Une peau pleine de défauts modèle pour évaluer la vascularisation des biomatériaux In Vivo

L’objectif global de cette procédure est de visualiser les vaisseaux sanguins dans des constructions issues de l’ingénierie tissulaire. Ceci est accompli en créant un défaut de peau complet standardisé sur le dos des souris. Ensuite, un échantillon du matériau issu de l’ingénierie tissulaire est implanté dans le défaut cutané.

Ensuite, à la fin du temps d’observation, le matériau est implanté et placé dans un dispositif d’éclairage trans. Enfin, des photos haute résolution du réseau vasculaire sont acquises à l’aide d’un appareil photo numérique standard. En fin de compte, le réseau de navires est analysé par segmentation numérique et quantification à l’aide du logiciel Vest egg tool.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie, la tomographie par ordinateur ou l’imagerie par résonance magnétique, est qu’elle permet de visualiser et de quantifier efficacement les processus vasculaires dans les biomatériaux en concentrant tous les nouveaux vaisseaux fonctionnels. Cette méthode peut donner un aperçu de la vascularisation des matériaux de remplacement dermique. Il peut également être appliqué à d’autres organismes modèles ou pour étudier la vascularisation dans d’autres organes.

Pour commencer, utilisez des poinçons de biopsie de 12 millimètres pour générer des échantillons d’échafaudages, tels que des matériaux de remplacement dermique à base de collagène bovin coupés en morceaux de maille ronde de tétain de 14 millimètres de diamètre à placer sous chaque échafaudage. Après avoir anesthésié une souris, vérifié la profondeur de l’anesthésie avec un pincement des orteils et enlevé la fourrure du dos selon le protocole textuel. Placez l’animal en position couchée et utilisez un stylo permanent à pointe fine pour marquer la ligne médiane du dos de la souris.

Définissez une zone d’excision qui n’est pas trop éloignée de manière coddy pour empêcher l’animal d’enlever l’échafaudage. À l’aide d’un poinçon de biopsie de 10 millimètres, créez des défauts bilatéraux ronds en forçant soigneusement le poinçon contre la peau. Pour délimiter la zone d’excision à l’aide d’une pince, soulevez doucement la peau marquée et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour inciser le long du cercle marqué.

En cas de saignement, utilisez de la gaze stérile pour comprimer soigneusement la zone afin de faire de la place pour le treillis du Titanic. Étendez la séparation de la peau et des tissus sous-jacents au bord de la plaie et ajoutez deux à quatre millimètres supplémentaires. Placez le treillis dans le défaut directement sur le lit de la plaie et sous les bords de la plaie.

Placez ensuite les échafaudages directement sur le grillage. Utilisez quatre à six nœuds simples pour suturer l’échafaudage, de sorte que les bords de la plaie adjacente laissent les bords légèrement au-dessus de l’échafaudage. Suturez ensuite un pansement transparent au-dessus des défauts pour protéger l’échafaudage tout en permettant de surveiller la zone de la plaie.

Evaluat, évaluer l’état général de l’animal au quotidien en surveillant l’activité motrice, le poids corporel, les signes de douleur, la tolérance au pansement et l’automutilation. Surveillez également la zone de la plaie pour détecter des saignements locaux et systémiques signifiants d’infection et la position du pansement. Après euthanasie de l’animal au moment souhaité.

Selon le protocole de texte, utilisez un marqueur permanent pour marquer le site d’excision qui comprend les échafaudages. À l’aide d’une paire de ciseaux ou d’un scalpel, inciser la peau le long des lignes marquées par une excision émoussée, détacher toute la peau, y compris les échafaudages et le treillis du tissu sous-jacent, placer un tissu tendu à l’envers dans une boîte de Pétri. Pour visualiser l’échantillon, placez-le sur un appareil d’éclairage trans

En mode macro, prenez des photos de l’ensemble des échafaudages et des zones de peau normale de taille égale et stockez les images au format TIFF pour une analyse numérique plus approfondie. Après avoir téléchargé le logiciel de l’outil ves EQ, ouvrez une image et sélectionnez une région d’intérêt pour l’analyse en appuyant sur la touche retour arrière. Appuyez ensuite sur inverser.

Pour visualiser le réseau vasculaire en blanc, choisissez l’image amélioration des vaisseaux filtre hystérésis seuillage chapeau transformation et calculez l’amélioration des vaisseaux dans toutes les étapes précédentes. Faites défiler l’écran pour effectuer un zoom avant ou arrière sur l’image. Segmentez la carte des navires en sélectionnant le premier seuil ou la couverture du navire afin que chaque pixel qui ressemble, même de loin, à un navire soit étiqueté comme un navire.

Appuyez sur calculer. Pour prévisualiser votre sélection, sélectionnez le deuxième seuil ou la couverture d’arrière-plan afin que seuls les pixels qui ressemblent particulièrement à des récipients soient étiquetés comme des récipients. Pour calculer la longueur des navires et la zone totale qu’ils couvrent, cliquez sur image, statistiques d’images et statistiques d’images binaires.

La meilleure estimation de la longueur des vaisseaux est de pré-amincir le réseau vasculaire à une largeur d’un pixel. Pour cela, rendez-vous sur les filtres morphologiques d’images et le squelettage avant le calcul. Le rapport entre la surface du navire et la longueur du navire donne une valeur pour la taille du navire dans la région d’intérêt.

Au besoin, éliminez les artefacts en sélectionnant uniquement les récipients d’intérêt. En cliquant sous le mode de sélection, appuyez sur la touche retour arrière pour copier les récipients sélectionnés dans une nouvelle image. Enfin, analysez la zone cutanée native selon les mêmes paramètres qu’un échafaudage, en attribuant une valeur de 100 % au tissu natif et reliez l’échafaudage à cette valeur.

Par exemple, si le pourcentage de pixels blancs est de 30 % dans le tissu normal et de 15 % dans l’échafaudage, cela représente une vascularisation de 50 % de la surface totale de l’échafaudage. Veuillez noter que les valeurs correspondent à l’ensemble de la zone de l’image. Par conséquent, il est nécessaire de le corriger à la zone de la région sélectionnée comme indiqué ici.

Deux semaines après l’implantation du tissu, la transillumination a permis de visualiser clairement des structures vasculaires allant jusqu’à 30 micromètres de largeur dans un échantillon de tissu entier comprenant à la fois du tissu natif et des échafaudages implantés. En utilisant la segmentation numérique pour analyser les niveaux de vascularisation des tissus explantés de 62,28 plus ou moins 8,6 % ont été observés dans l’échafaudage par rapport à la peau native. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de créer des défauts reproductibles de la peau complète et de fixer le biomatériau de manière fiable sur la plaie.

À la suite de cette procédure, le tissu expansé peut être utilisé pour des analyses plus approfondies telles que l’histologie ou l’expression de l’ARN et des protéines.