Name: Par électrochimiluminescence dosages pour îlots pancréatiques humains autoanticorps (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Découvrez le dosage par électrochimiluminescence pour détecter les autoanticorps des îlots pancréatiques humains. Cette méthode sensible et non radioactive permet de prédire le diabète de type 1 et d'autres maladies auto-immunes.

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Ce travail a été soutenu par les NIH grant DK32083, FRDJ Grant 2-SRA-2015-51-Q-R.

1. préparation de la mémoire tampon
<ol><li>Étiquetage des tampons (2 x PBS, pH 7,9) : dans 400 mL d’eau désionisée distillée de (DD), ajouter 100 mL de PBS de x 10, ajuster le pH à 7,9 avec NaOH.</li>
	<li>3 mM de biotine : dissoudre 1 mg de biotine dans 588 µL de tampon de marquage.</li>
	<li>3 mM de Sulfo-tag : dissoudre 150 nmol de Sulfo-tag dans 50 µL de tampon de marquage.</li>
	<li>Tampon de l’antigène (5 % de BSA) : dans 500 mL de PBS 1 x, ajoutez 25 g de Bovine Serum Albumin (BSA).</li>
	<li>Préparer la solution d’acide acétique de 0,5 M.</li>
	<li>1,0 M de tampon Tris-HCl pH 9.0 : préparer 1 M Tris-HCl de tampon et ajuster le pH à 9.0 avec HCl.</li>
	<li>Tampon de revêtement (3 % A de l’inhibiteur) : dans 500 mL de PBS 1 x, ajouter 15 g de bloqueur A.</li>
	<li>Tampon de lavage (0,05 % Tween 20, PBST) : 5000 mL de PBS 1 x, ajouter 2,5 mL de Tween 20.</li>
	<li>Tampon de lecture (2 x Buffer de lecture T avec agent tensio-actif) : dans 500 mL d’eau DD, verser 500 mL 4 x Buffer de lecture T avec agent tensio-actif (Table des matières).</li>
	<li>Magasin de biotine et Sulfo-tag dans un congélateur à-20 ° C. NOTE : Les solutions de biotine et Sulfo-balise doivent toujours être fraîchement préparées juste avant la procédure d’étiquetage.</li>
</ol>2. identifier l’anticytoplasme des îlots pancréatiques humains avec biotine et Sulfo-tag
Remarque : Une forte concentration de l’antigène, 0,5 mg/mL, est recommandée pour une réaction d’étiquetage plus efficace.
<ol><li>Déterminer le rapport molaire des îlots pancréatiques humains autoantigènes pour la biotine et Sulfo-tag.<ol>
<li>Obtenir le nombre de molaires de l’antigène en divisant le poids de l’antigène par le poids moléculaire.</li>
		<li>Utilisez le rapport molaire de 1:5 pour l’antigène avec le plus petit poids moléculaire (≤10 kd) et le rapport molaire de 01:20 pour l’antigène avec le plus grand poids moléculaire (> 50 kd).</li>
		<li>Calculer le volume pour la biotine ou Sulfo-tag en divisant le nombre de molaire par sa concentration.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mélanger l’anticytoplasme des îlots pancréatiques humains avec la biotine ou Sulfo-tag avec un rapport molaire de 1:5. Remarque : La protéine dans les systèmes de tampon tris ou glycine devrait être échangée contre 2 x tampon PBS avec un pH de 7,9 à l’aide de la vrille de dimensionnement colonne.</li>
	<li>Biotine et Sulfo-tag étant sensible à la lumière, couvrir les tubes de réaction avec du papier aluminium. Incubez la réaction à la température ambiante (RT) pendant 1 h.</li>
	<li>Pendant l’incubation, amorcer la colonne essorage en distribution 2 x tampon PBS dans la colonne trois fois. Centrifuger la solution à 1000 x g pendant 2 minutes chaque fois. Remarque : Actuellement, la réaction étiquetage, à travers le pont, est toujours en cours et doit être arrêté.</li>
	<li>Arrêter la réaction étiquetage en purifiant l’anticytoplasme des îlots pancréatiques humains marqués. Pour purifier, passer l’auto-antigène à travers la colonne de spin et centrifuger la colonne à 1000 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Déterminer la concentration de l’antigène marqué (µg/µL), à l’aide de la quantité de protéines de l’antigène et le volume final. Remarque : En gros, il y aura 90-95 % de rétention de l’antigène marqué après chaque colonne passer.</li>
	<li>Fraction de l’antigène marqué marqué antigène et magasin à-80 ° C.</li>
</ol>3. définir les meilleures Concentrations et des rapports pour les deux antigènes marqués pour l’essai (essai de Checker Board)
<ol><li>Préparer deux échantillons de sérum, un positif et un négatif, avec un volume total de 200 µL de chacune.</li>
	<li>Aliquote 4 µL de sérum et ajouter 1 x PBS jusqu'à ce que le volume final est 20 µL / puits d’une plaque PCR 96 puits. Utiliser la moitié d’une plaque pour l’échantillon positif élevé et l’autre moitié pour l’échantillon négatif, comme illustré à la Figure 2 a.</li>
	<li>Ajouter 10 µL de biotine et 10 µL de Sulfo-tag étiqueté antigène et la conduite des dilutions pour les deux antigènes marqués différemment, comme illustré à la Figure 2 a. Exécutez une dilution en série horizontale pour un antigène marqué et une dilution en série verticale pour l’autre antigène marqué.</li>
	<li>Continuer le reste de la procédure de test décrite dans 5.3 à 9.1.</li>
	<li>Calculer le ratio de signaux provenant de l’échantillon positif élevé contre chacun des signaux correspondants de l’échantillon négatif illustré à la Figure 2 b.</li>
	<li>Identifier les meilleures concentrations de biotine et Sulfo-balise l’antigène marqué en sélectionnant un point le plus élevé ou à proximité du positif au négatif le plus élevé. Considérer le signal faible bruit de fond de l’échantillon négatif pour identifier le rapport. Remarque : Le test jour1 comprend étape 4 à l’étape 6.</li>
</ol>4. préparer le tampon de l’antigène en utilisant la Concentration correcte de biotine/Sulfo-balise étiqueté antigène
<ol><li>Sélectionnez la concentration rationnelle de chaque antigène basée sur l’analyse du Conseil checker.</li>
	<li>Préparer 3 mL de solution d’antigène par plaque, en utilisant la concentration rationnelle de biotine/Sulfo-balise étiqueté antigène pour le tampon de l’antigène.</li>
</ol>5. Incuber les échantillons de sérum avec antigène marqué
Remarque : Il existe deux protocoles dans cette section, sans traitement sérum à l’acide et l’autre avec traitement sérum à l’acide. Tous les essais d’auto-anticorps îlot sauf dosage IAA utilisent protocole régulier sans traitement à l’acide sérum de mesures 5.1 à 5.5, alors que les IAA dosage ignore ces étapes et utilise le protocole avec traitement acide de sérum d’étapes 5,6 à 5,9.
<ol><li>Aliquote 4 µL de sérum et ajouter 1 x PBS jusqu'à ce que le volume final est 20 µL / puits d’une plaque PCR 96 puits.</li>
	<li>Ajouter 20 µL de solution d’antigène marqué par puits.</li>
	<li>Couvrir la plaque PCR avec étanchéité aluminium pour éviter la lumière.</li>
	<li>Mettre la plaque sur un agitateur (basse vitesse) à ta pendant 2 h.</li>
	<li>Mettre la plaque au réfrigérateur à 4 ° C et laisser incuber pendant la nuit (18-24h). Remarque : Le protocole suivant des étapes de 5,6 à 5,9 est conçu seulement pour l’analyse de l’IAA et autres dosages d’autoanticorps ignorer ces étapes.</li>
	<li>Mix 15 µL de sérum avec 18 ml d’acide acétique 0,5 M pour chaque échantillon de sérum. Incuber le mélange à ta pendant 45 min.</li>
	<li>Préparer la solution d’antigène avec la concentration rationnelle de biotine et Sulfo-tag étiqueté antigène, basée sur l’analyse du Conseil vérificateur, à l’aide du tampon de l’antigène. Dans chaque bien, aliquote 35 µL de tampon de l’antigène, contenant biotine et Sulfo-tag appelée antigène, dans une nouvelle plaque PCR.</li>
	<li>Avant l’étape d’incubation (point 5.6) 45 min est terminée, ajouter 8,3 µL de tampon de pH 9,0 Tris 1 M sur le côté de chaque puits de la plaque de l’antigène (point 5.6). Il est important de limiter le mélange entre le tampon Tris et l’antigène. Immédiatement transférer 25 µL de sérum, qui est traité à l’acide, au point 5.6, dans chaque puits et agiter la solution. Couvrir la plaque PCR avec étanchéité aluminium pour éviter la lumière.</li>
	<li>Mettre la plaque sur un agitateur (basse vitesse) à ta pour 2 h. mettre la plaque au réfrigérateur à 4 ° C et laissez la plaque à incuber pendant la nuit (18-24h).</li>
</ol>6. préparer la plaque de streptavidine
<ol><li>Prendre une plaque de streptavidine du réfrigérateur à 4 ° C et laissez la plaque à venir RT.</li>
	<li>Une fois la plaque de streptavidine RT, ajouter 150 µL de 3 % A de bloqueur dans chaque puits.</li>
	<li>Couvrir la plaque PCR avec feuille d’étanchéité.</li>
	<li>Incubez la plaque au réfrigérateur à 4 ° C durant la nuit. Remarque : Journée de test 2 comprend étape 7 à l’étape 9.</li>
</ol>7. transfert sérum/antigène couve jusqu'à la tôle de la Streptavidine
<ol><li>Le lendemain, sortez la plaque de streptavidine du réfrigérateur et jeter le tampon de la plaque. Énoncés des serviettes de papier sec sur la table et appuyez sur la plaque à l’envers jusqu'à ce qu’il n’y a pas plus de mémoire tampon à l’intérieur du puits.</li>
	<li>Remplir la plaque de streptavidine vide avec 150 µL de PBST / puits et jeter le PBST de la plaque pour un total de trois lavages.</li>
	<li>Transférer 30 µL de sérum/antigène couve par puits dans la plaque de streptavidine.</li>
	<li>Couvrir la plaque avec une feuille pour éviter la lumière. Secouez la plaque, avec une valeur faible, à la droite pendant 1 h.</li>
</ol>8. laver la plaque et ajouter le Buffer de lecture
<ol><li>Défausse couve de la plaque. Ajouter 150 µL de PBST / puits et jeter le PBST de la plaque pour un total de trois lavages.</li>
	<li>Après le lavage, ajouter 150 µL / puits de tampon de lecture. Remarque : Il est important éviter les bulles d’air dans la solution parce que cela affectera comment la plaque est lue sur l’appareil lecteur de plaque.</li>
</ol>9. Lisez la plaque et analyser les données
<ol><li>Compter la plaque sur la machine de lecteur de plaque. Valeurs des anticorps apparaissent comme des impulsions par seconde (CPS).</li>
	<li>Transmettre les niveaux d’anticorps provenant de la machine de lecteur de plaque comme un indice relatif. Calculer l’indice de l’équation suivante : Valeur de l’index = [CPS (échantillon) - CPS (témoin négatif)] / [CPS (contrôle positif) - CPS (témoin négatif)].</li>
	<li>Identifier les résultats anticorps positifs et négatifs en utilisant le seuil de positivité, défini basé sur le 99e centile de 100 sujets de témoins sains (personnes non diabétiques sans toute maladie auto-immune connue et qui n’ont pas d’antécédents familiaux de diabète).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Autoanticorps îlot sont actuellement les plus fiables biomarqueurs d’auto-immunité du diabète de type 1. Ils marquent le début de l’auto-immunité spécifique îlot et déterminer les risques de maladie. Le dosage de l’ECL, des auto-anticorps de l’îlot, a été largement validé dans plusieurs essais cliniques de la diabète de type 1 national et international. L’essai a montré une sensibilité accrue et la spécificité par rapport à l’actuel « or » standard EBR. Le dosage de l’ECL a montré son avantage supérieur pour la plus grande spécificité de la maladie en discriminante haute affinité et auto-anticorps îlot à haut risque de faible risque, faible affinité des signaux générés par l’ARI. C’est surtout remarqué chez les sujets qui sont seulement seul îlot auto-anticorps positifs et n’ont jamais progressé pour le diabète de type 1. La plupart de ces faible affinité autoanticorps se sont avérés pour être perdus au cours suivi les essais effectués dans les mois à des années, se comportant comme un « transitoire positif. » Comme précédemment l’hypothèse, ces faible affinité probables « single » autoanticorps résultent d’immunisation avec une molécule de réaction croisée. Tout en une affinité plus élevée, auto-anticorps d’îlot risque plus élevés s’explique par immunisation avec des antigènes de l’îlot eux-mêmes. En outre, ECL-essais ont démontré la capacité d’antidater le temps de « séroconversion » de tests actuellement de liaison radio standards (RBA) par ans chez les enfants avec le pré-diabète, qui furent suivies au diabète clinique dès la naissance. Un essai clinique international en cours, The Environmental déterminants du diabète dans les jeunes (TEDDY), dépend de la détection précise de déterminer le moment et l’apparition de l’auto-anticorps première de l’îlot « séroconversion » pour marquer le début de l’îlot auto-immunité et d’identifier les déclencheurs environnementaux. Une raison possible de l’augmentation de la sensibilité du test de l’ECL est que le dosage saisit toutes les classes d’immunoglobulines : IgG, IgM, IgA, IgE, plutôt que de traditionnels RBA ou de ELISA qui reposent uniquement sur la détection des IgG.
Lors d’essais de l’ECL, pour certains autoanticorps particulières comme les IAA, la liaison des anticorps à l’antigène semble être inhibée par certains composants présents dans le sérum humain normal. Pour enlever ou libérer cette inhibition, traitement des échantillons de sérum à l’acide a été nécessaire de le faire avant le sérum est incubé avec l’antigène. Comme indiqué dans [Figure 5], test de ECL-IAA, les activités de liaison d’autoantibodies de sérum des patients avec l’antigène et l’anticorps monoclonal de souris l’insuline a été grandement améliorée. L’acidification des échantillons de sérum, utilisé dans les dosages d’anticorps, est généralement appliquée pour dissocier préexistants liés complexes. Le mécanisme derrière comment IAA signaux sont inhibés dans le sérum humain et libérés par l’acidification du sérum n’est pas connu, mais cette méthode a été utilisée dans autres ECL basé analyses14,15.
Dans certains cas, lorsque le marquage de molécules, biotine ou Sulfo-tag, l’étiquetage positionsinside des molécules de protéine antigène sont à, ou très proches des épitopes clés de liaison de l’anticorps, qui peut-être interférer avec l’activité de liaison aux anticorps. Cela réduira la sensibilité et peut démolir complètement l’essai. Pour la procédure d’étiquetage de routine, maximisation ou saturation est souhaitée pour chaque molécule de protéine antigène générer une activité maximale ou signal par molécule marquée en maximisant la capacité d’étiquetage de chaque poste d’étiquetage possible. Insaturés étiquetage doit être effectuée en réduisant le rapport molaire de marquage de molécules (biotine et Sulfo-tag) à la protéine antigène si l’étiquetage sur l’antigène devient une raison possible de l’interruption de l’activité de liaison anticorps. Des épitopes principaux peuvent être mieux réservés et interruption de l’activité de liaison d’anticorps peut être libérée à l’aide de la stratégie d’étiquetage insaturée dans la plupart des cas.
Chaque essai doit inclure un interne standard haute témoins positifs et négatifs pour les calculs de l’indice d’échantillons inconnus. Un témoin positif faible près de limite supérieure de l’analyse des témoins normaux est important d’inclure pour la surveillance de la sensibilité. Le laboratoire devrait garder suffisamment aliquotes de contrôles positifs et négatifs standard pour une utilisation à long terme et toutes les parties aliquotes doivent être conservés à-20 ° C. Pour l’assurance qualité de test, des essais doivent être exécutés dans les doublons pour chaque échantillon et chaque résultat positif doit être confirmée en répétant l’échantillon dans un essai séparé. Un troisième essai est nécessaire lorsque le deuxième test de confirmation est en désaccord avec le premier test et les résultats de deux essais, qui conviennent (e.g., +, + ou-, -), sera la décision définitive d’un résultat positif ou négatif.
Avec la plate-forme définie pour des dosages de ECL unique, un dosage multiplexé peut être étendu à ces. Il peut déterminer simultanément jusqu'à 10 différents auto-anticorps dans un puits unique avec une petite quantité de sérum. Actuellement, quatre auto-anticorps îlot y compris IAA, gaillet, IA-2 a et ZnT8A sont égales en importance pour la prédiction du risque de progression vers T1D chez les deux membres de la famille des patients atteints de T1D et l’ensemble de la population. Les méthodes utilisées pour le dépistage de ces 4 autoanticorps à l’aide de mesures de courant unique auto-anticorps sont laborieux et inefficace, en particulier pour le dépistage à grande échelle. Ce qui est important, jusqu'à 40 % des patients avec T1D présentent une condition auto-immune supplémentaire16,17,18. Malheureusement, il n’y a pas d’outil simple et peu coûteux pour écran pour ces conditions. L’essai de ECL multiplex n’est pas seulement capable de combiner 4 tests d’auto-anticorps îlots principaux actuellement en un seul, mais est aussi capable de mieux combiner plusieurs dosages auto-anticorps par d’autres maladies auto-immunes pertinentes. Cela rend possible de procéder efficacement à haut débit, dépistage des maladies auto-immunes multiples simultanément dans les populations à grande échelle. Dans l’essai de ECL multiplex, comme indiqué dans [Figure 6], chaque complexe anticorps-antigène formé dans la phase liquide sera être immobilisé sur un endroit de source spécifique de l’éditeur de liens dans le même bien. Le récepteur de signal de l’appareil lecteur de plaque est capable de reconnaître les signaux de 10 sources différentes de taches. Toutefois, les taches avec un signal extrêmement élevé peuvent générer un fond dosage élevé et causer du brouillage aux taches voisines par le biais de diaphonie. Pour cette raison, les signaux de limite supérieure pour chaque dosage des auto-anticorps devraient être limitées à moins de 20 000 chefs d’accusation. Dans notre expérience, les autoanticorps avec arrière-plans inférieurs doivent être placés relativement loin de ces lieux ayant une plus grande lorsque la carte spot est conçue. Pour les études à long terme à l’aide d’épreuves ECL multiplex, il est recommandé que l’éditeur de liens même être utilisé pour le dosage des auto-anticorps même pour assurer la cohérence de l’analyse.

Un système de classement intermédiaire récent a été créé afin de faciliter le diagnostic des étapes initiales de T1D chez les patients. Exacte détection d’auto-anticorps îlot humain joue un rôle important dans l’identification et la mise en scène présymptomatique diabète de type 1, comme la présence d’auto-anticorps îlot indique la présence de l’auto-immunité cellules β. Le tarif de nombre et des types d’auto-anticorps de l’îlot, dans lesquels le diabète affecte les patients de l’apparition initiale de l’auto-immunité cellules β à la maladie symptomatique, est variable2,3.
L’âge de séroconversion d’auto-anticorps, titre et l’affinité des autoanticorps îlot peut affecter le rythme de la progression symptomatique de type 1 diabète4,5,6,7,8 ,9,10. Récemment, développés ECL dosages ont été largement validées, ont montré une augmentation de la sensibilité et sont plus spécifiques à certaines maladies10,11,12,13. Ces tests d’améliorer la prévision et la mise en scène du risque de diabète grâce à une détection plus précoce des autoanticorps d’îlot. Plus précisément, ils marquent le début de l’auto-immunité îlot et ignorent les signaux de faible affinité et à faible risque ne conviennent pas pour le diabète.
Dans un test de l’ECL, l’anticorps dans le sérum, le cas échéant, combler l’antigène Sulfo-tag-conjugué à l’antigène de capture biotinylé dans la phase liquide. Après le pont, l’éditeur de liens biotine est pris dans la phase solide et détecté par ECL par le Sulfo-tag sur la plaque de streptavidine enduite (Figure 1).
Dans cette revue, dosages ECL seul anticorps avec autoanticorps îlots pancréatiques humains sont principalement utilisés. En bref, multiplexés anticorps études basées sur l’unique ECL dosages seront discutés. L’essai multiplex peut être utilisé pour identifier les multiples, jusqu'à 10, autoanticorps au sein d’un même bien, avec 15 µL de sérum. Ce dosage simple haut débit peut être utilisé à l’écran, en même temps, plusieurs auto-anticorps pour plusieurs maladies auto-immunes pertinents dans la population générale.

<table><tbody><tr><td>Protéine de proinsuline recombinante humaine (PINS)</td><td>AmideBio</td><td>Proinsuline humaine, Rec</td><td></td></tr><tr><td>Protéine GAD65 recombinante humaine</td><td>Diamyd</td><td>rhGAD65</td><td></td></tr><tr><td>Protéine humaine recombinante IA-2</td><td>Creative BioMart</td><td>IA2</td><td></td></tr><tr><td>1x Saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>SIGMA-ALORICH</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>Plaque PCR à 96 puits&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>Plaque revêtue de streptavidine</td><td>MSD</td><td>L15SA</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Colonne de centrifugation</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89890</td><td></td></tr><tr><td>Twen-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI21329</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-tag</td><td>MSD</td><td>R91AO-1</td><td></td></tr><tr><td>Blocker A</td><td>MSD</td><td>R93AA-1</td><td></td></tr><tr><td>4x Read Buffer T avec tensioactif</td><td>MSD</td><td>R92TC-1</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-PEG4-Biotine</td><td>ThermoScience</td><td>21329</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-TAG</td><td>MSD</td><td>R91AO-1</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de réaction en chaîne par polymérase (PCR) à 96 puits</td><td>de marque Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de streptavidine à 96 puits</td><td>MSD GOLD</td><td>L 15SA-1</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de dessalage Zeba Spin</td><td>ThermoScience</td><td>PL208984</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur de plaques à 96 puits</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>MSD</td><td>QuickPlex SQ120</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de paillasse avec godet rotatif</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr></tbody></table>

par électrochimiluminescence dosages pour îlots pancréatiques humains autoanticorps

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Localisation des autoanticorps îlot associées au diabète de type 1 (T1D) ouvre la voie de projet et de prévenir cette maladie dans la population générale. Un nouveau dosage de ECL est un dosage de phase fluide non radioactif pour autoanticorps îlot avec la plus grande sensibilité et de spécificité que le test actuel de liaison radio standard « or » (RBA). ECL dosages peuvent définir plus précisément l’apparition de T1D présymptomatique en distinguant les autoanticorps à haut risque, de haute affinité de l’autoanticorps faible risque, faible affinité générées en EBR et dosages classiques immuno-enzymatique (ELISA ). La protéine de l’antigène utilisée dans cet essai ECL est étiquetée avec Sulfo-tag et biotine, respectivement. Chaque essai d’auto-anticorps ECL qui utilise une protéine antigène particulier a besoin d’une étape d’optimisation avant il peut être utilisé pour les applications de laboratoire. Cette étape est particulièrement vitale pour déterminer les exigences pour les traitements acides sériques, concentrations et des rapports des deux antigènes différents marquées à Sulfo-tag et de biotine. Pour effectuer le test, sérum échantillons sont mélangés avec tag Sulfo-conjugués et biotinylés protéine antigène dans une solution tamponnée au phosphate (PBS), contenant 5 % de capture Bovine Serum Albumin (BSA). Par la suite, les échantillons sont incubés pendant une nuit à 4 ° C. Le même jour, une plaque streptavidine est préparée avec un tampon bloquant et incubée durant une nuit à 4 ° C. Le deuxième jour, laver la plaque de la Streptavidine et passer le mélange de sérum-antigène sur la plaque. Placez la plaque sur l’agitateur de la plaque, à basse vitesse et incuber à température ambiante pendant 1 h. Par la suite, la plaque est encore une fois lavée et tampon du lecteur est ajouté. La plaque est alors comptée sur la machine de lecteur de plaque. Les résultats sont transmis via un index, qui est généré à partir d’échantillons de sérum de contrôle positifs et négatifs d’interne standard.

La figure 2 affiche le damier. Il est démontré que 250 ng/mL de biotine et 250 ng/mL de Sulfo-balise antigène marqué sont les concentrations plus rationnelles utilisées dans l’essai étant donné les signaux émis par l’échantillon de contrôle positif élevé, l’échantillon de contrôle négatif dans le contexte de l’analyse et le rapport de positive aux signaux négatifs. Avec la concentration optimisée de ces deux antigènes marqués, l’analyse a été réalisée avec les échantillons de sérum de 100 patients nouvellement diagnostiqués avec T1D et 100 témoins sains. Valeur d’index de 0,023 a été définie comme le seuil de décision pour la positivité. Cela représente 85 % sensibilité spécificité patients et 99 % chez les témoins sains à l’aide de la courbe de caractéristique (ROC) illustré à la Figure 3 ade fonctionnement du récepteur. Le dosage pour les échantillons inconnus a été réalisé avec internes positifs de hauts standards, peu de positifs et des échantillons de contrôle négatif. Les résultats des comtes CPS figurent dans tableau 2 a. La moyenne CPS des témoins positifs de haute et basse sont surlignées en rouge, 17903 [(19940+15866)/2] et [(857+820)/839 2], et les témoins négatifs sont surlignées en vert, 168 [(170+165)/2]. L’indice pour les échantillons inconnus est calculé par "(échantillonde la CPS-168)/(17903-168). » Tableau 2 b présente les valeurs de l’indice calculé pour tous les échantillons. Les valeurs d’index qui sont supérieures à 0,023 sont écrits en rouge, correspondant aux valeurs CPS également écrits en rouge dans le tableau 2 a. Ces valeurs seront définies comme les résultats positifs qui sont supérieurs à la 99ème percentile de la population témoin en bonne santé. Lorsqu’on utilise une concentration en antigène irrationnel, le test aura un fond important, comme le montre le tableau 2 C. Faible taux d’anticorps positifs sera ressentie comme les valeurs de A2, A5, D1 et H4 surlignés en gris dans le Tableau 2D.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig1.jpg"> Figure 1 : Illustration d’une capture plaque bivalent sur un seul essai ECL-IAA. L’auto-anticorps îlot dans les ponts de sérum la Sulfo-balise conjugué antigène à l’antigène biotinylé capture, qui est capté en phase solide sur la plaque de streptavidine. Détection de plaque-capturé Sulfo-tag conjugué antigène s’accomplit par ECL. Ce chiffre a été modifié par Yu, et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig2.jpg"> Figure 2 : Courbe de the ROC pour déterminer le seuil de positivité du test. Les 99ème percentile de spécificité correspondant à 85 % de sensibilité a été sélectionnée et est représenté par une valeur d’index de 0,023. Cette limite supérieure du dosage est extraite de 100 témoins sains. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig3.jpg"> Figure 3 : Illustration du sérum humain normal, bloquant les signaux ECL-IAA. R : les signaux provenant des essais d’ECL-IAA avec un anticorps monoclonal de l’insuline (MoAb) ont été considérablement bloqués par l’ajout du sérum humain normal. Lors de la comparaison de MoAb dans du PBS, le signal a été partiellement rétabli lorsque le sérum humain a été traité à l’acide. B : signaux d’un dosage de l’ECL-IAA avec 4 sérums de patients ont été considérablement accrue du traitement à l’acide. Ce chiffre a été modifié par Yu, et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig4.jpg"> Figure 4 : Illustration du dosage Mutiplex ECL. Des complexes antigène-anticorps sont forment en phase liquide avec les linkers spécifiques. Les complexes antigène-anticorps-linker spécifiques sont retenus sur chacun des points linker spécifiques dans le même bien. La machine de lecteur de plaque est capable de distinguer les signaux provenant de différentes sources de taches et donne des comtes de CPS sur 10 canaux différents, respectivement. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1.jpg"> Tableau 1 : test de Checker board détermine les concentrations et les ratios de biotine et Sulfo-balise l’antigène marqué. A: raw CPS est comptabilisé pour la tôle de Conseil quadrillée avec sérum positif élevé sur la moitié de la plaque et le sérum négatif sur l’autre moitié. La concentration de l’antigène biotinylé a été diluée horizontalement en série et la concentration des Sulfo-tag étiqueté antigène a été diluée verticalement dans la série. B : les valeurs du ratio des comtes CPS du sérum positif élevé contre chacun de leurs chefs de CPS correspondantes du sérum négatif. Les puits en surbrillance jaunes représentent le meilleur rapport du positif au négatif dans le groupe B. Ce ratio correspond à 250 ng/mL biotine et 250 ng/mL Sulfo-tag étiquette concentrations antigène dans le groupe A avec un nombre de CPS acceptablement bas pour sérum négatif. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette table.</a>
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2.jpg"> Tableau 2 : analyse des résultats d’analyse. A: raw CPS le recensement de la plaque de test avec les contrôles positifs de haute et basse standards surlignés en rouge et les témoins négatifs standards surlignées en vert. Chaque échantillon a été dupliqué dans le dosage. B : Index valeurs ont été calculées, comme décrit dans le protocole d’essai. N’importe quelle valeur de l’indice supérieure à 0,023 a été défini comme un résultat positif, a mis en évidence en rouge. C : raw CPS le recensement de la plaque d’essai avec le même ensemble d’échantillons lorsqu’on utilise une concentration en antigène irrationnelle. Il en est résulté un haut fond et quelque peu positifs normalement détectés, tel qu’illustré dans le groupe B, ont été convertis pour les négatifs, surlignés en gris dans le panneau D. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette table.</a>

Ici, nous avons présenté les méthodes pour détecter des autoanticorps d’îlots pancréatiques humains à l’aide de dosages par électrochimiluminescence (ECL). Le protocole utilisé pour prédire le diabète de type 1, peut être étendu à pour détecter des auto-anticorps pour d’autres maladies auto-immunes.

Par électrochimiluminescence dosages pour îlots pancréatiques humains autoanticorps

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

L’objectif global de ce test d’électrochimiluminescence est de détecter les atutoanticorps des îlots dans le diabète auto-immun de type 1, avec une sensibilité et une spécificité élevées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du diabète de type un, telles que le moment de l’initiation de l’auto-immunité des îlots pancréatiques et la prédiction du risque élevé de diabète de type 1. Le principal avantage de cette technique est une technique plus sensible, plus spécifique à la maladie et non radioactive par rapport aux tests radiologiques standard actuels.L’implication de cette technique s’étend à la prédiction et au diagnostic du diabète de type 1, car ces auto-anticorps d’îlots apparaissent des mois ou des années avant la maladie clinique symptomatique. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la prédication du diabète de type 1, elle peut également être appliquée à l’étude d’autres maladies auto-immunes, telles que les auto-anticorps contre la transglutaminase pour la maladie cœliaque, la TPO et la thyroglobuline pour les maladies thyroïdiennes auto-immunes et plusieurs autres. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons découvert qu’elle était basée sur une sensibilité élevée et la non-radioactivité.Contrairement à la méthode ELISA conventionnelle qui ne fonctionne pas bien pour la détection d’auto-anticorps d’îlots. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car le dosage des auto-anticorps anti-insuline avec le traitement à l’acide sérique est difficile à décrire dans le texte. La démonstration de la procédure sera faite par Yong Gu, un post-doctorant de mon laboratoire.Tout d’abord, mélangez l’auto-antigène des îlots humains avec de la biotine ou SULFO-TAG dans un rapport de une à cinq molaires dans un tube. Et couvrez le tube avec du papier d’aluminium car les deux étiquettes sont sensibles à la lumière. Ensuite, incubez le tube pendant une heure à température ambiante.Pendant ce temps, lorsque l’incubation est en cours, amorcez la colonne de spin avec une solution saline tamponnée au phosphate deux fois. Ensuite, centrifugez la colonne à 1 000 fois la gravité pendant deux minutes à chaque fois. Ensuite, centrifugez le mélange de marqueurs d’auto-antigènes dans la colonne de spin à 1 000 fois la gravité pendant deux minutes.Ensuite, aliquote et stockez l’antigène marqué à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, utilisez la concentration rationnelle de l’antigène marqué à la biotine SULFO-TAG basée sur le test en damier pour le tampon d’antigène, pour préparer trois millilitres de solution d’antigène par plaque de 96 puits. Ensuite, dans chaque puits, ajoutez quatre microlitres de sérum et ajustez le volume final à 20 microlitres avec une solution saline tamponnée au phosphate.Ensuite, ajoutez 20 microlitres de solution d’antigène marquée dans chaque puits. Et couvrez la plaque avec une feuille d’étanchéité pour éviter la lumière. Ensuite, transférez la plaque sur un shaker à température ambiante pendant deux heures.Une fois que le shaker s’arrête, laissez l’assiette à quatre degrés Celsius au réfrigérateur pendant 18 à 24 heures. Maintenant, mélangez 15 microlitres de sérum avec 18 microlitres d’acide acétique 0,5 molaire pour chaque échantillon et incubez le même à température ambiante pendant 45 minutes. Sur la base du test en damier, utilisez la concentration rationnelle de l’antigène marqué à la biotine SULFO-TAG pour préparer la solution d’antigène.Ensuite, aliquote 35 microlitres du tampon antigénique dans chaque puits d’une nouvelle plaque PCR. Juste avant la fin de l’incubation du mélange de sérum, ajoutez 3,8 microlitres d’un tampon molaire Tris à PH neuf, à côté de chaque puits sur la plaque d’antigène. Une fois l’incubation terminée, transférez rapidement 25 microlitres de sérum traité à l’acide acétique dans chaque puits de la plaque d’antigène et agitez la solution.Ensuite, couvrez la plaque PCR d’un film d’étanchéité pour éviter la lumière et placez-la sur un agitateur à température ambiante pendant deux heures. Une fois cela fait, transférez l’assiette à quatre degrés Celsius au réfrigérateur et incubez pendant 18 à 24 heures. Sortez une plaque de streptavidine du réfrigérateur à quatre degrés Celsius et laissez-la atteindre la température ambiante.Une fois que la plaque de streptavidine a atteint la température ambiante, ajoutez 150 microlitres de bloqueur A à 3 % dans chaque puits et couvrez la plaque PCR d’une feuille d’étanchéité et incubez au réfrigérateur pendant la nuit. Le lendemain, retirez la plaque de streptavidine du réfrigérateur et expulsez le tampon des puits. Ensuite, séchez l’assiette en la posant à l’envers sur du papier absorbant pour que le tampon restant puisse tremper.Ensuite, ajoutez 150 microlitres de tampon PBST à un pli pour laver le puits pendant trois lavages consécutifs. Ensuite, transférez 30 microlitres d’antigène sérique incuber dans chaque puits de la plaque de streptavidine et couvrez la plaque d’une feuille pour éviter la lumière. Ensuite, transférez la plaque sur un shaker à température ambiante pendant une heure.Au bout d’une heure, jetez l’incubation de l’antigène sérique de la plaque et ajoutez 150 microlitres d’un tampon PBST à pli pour laver le puits trois fois. Une fois le lavage terminé, ajoutez 150 microlitres de tampon de lecture dans chaque puits pour lire sur un lecteur de plaques. Avant d’analyser des échantillons inconnus, le seuil de test pour chaque test d’auto-anticorps a été mis en place en testant environ 100 patients atteints de diabète de type 1 et environ 100 témoins sains.Ensuite, une courbe ROC a été tracée pour déterminer l’indice optimal de la limite supérieure de la normale pour le dosage GADA, qui était de 0,023, afin d’obtenir la meilleure sensibilité et spécificité. Ensuite, le résultat de l’échantillon inconnu a été calculé à l’aide d’une équation dérivée des normes de contrôle positives élevées, positives faibles et négatives. Ensuite, un graphique a été tracé pour déterminer les signaux obtenus dans le dosage de l’autoatibody des îlots de Langerhans sur l’incubation de l’anticorps monoclonal de l’insuline avec du sérum humain normal en présence et en l’absence de traitement à l’acide.Le graphique montre que le signal est nettement bloqué lors de l’ajout de sérum normal en l’absence de traitement acide. Au contraire, le signal obtenu est comparativement plus élevé lorsque le sérum est soumis à un traitement acide avant l’incubation avec l’anticorps monoclonal de l’insuline. Un graphique similaire a également été tracé pour déterminer les signaux obtenus à l’aide de Sera de patients étrangers en présence et en absence de traitement à l’acide.Le traitement du patient Sera avec de l’acide avant l’incubation avec l’anticorps augmente considérablement les signaux dans le dosage des auto-anticorps des îlots de Langerhans par rapport à l’absence de traitement. Une fois maîtrisée, cette technique peut être facilement réalisée pour plusieurs centaines d’échantillons en une journée si elle est correctement préformée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’effectuer le test en damier pour chaque test d’auto-anticorps afin d’optimiser les conditions de test.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du diabète de type 1 auto-immun pour la prédiction et la prévention. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la facilité avec laquelle effectuer ce test. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons de sérum peut être dangereux et contagieux.Des précautions pour éviter tout contact direct avec la peau doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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Par électrochimiluminescence dosages pour îlots pancréatiques humains autoanticorps

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