Par électrochimiluminescence dosages pour îlots pancréatiques humains autoanticorps

Ici, nous avons présenté les méthodes pour détecter des autoanticorps d’îlots pancréatiques humains à l’aide de dosages par électrochimiluminescence (ECL). Le protocole utilisé pour prédire le diabète de type 1, peut être étendu à pour détecter des auto-anticorps pour d’autres maladies auto-immunes.

L’objectif global de ce test d’électrochimiluminescence est de détecter les atutoanticorps des îlots dans le diabète auto-immun de type 1, avec une sensibilité et une spécificité élevées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du diabète de type un, telles que le moment de l’initiation de l’auto-immunité des îlots pancréatiques et la prédiction du risque élevé de diabète de type 1. Le principal avantage de cette technique est une technique plus sensible, plus spécifique à la maladie et non radioactive par rapport aux tests radiologiques standard actuels.

L’implication de cette technique s’étend à la prédiction et au diagnostic du diabète de type 1, car ces auto-anticorps d’îlots apparaissent des mois ou des années avant la maladie clinique symptomatique. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la prédication du diabète de type 1, elle peut également être appliquée à l’étude d’autres maladies auto-immunes, telles que les auto-anticorps contre la transglutaminase pour la maladie cœliaque, la TPO et la thyroglobuline pour les maladies thyroïdiennes auto-immunes et plusieurs autres. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons découvert qu’elle était basée sur une sensibilité élevée et la non-radioactivité.

Contrairement à la méthode ELISA conventionnelle qui ne fonctionne pas bien pour la détection d’auto-anticorps d’îlots. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car le dosage des auto-anticorps anti-insuline avec le traitement à l’acide sérique est difficile à décrire dans le texte. La démonstration de la procédure sera faite par Yong Gu, un post-doctorant de mon laboratoire.

Tout d’abord, mélangez l’auto-antigène des îlots humains avec de la biotine ou SULFO-TAG dans un rapport de une à cinq molaires dans un tube. Et couvrez le tube avec du papier d’aluminium car les deux étiquettes sont sensibles à la lumière. Ensuite, incubez le tube pendant une heure à température ambiante.

Pendant ce temps, lorsque l’incubation est en cours, amorcez la colonne de spin avec une solution saline tamponnée au phosphate deux fois. Ensuite, centrifugez la colonne à 1 000 fois la gravité pendant deux minutes à chaque fois. Ensuite, centrifugez le mélange de marqueurs d’auto-antigènes dans la colonne de spin à 1 000 fois la gravité pendant deux minutes.

Ensuite, aliquote et stockez l’antigène marqué à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, utilisez la concentration rationnelle de l’antigène marqué à la biotine SULFO-TAG basée sur le test en damier pour le tampon d’antigène, pour préparer trois millilitres de solution d’antigène par plaque de 96 puits. Ensuite, dans chaque puits, ajoutez quatre microlitres de sérum et ajustez le volume final à 20 microlitres avec une solution saline tamponnée au phosphate.

Ensuite, ajoutez 20 microlitres de solution d’antigène marquée dans chaque puits. Et couvrez la plaque avec une feuille d’étanchéité pour éviter la lumière. Ensuite, transférez la plaque sur un shaker à température ambiante pendant deux heures.

Une fois que le shaker s’arrête, laissez l’assiette à quatre degrés Celsius au réfrigérateur pendant 18 à 24 heures. Maintenant, mélangez 15 microlitres de sérum avec 18 microlitres d’acide acétique 0,5 molaire pour chaque échantillon et incubez le même à température ambiante pendant 45 minutes. Sur la base du test en damier, utilisez la concentration rationnelle de l’antigène marqué à la biotine SULFO-TAG pour préparer la solution d’antigène.

Ensuite, aliquote 35 microlitres du tampon antigénique dans chaque puits d’une nouvelle plaque PCR. Juste avant la fin de l’incubation du mélange de sérum, ajoutez 3,8 microlitres d’un tampon molaire Tris à PH neuf, à côté de chaque puits sur la plaque d’antigène. Une fois l’incubation terminée, transférez rapidement 25 microlitres de sérum traité à l’acide acétique dans chaque puits de la plaque d’antigène et agitez la solution.

Ensuite, couvrez la plaque PCR d’un film d’étanchéité pour éviter la lumière et placez-la sur un agitateur à température ambiante pendant deux heures. Une fois cela fait, transférez l’assiette à quatre degrés Celsius au réfrigérateur et incubez pendant 18 à 24 heures. Sortez une plaque de streptavidine du réfrigérateur à quatre degrés Celsius et laissez-la atteindre la température ambiante.

Une fois que la plaque de streptavidine a atteint la température ambiante, ajoutez 150 microlitres de bloqueur A à 3 % dans chaque puits et couvrez la plaque PCR d’une feuille d’étanchéité et incubez au réfrigérateur pendant la nuit. Le lendemain, retirez la plaque de streptavidine du réfrigérateur et expulsez le tampon des puits. Ensuite, séchez l’assiette en la posant à l’envers sur du papier absorbant pour que le tampon restant puisse tremper.

Ensuite, ajoutez 150 microlitres de tampon PBST à un pli pour laver le puits pendant trois lavages consécutifs. Ensuite, transférez 30 microlitres d’antigène sérique incuber dans chaque puits de la plaque de streptavidine et couvrez la plaque d’une feuille pour éviter la lumière. Ensuite, transférez la plaque sur un shaker à température ambiante pendant une heure.

Au bout d’une heure, jetez l’incubation de l’antigène sérique de la plaque et ajoutez 150 microlitres d’un tampon PBST à pli pour laver le puits trois fois. Une fois le lavage terminé, ajoutez 150 microlitres de tampon de lecture dans chaque puits pour lire sur un lecteur de plaques. Avant d’analyser des échantillons inconnus, le seuil de test pour chaque test d’auto-anticorps a été mis en place en testant environ 100 patients atteints de diabète de type 1 et environ 100 témoins sains.

Ensuite, une courbe ROC a été tracée pour déterminer l’indice optimal de la limite supérieure de la normale pour le dosage GADA, qui était de 0,023, afin d’obtenir la meilleure sensibilité et spécificité. Ensuite, le résultat de l’échantillon inconnu a été calculé à l’aide d’une équation dérivée des normes de contrôle positives élevées, positives faibles et négatives. Ensuite, un graphique a été tracé pour déterminer les signaux obtenus dans le dosage de l’autoatibody des îlots de Langerhans sur l’incubation de l’anticorps monoclonal de l’insuline avec du sérum humain normal en présence et en l’absence de traitement à l’acide.

Le graphique montre que le signal est nettement bloqué lors de l’ajout de sérum normal en l’absence de traitement acide. Au contraire, le signal obtenu est comparativement plus élevé lorsque le sérum est soumis à un traitement acide avant l’incubation avec l’anticorps monoclonal de l’insuline. Un graphique similaire a également été tracé pour déterminer les signaux obtenus à l’aide de Sera de patients étrangers en présence et en absence de traitement à l’acide.

Le traitement du patient Sera avec de l’acide avant l’incubation avec l’anticorps augmente considérablement les signaux dans le dosage des auto-anticorps des îlots de Langerhans par rapport à l’absence de traitement. Une fois maîtrisée, cette technique peut être facilement réalisée pour plusieurs centaines d’échantillons en une journée si elle est correctement préformée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’effectuer le test en damier pour chaque test d’auto-anticorps afin d’optimiser les conditions de test.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du diabète de type 1 auto-immun pour la prédiction et la prévention. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la facilité avec laquelle effectuer ce test. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons de sérum peut être dangereux et contagieux.

Des précautions pour éviter tout contact direct avec la peau doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.