Génération de deux couleurs Antigène Microarrays pour la détection simultanée des IgG et IgM autoanticorps

L'objectif général de cette technique est de permettre un criblage rapide d'auto-anticorps de manière multiplexe. Cette méthode peut aider à identifier des questions clés dans le domaine de l'auto-immunité, telles que les auto-anticorps corrélés à différents états pathologiques. Les principaux avantages de cette technique sont qu'elle permet de cribler les auto-anticorps de façon parallèle, qu'elle nécessite seulement quelques microlitres de sérum et seulement quelques microgrammes d'antigène.

Pour générer des puces à micro-antigènes, commencez par diluer les antigènes dans du PBS jusqu'à une concentration finale de 2 milligrammes par millilitre. Configurez un micro-dispenseur avec neuf broches afin d'imprimer jusqu'à 162 antigènes uniques en double. Incluez les antigènes IgG et IgM dans la bibliothèque d'antigènes comme témoins positifs.

Inclure uniquement du PBS comme témoin négatif. Ajouter 20 microlitres de chaque antigène dans la plaque source de 384 puits en groupes qui reflètent la configuration de la tête d'impression. Couvrir la plaque source avec du papier d'aluminium et congeler la plaque à moins 80 degrés Celsius jusqu'au moment de l'impression des puces.

Nettoyez les broches solides pour microarray en les incubant dans un bain ultrasons avec de l'eau déionisée, trois fois pendant une minute chacune. Placez les broches dans un support pour les faire sécher. Ensuite, disposez les broches dans la tête d'impression du microarray.

Pour neuf broches, utilisez une configuration trois par trois. Ensuite, programmez le microdispenseur pour la séquence d'impression en définissant le nombre de broches sur la tête d'impression, le nombre de lames à imprimer, le nombre de zones par lame et le nombre de points répétés pour chaque antigène. En outre, programmez le microdispenseur pour effectuer une sonication des broches dans l'eau entre les différents groupes d'antigènes.

Ensuite, après avoir décongelé la plaque source, centrifuger celle-ci pendant une minute à 100 × g. Placer la plaque source à l'emplacement désigné dans le microdispenseur, puis retirer la section de feuille d'aluminium recouvrant le premier groupe d'antigènes à imprimer. Disposer les lames non imprimées sur la surface du microdispenseur et lancer le programme d'impression. Imprimer les lames à température ambiante avec l'humidité du microdispenseur réglée entre 55 et 60 %. Après que chaque groupe d'antigènes a été imprimé sur toutes les lames, mettre en pause le microdispenseur.

Couvrez les antigènes qui viennent d'être imprimés avec du papier d'aluminium pour éviter l'évaporation, puis découvrez le prochain groupe d'antigènes à imprimer. Ensuite, poursuivez le programme d'impression. Une fois tous les antigènes imprimés, recouvrez la plaque source avec un nouveau morceau de papier d'aluminium et placez-la au congélateur à moins 80 degrés Celsius.

Placer les lames imprimées dans une boîte à lames et la sceller sous vide. Les lames peuvent être utilisées le lendemain ou jusqu'à un mois plus tard. Pour sonder les puces à ADN avec des sérums dilués à l'aide de chambres d'incubation, insérer les lames dans des supports.

Ensuite, ajoutez 700 microlitres de tampon de blocage sur chaque surface de matrice. Placez le film adhésif par-dessus le cadre et transférez-le dans un récipient hermétique contenant un morceau de papier humide. Incubez ensuite les lames à quatre degrés Celsius sur un agitateur rotatif pendant toute la nuit.

Le lendemain, diluez les échantillons de sérum au 1/100 dans du tampon de blocage. Ensuite, aspirez la solution de blocage des puces et ajoutez 500 microlitres d'échantillon dilué sur chaque surface de puce. Puis recouvrez les puces d'un film adhésif et incubez à quatre degrés Celsius, sous agitation, pendant une heure.

Ensuite, aspirez les échantillons de sérum à partir des puces, puis rincez les surfaces des puces quatre fois avec du tampon de rinçage en versant le tampon sur les lames et en l'éliminant rapidement d'un geste sec. Utilisez 700 microlitres de tampon de blocage pour laver chaque surface de puce, puis incubez 10 minutes à température ambiante sous agitation. Ajoutez ensuite 500 microlitres d'anticorps secondaire dilué sur chaque surface de lame, et recouvrez-la d'un film adhésif.

Incuber les lames à quatre degrés Celsius avec agitation pendant 45 minutes. Après l'incubation, aspirer le mélange d'anticorps secondaire des lames et rincer quatre fois, comme vient d'être démontré. Ensuite, laver les lames avec 700 microlitres de tampon de dilution bloquant, trois fois pendant 10 minutes chacune.

Retirer les lames des supports, puis les placer dans un porte-lames métallique et les immerger dans du PBS. Incuber à température ambiante avec agitation orbitale pendant 20 minutes. Placer un porte-lames dans un récipient contenant de l'eau déionisée pendant 15 secondes.

Ensuite, placer la grille dans un nouveau récipient d'eau et incuber pendant encore 15 secondes. Pour sécher les lames, placer la grille à lames sur un adaptateur de plaque ELISA dans la centrifugeuse et centrifuger à 220 × g et à température ambiante pendant cinq minutes. Placer les lames dans une boîte hermétique à la lumière jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à être analysées.

Pour numériser les lames, utilisez un scanner de puces à ADN capable de détecter les signaux fluorescents SI trois et SI cinq. Déterminez les paramètres optimaux du tube multiplicateur, ou PMT, en effectuant une pré-numérisation d'une lame contenant toute la bibliothèque d'antigènes qui a été uniquement incubée avec les anticorps secondaires. Réglez les valeurs de PMT en appuyant sur le bouton du matériel afin que les signaux des IgG humaines sur le canal SI trois et ceux des IgM humaines sur le canal SI cinq présentent une intensité médiane de fluorescence soustraite du fond, ou MFIB, similaire, généralement de 40 000.

Ensuite, numérisez les lames expérimentales sur les deux canaux en appuyant sur le bouton de numérisation. Enregistrez les images des lames sur les deux canaux après chaque numérisation. À l'aide du bouton fichier, chargez la lame à analyser dans le logiciel de puces à ADN.

Ensuite, utilisez le bouton fichier pour charger la liste de puces à gènes, ou fichier GAL, qui contient la disposition de la puce, avec les identités des éléments de la puce. Placez le modèle de puce par-dessus l'image numérisée, de sorte que les éléments de la puce correspondent au modèle le plus précisément possible. Appuyez sur le bouton d'alignement pour aligner les éléments de tous les blocs avec le modèle.

Le logiciel calculera ensuite une MFI soustraite du fond pour chacun des antigènes. Enfin, utilisez le bouton fichier pour exporter les résultats sous forme de fichier texte, puis analysez les données conformément au protocole écrit. Sur cette figure, montrant des lames témoins positives et négatives, la lame négative est uniquement incubée avec les anticorps secondaires, tandis que la lame témoin positive est incubée avec le sérum d'un patient atteint de lupus érythémateux systémique.

Comme indiqué ici, le sérum témoin positif, dont on sait qu'il réagit contre riboP, se révèle contenir des anticorps IgM dirigés contre l'ADN simple brin et des anticorps IgG dirigés contre riboP. Des réponses linéaires ont été observées pour l'IgM à toutes les dilutions de sérum, et pour l'IgG jusqu'à une intensité de fluorescence moyenne (MFI) corrigée du bruit de fond d'environ 30 000. Dans cette expérience, la matrice est incubée avec un sérum humain provenant d'un patient atteint d'une vascularite cryoglobulinémique et présentant un facteur rhumatoïde documenté, qui correspond à un anticorps IgM dirigé contre l'IgG.

La caractéristique de l'IgG est jaune-vert en raison de la liaison de l'IgM présente dans le sérum du patient à l'IgG immobilisée sur le réseau. En utilisant uniquement des anticorps secondaires, aucune réactivité de l'IgM contre l'IgG déposée sur le réseau n'est observée. Ici, l'IgM et l'IgG de souris déposées sur le réseau ne sont détectées qu'avec des anticorps secondaires anti-souris dirigés respectivement contre l'IgM et l'IgG.

Cette figure montre l'alignement d'une grille modèle sur une image de réseau numérisée, à l'aide d'un logiciel d'analyse de puces à ADN. Une fois l'alignement effectué, les caractéristiques du réseau peuvent être analysées afin d'obtenir l'intensité médiane de fluorescence soustraite du fond pour chaque caractéristique. Une fois maîtrisée, la sonde des puces à antigènes peut être réalisée en quatre heures si elle est effectuée correctement.

Après cette procédure, d'autres techniques telles que le ELISA peuvent être réalisées afin de valider les résultats obtenus à partir des puces à micro-antigènes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment imprimer des puces à micro-antigènes, comment sonder des puces à micro-antigènes avec du sérum, et comment analyser des puces à micro-antigènes à l’aide d’un scanner. N’oubliez pas que le travail avec du sérum humain peut présenter des risques, et que des précautions universelles doivent être prises lors de l’exécution de cette procédure.