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L'objectif général de ce protocole est de démontrer comment disséquer les disques imaginaux oculo-anténaires et les cerveaux de drosophile portant des clones marqués par fluorescence et définis génétiquement, ainsi que la manière de les traiter afin de visualiser et de quantifier les modifications d'expression génique et l'invasivité cellulaire. Les procédures décrites peuvent aider à obtenir de nouvelles connaissances sur le rôle des gènes dans le développement épithélial, l'homéostasie ou les maladies, ainsi que sur les mécanismes sous-jacents à leur compétition, à la prolifération compensatoire ou à la coopération interclonale. Le principal avantage de cette étude réside dans le fait que nous fournissons un ensemble complet de protocoles adaptés à une analyse qualitative et quantitative approfondie des mosaïques génétiques chez la drosophile.

En général, les personnes débutant avec le modèle drosophile éprouvent des difficultés car elles ne parviennent pas à distinguer le disque imaginal oculo-antennal des autres disques imaginaires. Pour faciliter la reconnaissance du disque imaginal oculo-antennal portant des clones marqués de façon fluorescente à l'intérieur du corps de la larve, il est recommandé d'effectuer les dissections initiales sous un microscope fluorescent. L'analyse en mosaïque avec un marqueur cellulaire répressible, ou MARCM, permet la génération de taches clonales génétiquement définies dans un contexte sinon phénotypiquement sauvage.

Une FLP dirigée par un promoteur eyeless catalyse une recombinaison entre deux éléments FRT encadrant une cassette d'arrêt marquée par un gène jaune. Après la réplication de l'ADN, la FLP catalyse l'échange des chromatides non sœurs entre les chromosomes homologues, générant des chromatides sœurs : l'une portant l'allèle de type sauvage et le répresseur Gal80, l'autre portant l'allèle muté.

Lors de la mitose, ceux-ci se séparent pour produire deux cellules filles, l'une étant un mutant homozygote et l'autre de type sauvage. La perte du répresseur Gal80 permet l'expression de la GFP dans le mutant, tandis que les cellules de type sauvage restent négatives pour la GFP. Pour commencer l'expérience, récoltez les larves mosaiques en pulvérisant du PBS dans le flacon à mouches afin de recouvrir la surface de la nourriture.

Ensuite, attendrir la couche supérieure à l’aide d’une spatule et verser la suspension alimentaire contenant les larves dans une boîte de Pétri. Prélever délicatement les larves et les transférer dans une boîte pour embryons remplie de PBS. Collecter au moins 20 larves pour l’immunomarquage et 80 larves pour la quantification de l’invasivité tumorale.

Lavez les larves avec du PBS pour éliminer tous les résidus de nourriture. À l’aide d’un microscope stéréo fluorescent avec un grossissement de 8:16x, identifiez et éliminez toutes les larves leopard, qui présentent des taches positives pour la GFP réparties aléatoirement sur tout le corps. Placez la boîte contenant les larves restantes dans du PBS sur de la glace jusqu’à la dissection.

Pour disséquer le disque imaginal oculo-anténal au microscope stéréo, utilisez une paire de pinces et saisissez délicatement la larve à environ 2/3 de la longueur du corps en arrière de la tête. Avec la seconde paire de pinces, saisissez les crochets buccaux de la larve et tirez-les vers l'extérieur du corps. À l'aide des pinces, détachez les crochets buccaux de la cuticule superposée et des tissus accessoires tels que les glandes salivaires et le corps gras.

Alternativement, pour préparer le complexe cérébral des disques oculo-antennaires en conservant le cordon nerveux ventral intact, utiliser une pince pour couper une larve au milieu du corps. Jeter la moitié postérieure. Tenir la moitié antérieure du corps larvaire avec les pointes d'une paire de pinces, puis retourner la larve à l'envers en poussant les crochets buccaux vers l'intérieur à l'aide de la pointe de la seconde paire et en roulant l'excuticule par-dessus avec la première paire de pinces.

Retirez soigneusement tous les tissus accessoires, y compris l'intestin, le corps grasseux et les glandes salivaires. Écartez délicatement les crochets buccaux de la cuticule. Libérez le complexe cérébral des disques oculo-antennaires attaché aux crochets buccaux en sectionnant les prolongements axonaux provenant du cordon nerveux ventral vers les muscles et l'épiderme.

Pour transférer le tissu, commencez par enduire une pointe de micropipette P20 en aspirant et expulsant plusieurs fois les restes de carcasse corporelle, puis utilisez la même pointe pour transférer le tissu disséqué. Pour transférer des complexes plus grands comprenant les disques oculo-anténaires et le cerveau, pré-coupez la pointe P20 afin d'agrandir l'ouverture. Fixez les échantillons dans 400 µL de fixateur PFA 4 % pendant 25 minutes à température ambiante sous agitation douce (nutation).

Ensuite, retirez le fixateur et lavez les échantillons avec du PBST trois fois pendant 10 minutes en agitant doucement. Remplacez ensuite le PBST par 500 microlitres de solution de coloration au DAPI et agitez doucement pendant 15 minutes à l'abri de la lumière. Lavez le tissu une fois pendant 10 minutes avec du PBST.

Pour terminer la dissection, utilisez une pipette de un millilitre pour transférer le tissu dans un plat en verre rempli de PBS. À l’aide de deux paires de pinces, séparez les cerveaux destinés à la quantification de l’invasivité des disques oculo-antennaires en coupant les pédoncules optiques. Libérez les disques oculo-antennaires en les détachant des crochets buccaux.

Placer une goutte de milieu de montage sur une lame porte-objet et, à l’aide de pinces, répartir le liquide en une couche fine. Pour quantifier l'invasivité, placer au moins 80 cerveaux entiers fixés par génotype sur une seule lame. Redresser et positionner le tissu selon le souhait.

Toucher doucement un bord de la lame à couvrir au milieu et l'abaisser lentement à l'aide de pinces afin d'éviter la formation de bulles. Utiliser un essuie-labette pour absorber l'excès de milieu de montage sur les bords. Le tissu peut maintenant être examiné par imagerie confocale.

Demander à une tierce personne de rendre les préparations anonymes afin que l'évaluation soit impartiale. Faire analyser les préparations indépendamment par au moins deux chercheurs. Ne révéler les génotypes qu'après l'achèvement de l'évaluation.

Évaluer le degré de malignité à l’aide d’un microscope stéréo à fluorescence équipé d’un jeu de filtres GFP. À l’aide d’un marqueur, étiqueter les cerveaux déjà observés afin d’éviter les comptages doubles. Des images confocales en fluorescence montrent des cerveaux disséqués à partir de larves portant des tumeurs clonales malignes GFP marquées, mutantes pour RAS V12 et scribble, colorées avec le DAPI.

Les panneaux représentent les quatre grades différents d'invasivité tumorale. Une quantification impartiale a révélé que l'inhibition de la signalisation JNK et des clones RAS V12 scribbled un supprime l'invasivité tumorale. Dans les disques oculaires-antennaires contrôles, le rapporteur sensible au JNK TRE-DsRED marque uniquement une fine bande de cellules s'étendant de la partie antennaire à la partie oculaire.

En revanche, l'activité TRE-DsRED était nettement accrue dans les tumeurs malignes clonales positives pour la GFP. Au jour 8, les cellules tumorales envahissaient les disques oculo-antennaires et s'étendaient vers le cordon nerveux ventral. Les cellules tumorales envahissantes présentaient également une activation accrue de la JNK par rapport aux tissus environnants.

Bien que le blocage de la JNK ait clairement réduit l'activité de TRE-DsRED dans les clones tumoraux, l'augmentation de l'intensité laser a révélé un renforcement chez les cellules épithéliales voisines des clones. De plus, un rapporteur hemolectin delta DsRED a montré que, contrairement à quelques agrégats d'hémocytes présents dans les indentations de l'épithélium oculo-antennal témoin, les hémocytes s'accumulaient dans les tissus oculo-antennal et cérébral composés de tumeurs malignes. Lors de l'inhibition de la JNK, le nombre de cellules immunitaires associées a fortement diminué.

L'augmentation de l'invasivité tumorale, de l'activité de la JNK et de l'infiltration des hémocytes était accompagnée d'une surexpression significative de MMP1 mARN, comme déterminé par RTqPCR à l'aide d'ARN total isolé à partir de disques oculo-antennaires mosaïques disséqués. Une fois maîtrisée, cette technique permet de disséquer plus de 60 paires de disques oculaires et des cerveaux en 30 minutes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de générer un nombre suffisant de larves présentant les génotypes souhaités.

Soyez rapide mais précis lors de la dissection afin de maintenir les échantillons destinés à l'isolement d'ARN exempts d'ARNases. Après la dissection, le western blot peut être utilisé comme alternative à l'immunomarquage pour évaluer les modifications de l'expression protéique entre différents génotypes. La création de mosaïques génétiques et leur analyse à l'aide des procédures décrites permettent d'étudier des mutations normalement létales ainsi que les mécanismes de coopération des oncogènes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de comprend游戏副本

Rappelez-vous que le PFA ainsi que le phénol-chloroforme et le DAPI sont hautement toxiques, et que des précautions telles que le port de gants et de vêtements de protection doivent toujours être prises lors de l'utilisation de ces agents.