pour mesurer la viabilité cellulaire au fil du temps, utilisez les mesures de conversion resazurin. Tout d’abord, aspirez complètement le milieu de culture des cellules SEP1 placées dans une plaque de 24 puits et lavez les cellules avec 500 microlitres de DPBS par puits.

Ensuite, couvrez les cellules avec le volume requis de solution de travail stérile de résazurine et incluez un puits contenant uniquement de la résazurine. Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant environ 30 minutes. Après l’incubation, transférez 100 microlitres du surnageant conditionné de chaque puits dans une plaque de 96 micropuits pour mesurer sa fluorescence comme décrit dans le protocole de texte.

Pour une culture plus poussée, retirez la résazurine du puits et lavez-la trois fois avec un millilitre de DPBS. Effectuez chaque lavage pendant cinq minutes à température ambiante. Après le troisième lavage, ajoutez 500 microlitres de milieu de culture dans chaque puits de cellules et poursuivez leur incubation pour d’autres mesures temporelles.

À l’aide d’une coloration fluorescente indirecte, les impuretés de pré-nettoyage ont été documentées afin d’optimiser le protocole de nettoyage. Une réduction significative de la charge de substance sur l’échafaudage montre l’efficacité du protocole de nettoyage décrit. Les implants successifs utilisés pour le traitement de l’arthroplastie sont déterminés par des événements qui se déroulent à l’interface du matériau cellulaire.

Après 24 heures d’adhérence avec les échafaudages, les cellules SEP1 s’étaient fixées. Des fluorophores ont ensuite été appliqués pour examiner la mort et la prolifération cellulaires sur une période de temps sur les échafaudages. La coloration des cellules mortes vivantes a montré une coloration nucléaire bleue avec une fluorescence rouge dans les cellules mortes et une fluorescence verte dans les cellules viables.

De plus, la viabilité cellulaire sur l’échafaudage a été quantifiée à l’aide du test de conversion de la résazurine. Pendant deux semaines, des données ont été recueillies sur des cellules cultivées avec ou sans échafaudages. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’ajuster les fluorophores que vous utilisez à l’échafaudage et au microscope dont vous disposez.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes, comme la coloration immunofluorescente, peuvent être appliquées afin de visualiser la présence de protéines, ou l’activation de cascades de signalisation. L’implication de cette technique s’étend à la thérapie de l’arthroplastie car l’interaction de la face cellulaire avec le tissu environnant in vivo définira sa fonction et sa durabilité.