Génération de deux couleurs Antigène Microarrays pour la détection simultanée des IgG et IgM autoanticorps

L’objectif global de cette technique est de dépister rapidement les auto-anticorps de manière multiplexe. Cette méthode peut aider à identifier des questions clés dans le domaine de l’auto-immunité, telles que les auto-anticorps corrélés à différents états pathologiques. Les principaux avantages de cette technique sont que les auto-anticorps peuvent être criblés de manière parallèle, que seuls des microlitres de sérum sont nécessaires et que seuls des microgrammes d’antigène sont nécessaires.

Pour générer des microréseaux d’antigènes, commencez par diluer les antigènes dans du PBS jusqu’à une concentration finale de 2 milligrammes par millilitre. Configurez une configuration de micro-réseau avec neuf broches pour imprimer jusqu’à 162 antigènes uniques en double. Inclure les antigènes IgG et IgM dans la banque d’antigènes en tant que témoins positifs.

N’incluez le PBS qu’en tant que contrôle négatif. Ajoutez 20 microlitres de chaque antigène à la plaque source à 384 puits en groupes qui reflètent la configuration de la tête d’impression. Utilisez du papier d’aluminium pour couvrir la plaque source et congelez la plaque à moins 80 degrés Celsius, jusqu’à ce qu’elle soit prête à imprimer des matrices.

Nettoyez les broches solides de la micropuce en les incubant dans un bain de sonique avec de l’eau déminéralisée trois fois pendant une minute chacune. Placez les broches dans une grille pour les faire sécher. Disposez ensuite les broches dans la tête d’impression du microarray.

Pour neuf broches, utilisez une configuration trois par trois. Ensuite, programmez le microarrayer pour le tirage en réglant le nombre de broches sur la tête d’impression, le nombre de lames à imprimer, le nombre de tampons sur chaque lame et le nombre de points répliqués pour chaque antigène. De plus, programmez le microarrayer pour qu’il sonique les broches dans l’eau entre différents groupes d’antigènes.

Ensuite, après avoir décongelé la plaque source, centrifugez-la pendant une minute à 100 fois G.Placez la plaque source à l’endroit désigné dans le microarrayer, puis retirez la section de feuille qui recouvre le premier groupe d’antigènes à imprimer. Disposez les diapositives non imprimées sur la surface de l’arrayer et exécutez le programme d’impression. Imprimez les lames à température ambiante avec l’humidité réglée sur l’arrayer à 55 à 60 %Après l’impression de chaque groupe d’antigènes sur toutes les lames, mettez le microarrayer en pause.

Couvrez les antigènes qui viennent d’être imprimés avec une feuille pour éviter l’évaporation et découvrez le prochain groupe d’antigènes à imprimer. Ensuite, continuez le programme d’impression. Une fois que tous les antigènes ont été imprimés, couvrez la plaque source avec un nouveau morceau de papier d’aluminium et congelez-la à moins 80 degrés Celsius.

Placez les diapositives imprimées dans une boîte à diapositives et mettez-la sous vide. Les lames peuvent être utilisées le lendemain ou jusqu’à un mois plus tard. Pour sonder les microréseaux avec du sérum dilué à l’aide de chambres d’incubation, placez les lames dans des cadres.

Ajoutez ensuite 700 microlitres de tampon de blocage à chaque surface du réseau. Placez le film adhésif sur le cadre et transférez-le dans un récipient scellé avec un morceau de tissu humide. Ensuite, incubez les lames à quatre degrés Celsius sur un rocker pendant la nuit.

Le lendemain, diluez les échantillons de sérum de un à 100 dans un tampon de blocage. Ensuite, aspirez la solution de blocage des matrices et ajoutez 500 microlitres d’échantillon dilué à chaque surface de la matrice. Ensuite, couvrez les réseaux d’un film adhésif et incubez à quatre degrés Celsius, en le berçant pendant une heure.

Ensuite, aspirez les échantillons de sérum des matrices et utilisez un tampon de rinçage pour rincer les surfaces de la matrice quatre fois en versant le tampon sur les lames et en le retirant rapidement. Utilisez 700 microlitres de tampon de blocage pour laver chaque surface de la matrice et incubez 10 minutes à température ambiante avec bascule. Ensuite, ajoutez 500 microlitres d’anticorps secondaires dilués sur chaque surface de lame et utilisez un film adhésif pour la couvrir.

Incuber les toboggans à quatre degrés Celsius en les balançant pendant 45 minutes. Après l’incubation, aspirez le mélange d’anticorps secondaires des lames et rincez quatre fois, comme nous venons de le démontrer. Ensuite, lavez les lames avec 700 microlitres de tampon de dilution bloquant, trois fois pendant 10 minutes chacune.

Retirez les diapositives des cadres, puis placez-les dans un support à glissières en métal et plongez-les dans du PBS. Incuber à température ambiante avec agitation orbitale pendant 20 minutes. Placez une grille coulissante dans un récipient d’eau déminéralisée pendant 15 secondes.

Placez ensuite la grille dans un nouveau récipient d’eau et incubez pendant 15 secondes supplémentaires. Pour sécher les lames, placez le support de lames sur un adaptateur de plaque ELISA dans la centrifugeuse et faites-le tourner à 220 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes. Placez les diapositives dans une boîte étanche à la lumière jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour la numérisation.

Pour numériser les lames, utilisez un scanner à microréseau capable de détecter les signaux fluorescents SI trois et SI cinq. Déterminez les paramètres optimaux du tube multiplicateur, ou PMT, en pré-scannant une lame de bibliothèque d’antigènes complète qui n’a été sondée qu’avec des anticorps secondaires. Réglez les valeurs PMT utilisées en appuyant sur le bouton matériel de sorte que les caractéristiques IgG humaines sur le canal SI trois et les caractéristiques IGM humaines sur le canal SI cinq aient une intensité de fluorescence médiane similaire moins le bruit de fond, ou MFIB, qui est généralement de 40 000.

Ensuite, scannez les lames expérimentales sur les deux canaux en appuyant sur le bouton de balayage. Enregistrez les images des diapositives dans les deux canaux après chaque numérisation. À l’aide du bouton fichier, chargez la diapositive à analyser dans le logiciel de la puce à ADN.

Ensuite, utilisez le bouton fichier pour charger la liste des matrices de gènes, ou fichier GAL, qui contient la disposition de la puce, avec les identités des caractéristiques de la puce. Placez le modèle de réseau sur l’image numérisée, de sorte que les caractéristiques des tableaux correspondent le plus possible au modèle. Appuyez sur le bouton d’alignement pour aligner les entités de tous les blocs avec le modèle.

Le logiciel calcule ensuite une IMF moins le bruit de fond pour chacun des antigènes. Enfin, utilisez le bouton Fichier pour exporter les résultats sous forme de fichier texte et analysez les données selon le protocole texte. Dans cette figure, montrant des lames de contrôle positives et négatives, la lame négative n’est sondée qu’avec des anticorps secondaires, et la lame de contrôle positive est sondée avec le sérum d’un patient atteint de lupus érythémateux disséminé.

Comme indiqué ici, le sérum de contrôle positif, avec une réactivité connue au riboP, s’est avéré avoir des anticorps IgM contre l’ADN simple brin, et des anticorps IgG contre le riboP. Des réponses linéaires ont été observées avec des IgM sur toutes les dilutions sériques, et avec des IgG jusqu’à un MFI moins le bruit de fond d’environ 30 000. Dans cette expérience, la puce est sondée avec du sérum humain provenant d’un patient atteint de vascularite cryoglobulinémique, avec un facteur rhumatoïde documenté, qui est un anticorps IgM contre les IgG.

La caractéristique IgG est jaune-vert en raison de la liaison des IgM dans le sérum du patient aux IgG immobilisées sur la puce. En utilisant uniquement des anticorps secondaires, aucune réactivité IgM n’est observée contre les IgG repérées sur la puce. Comme illustré ici, les IgM et les IgG de souris repérées sur la puce ne sont détectées qu’avec des anticorps secondaires anti-souris contre les IgM et les IgG respectivement.

Cette figure montre l’alignement d’une grille de modèle sur une image de réseau numérisée, à l’aide d’un logiciel d’analyse de microréseaux. Une fois alignées, les caractéristiques du réseau peuvent être analysées pour obtenir l’intensité médiane de fluorescence moins le bruit de fond pour chaque caractéristique. Une fois maîtrisé, le sondage des puces à antigènes peut se faire en quatre heures s’il est fait correctement.

Suite à cette procédure, d’autres techniques telles que l’ELISA peuvent être réalisées afin de valider les résultats obtenus à partir des microréseaux d’antigènes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’imprimer des puces à antigènes, de sonder des puces à antigènes avec du sérum et de scanner des puces à antigènes avec un scanner. N’oubliez pas que travailler avec du sérum humain peut être dangereux et que des précautions universelles doivent être prises lors de l’exécution de cette procédure.