le Drosophila Imaginal Tumor Disc Modèle: Visualisation et quantification de l'expression génique et de tumeurs invasives utilisant Mosaïques génétique

L’objectif général de ce protocole est de démontrer comment disséquer les disques imaginaux et les cerveaux de l’œil et de l’antenne de la drosophile, porteurs de clones génétiquement définis et marqués par fluorescence, et comment les traiter pour visualiser et quantifier les changements d’expression génique et l’invasivité cellulaire. Les procédures décrites peuvent aider à fournir de nouvelles informations sur le rôle des gènes et du développement épithélial, de l’homéostasie ou de la maladie et à disséquer les mécanismes sous-jacents à leur compétition, à leur prolifération compensatoire ou à leur société interclonale. Le principal avantage de l’étude est que nous fournissons une gamme complète de protocoles adaptés à l’analyse quantitative et qualitative approfondie des mosaïques génétiques de la drosophile.

En général, les personnes qui travaillent pour la première fois avec le modèle de la drosophile ont du mal parce qu’elles ne peuvent pas reconnaître le disque imaginal de l’autre disque imaginal. Pour faciliter la reconnaissance du disque imaginal œil-antennaire portant des clones marqués fluorescentment dans le corps larvaire, il est recommandé d’effectuer les dissections initiales au microscope fluorescent. L’analyse en mosaïque avec un marqueur cellulaire répressible ou MARCM permet de générer des patchs clonaux génétiquement définis dans un contexte de type sauvage phénotypique.

Un FLP piloté par un promoteur sans œil catalyse la recombinaison entre deux éléments FRT flanquant une cassette d’arrêt marquée d’un gène jaune. Après la réplication de l’ADN, la FLP catalyse l’échange des chromatides non sœurs entre les chromosomes homologues, générant des chromatides sœurs. L’un porteur de l’allèle de type sauvage et du répresseur Gal80 et l’autre du mutant.

En mitose, celles-ci se séparent pour produire deux cellules filles, l’une étant un mutant homozygote et l’autre de type sauvage. La perte du répresseur Gal80 permet l’expression de la GFP chez le mutant tandis que les cellules de type sauvage restent négatives à la GFP. Pour commencer l’expérience, récoltez des larves de mosaïque en injectant du PBS dans la bouteille à mouches pour couvrir la surface de la nourriture.

Ensuite, ramollissez la couche supérieure avec une spatule et versez la bouillie alimentaire contenant des larves dans une boîte de Pétri. Cueillez délicatement les larves et transférez-les dans un bol d’embryons rempli de PBS. Prélever au moins 20 larves pour l’immunocoloration et 80 larves pour la quantification de l’invasivité tumorale.

Lavez les larves avec du PBS pour éliminer toute nourriture résiduelle. À l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent à un grossissement de 8:16x, identifiez et éliminez toutes les larves de léopard, c’est-à-dire celles qui présentent des points positifs aléatoires de GFP dans tout le corps. Placez le plat contenant les larves restantes dans le PBS sur de la glace jusqu’à la dissection.

Pour disséquer le disque imaginal œil-antenne au microscope stéréoscopique, utilisez une paire de pinces et saisissez doucement la larve à environ 2/3 de la longueur du corps en arrière de la tête. Avec la deuxième paire de pinces, saisissez les crochets buccaux des larves et éloignez-les du corps. À l’aide d’une pince, démêlez les crochets buccaux de la cuticule superposée et des tissus étrangers tels que les glandes salivaires et le corps adipeux.

Alternativement, pour préparer le complexe cerveau-disque oculaire-antennaire en gardant le cordon nerveux ventral intact, utilisez une pince pour couper une larve au milieu du corps. Jetez la moitié postérieure. Tenez la moitié antérieure du corps larvaire avec les pointes d’une paire de pinces, puis retournez la larve en poussant les crochets buccaux vers l’intérieur avec la pointe de la deuxième paire et en faisant rouler la cuticule dessus avec la première paire de pinces.

Retirez soigneusement tous les tissus étrangers, y compris l’intestin, le corps adipeux et les glandes salivaires. Tirez doucement les crochets buccaux loin de la cuticule. Relâchez le complexe cérébral œil-disque antennaire attaché aux crochets buccaux en sectionnant les projections axonales s’étendant du cordon nerveux ventral aux muscles et à l’épiderme.

Pour transférer le tissu, enrobez d’abord une pointe de micropipette P20 en pipetant les carcasses restantes du corps de haut en bas plusieurs fois, puis utilisez la même pointe pour transférer le tissu disséqué. Pour transférer des complexes cérébraux œil-disque antennaire plus grands, prédécoupez l’extrémité P20 pour agrandir l’ouverture. Fixez les échantillons dans 400 microlitres de fixateur à 4 % de PFA pendant 25 minutes à température ambiante pendant la nutation.

Retirez ensuite le fixateur et lavez les échantillons avec du PBST trois fois pendant 10 minutes avec nutation. Ensuite, remplacez le PBST par 500 microlitres de solution de coloration DAPI et nutez pendant 15 minutes dans l’obscurité. Lavez le mouchoir une fois pendant 10 minutes avec PBST.

Pour terminer la dissection, utilisez une pipette d’un millilitre pour transférer le tissu dans une boîte en verre remplie de PBS. À l’aide de deux paires de pinces, on sépare les cerveaux à utiliser pour quantifier le caractère invasif des disques antennaires oculaires en coupant les tiges optiques. Libérez les disques oculaires-antennaires en les coupant des crochets buccaux.

Placez une goutte de support de montage sur une lame abductive et, à l’aide d’une pince, répartissez le liquide en une fine couche. Pour quantifier le caractère invasif, placez au moins 80 cerveaux intacts fixes pour chaque génotype sur une seule lame. Redressez et positionnez le tissu comme vous le souhaitez.

Touchez doucement un bord d’une lamelle sur le milieu et abaissez-le lentement à l’aide d’une pince pour éviter de créer des bulles. Utilisez une lingette de laboratoire pour absorber l’excès de support de montage sur les bords. Le tissu peut maintenant être examiné à l’aide de l’imagerie confocale.

Demandez à une partie neutre d’anonymiser les diapositives afin que la notation soit impartiale. Et faire évaluer les lames de manière indépendante par au moins deux chercheurs. Ne divulguez les génotypes qu’une fois que l’évaluation est terminée.

Évaluez le degré de malignité à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent équipé d’un ensemble de filtres GFP. À l’aide d’un marqueur, étiquetez les cerveaux qui ont déjà été vus pour éviter le double comptage. Des images confocales fluorescentes montrent des cerveaux disséqués à partir de larves porteuses de tumeurs clonales malignes marquées par GFP marquées au GFP et marquées au DAPI.

Les panneaux représentent les quatre différents degrés d’invasivité tumorale. Une quantification non biaisée a révélé que l’inhibition de la signalisation JNK et de RAS V12 griffonné un clone supprimait l’invasivité tumorale. Dans les disques oyeux-antennaires témoins, le rapporteur TRE-DsRED, sensible à JNK, n’étiquette qu’une bande étroite de cellules allant de l’antennaire à la partie oculaire.

En revanche, l’activité de TRE-DsRED a été nettement améliorée dans les tumeurs clonales malignes positives à la GFP. Au 8e jour, les cellules tumorales ont envahi les disques antennes de l’œil et se sont propagées au cordon nerveux ventral. Les cellules tumorales envahissantes ont également montré une activation accrue de JNK par rapport aux tissus environnants.

Alors que le blocage de JNK réduisait clairement l’activité de TRE-DsRED dans les clones tumoraux, l’augmentation de l’intensité du laser a révélé une amélioration des cellules épithéliales voisines des clones. De plus, un rapporteur DsRED delta de l’hémomectine a montré que, contrairement à quelques amas d’hémocytes trouvés dans les indentations du contrôle, les hémocytes de l’épithélium de l’œil et de l’antennaire s’accumulaient dans le tissu oculaire-antennaire et cérébral composé de tumeurs malignes. Lors de l’inhibition de JNK, le nombre de cellules immunitaires associées a considérablement diminué.

L’augmentation de l’invasivité tumorale, de l’activité JNK et de l’infiltration des hémocytes s’est accompagnée d’une régulation positive significative de l’ARNm MMP1, déterminée par QRTPCR à l’aide d’ARN total isolé de disques oculaires-antennaires en mosaïque disséqués. Une fois maîtrisés, plus de 60 paires de disques oculaires et de cerveaux peuvent être disséqués en 30 minutes. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de générer un nombre suffisant de larves des génotypes souhaités.

Soyez rapide mais précis lors de la dissection pour garder les échantillons destinés à l’isolement de l’ARN libres de RNS. Après la procédure de dissection, le western blot peut être utilisé comme alternative à l’immunomarquage pour évaluer les changements dans l’expression des protéines entre différents génotypes. La création de mosaïques génétiques et leur analyse avec les procédures décrites permet la recherche sur des mutations autrement mortelles et sur les mécanismes de la société oncogène et Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer les tissus en mosaïque de l’œil-disque antennaire et des cerveaux des larves du troisième stade et comment les traiter pour l’immunomarquage, la visualisation de l’activité transgénique et portuaire, l’extraction de l’ARN et la quantification du caractère invasif.

N’oubliez pas que le PFA ainsi que le phénol-chloroforme et le DAPI sont hautement toxiques et que des précautions telles que le port de gants et de vêtements de protection doivent toujours être prises lors du travail avec ces agents.