À haut débit robotisé Isolation assistée sensible à la température létale Mutants en

L'objectif général de la procédure est d'utiliser la robotique et des tests standardisés pour faciliter l'isolement de mutations lételles sensibles à la température chez Chlamydomonas, afin de déterminer les gènes et voies essentiels chez cet organisme. Nous nous intéressons à la fois à la conservation et à la divergence des fonctions cellulaires essentielles chez les eucaryotes. Et la manière dont nous aimons étudier cela consiste à utiliser des mutations qui perturbent les gènes essentiels impliqués dans ces processus.

Pour que cela fonctionne correctement, vous avez besoin d'une collection vraiment exhaustive de mutants, et les méthodes dont vous allez entendre parler sont notre façon de générer une telle collection. Nous travaillons avec l'algue verte Chlamydomonas reinhardtii, représentante du règne végétal. Le principal avantage de cette technique est que des mutations létales sensibles à la température peuvent probablement être trouvées dans chaque voie essentielle.

La méthode ne nécessite aucune connaissance préalable ni mutagenèse ciblée. La fonction moléculaire du gène muté est suggérée immédiatement à partir du phénotype létal. Cela nous aide à sélectionner des mutations intéressantes perturbant diverses voies de siala au-delà du contrôle du cycle cellulaire.

Pour réaliser une mutagénèse par UV, cultiver des cellules de Chlamydomonas jusqu'à une DO 750 comprise entre 0,2 et 0,5 dans 100 millilitres de milieu Tris-Acétate-Phosphate, ou TAP, sous lumière à 25 degrés Celsius et agitation à 100 tr/min. La mutagénèse par UV est effectuée indépendamment dans deux fonds génétiques selon le protocole décrit dans le texte. Examiner un échantillon de chaque culture au microscope afin de s'assurer que les cellules sont viables et non contaminées.

Ensuite, diluez la culture jusqu'à une DO 750 de 0,003, puis enveloppez la bouteille dans du papier d'aluminium afin d'assurer une densité homogène, car la souche est mobile et nage de manière directionnelle en réponse à la lumière. Après avoir ajusté la densité de la suspension conformément au protocole décrit dans le texte, fixez une petite cassette de tube adaptée à un distributeur de liquide et effectuez une série de lavages destinés à la stérilisation, selon les instructions du fabricant, afin d'éviter toute contamination. À l’aide d’une cassette distributeur équipée de huit seringues, déposez quatre fois 96 gouttes de deux microlitres chacune de la culture sur des plaques rectangulaires sèches.

Tapotez doucement sur le bord de la plaque pour vous assurer que toutes les gouttes fusionnent en une fine couche de liquide, puis recouvrez immédiatement les plaques pour éviter toute exposition à la lumière. Une fois sèches, placez les plaques sous une lampe UV germicide pendant des durées déterminées empiriquement afin d'obtenir un rendement optimal de mutants ts parmi les survivants. Ensuite, transférez les plaques à l'obscurité pendant huit à 24 heures à température ambiante.

Ensuite, placer les plaques dans une étuve à 21 degrés Celsius avec éclairage. Après environ 10 jours, lorsque les colonies sont développées mais non fusionnées, charger les plaques dans la pile correspondante en tant que sources pour la sélection robotisée des colonies. Puis prélever les colonies pour des réseaux 384 sur des plaques rectangulaires et les faire croître à 21 degrés Celsius avec éclairage pendant environ une semaine.

À l’aide d’un robot de copiage par réplication, condenser les réseaux de 384 puits en un réseau de 1536 puits et laisser les plaques croître dans l’incubateur à 21 degrés Celsius pendant environ trois jours. Répliquer les réseaux de 1536 puits sur deux plaques chacun et placer l’une dans l’incubateur à 21 degrés Celsius et l’autre dans un incubateur à 33 degrés Celsius. Après 24 heures à 33 degrés Celsius, répliquer les plaques provenant de l’incubateur à 33 degrés Celsius sur un nouveau jeu de plaques préchauffées et les placer dans l’incubateur à 33 degrés Celsius.

Après trois jours de croissance à 33 degrés Celsius et cinq jours de croissance à 21 degrés Celsius, utiliser un appareil photo numérique pour photographier une plaque quadrillée marquée de neuf indicateurs d'alignement. Ensuite, photographier les plaques en alternant les plaques à 21 degrés Celsius suivies des plaques correspondantes à 33 degrés Celsius, toutes placées dans un cadre fixe afin de préserver l'orientation exacte. Traiter les images appariées des plaques à 21 et 33 degrés Celsius à l'aide d'un logiciel personnalisé d'analyse d'images Matte Lab afin d'éliminer le fond et de segmenter les images en une matrice de 1536 éléments.

Le programme déterminera la biomasse détectée en tant qu'intensité totale des pixels à chaque position. Chargez la liste des colonies sélectionnées générée par le logiciel sous forme de fichier d'instruction pour le robot de prélèvement individuel des colonies. Préparez ensuite les plaques source et cible conformément aux instructions du robot et laissez le robot transférer les colonies sélectionnées vers une matrice.

Placer les plaques cibles dans l'incubateur à 21 degrés Celsius pendant environ cinq jours afin d'obtenir une plaque stock. Après avoir réalisé un deuxième dosage d'accumulation de biomasse et répliqué 100 plaques de blocs selon le protocole décrit, répliquer la version fraîche des 100 plaques de blocs en trois exemplaires. Après la mise en place de la troisième plaque dans le robot et le dépôt des colonies, prendre des photomicrographies d'une région de chaque point des plaques de criblage aux temps zéro, puis placer les plaques à 33 degrés Celsius pour incubation.

À différents moments après avoir retiré les plaques de criblage de l'incubateur à 33 degrés Celsius, prenez rapidement des photomicrographies, en veillant à ce que le support de plaque et le contrôleur de plateau soient précisément calibrés pour obtenir des images des mêmes cellules à chaque point temporel. Analysez les images microscopiques et sélectionnez les mutants selon les critères souhaités. Déposez le jeu final sélectionné sur une plaque d'agar en réseau 96, en vous assurant que chaque plaque contient des mutants du même type d'accouplement et de résistance au médicament.

Transférez de grandes quantités des colonies en réseau vers un milieu d'induction des gamètes sans azote dans des microplaques de 96 puits. Incubez les plaques à la lumière pendant environ cinq heures pour permettre la gamétogenèse. Suspendez les souches de type de conjugaison opposé portant les cassettes de résistance alternatives dans des tubes contenant le milieu d'induction des gamètes sans azote afin d'induire la gamétogenèse.

Mélangez les échantillons provenant d'une plaque cible dans un volume de 20 microlitres de milieu de croisement. Après environ 10 minutes d'exposition à la lumière, déposez cinq microlitres de chaque puits deux fois : une fois sur une plaque TAP pour le test de liaison génétique et une fois sur une plaque TAP additionnée de cinq micromoles de paro et de neuf micromoles d'hygro pour le test de complémentation.

Après l'incubation des plaques de test de complémentation, répliquer les plaques en deux exemplaires pour l'identification du phénotype ts. Tester les colonies pour le phénotype ts selon le protocole décrit dans le texte. Après irradiation de cellules individuelles de Chlamydomonas, les cellules sont laissées en croissance pendant dix jours à une température permmissive, puis sélectionnées selon un format ordonné, comme illustré ici.

Les plaques obtenues au format 384 sont regroupées en une matrice 1536. Trois durées d'exposition aux UV ont été testées afin de générer des mutants ts de Chlamydomonas. Empiriquement, une durée d'exposition de 1,5 minute a donné le plus grand nombre de mutants ts.

Cependant, de loin, le temps d'exposition d'une minute a permis d'obtenir la majorité des candidats du cycle cellulaire. Dans cette expérience, deux tests phénotypiques de température sensible (ts) consécutifs ont été réalisés, et environ 3000 mutants ts ont été isolés et caractérisés phénotypiquement par microscopie en temps différé. Comme indiqué ici, afin d'éliminer les gènes fortement récurrents du pipeline en aval, des tests de complémentation et de liaison avec des gènes déjà caractérisés possédant plus de deux allèles ont été effectués en parallèle avec les nouveaux candidats recueillis.

Ces colonies ne montrent aucune complémentation avec la souche interrogée et constituent donc de nouveaux allèles ts pour le gène étudié. Elles sont généralement exclues de toute caractérisation ultérieure. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en haut débit.

Des milliers de mutants ts peuvent être isolés en seulement deux ou trois cycles de mutagenèse. Une étape clé après l'isolement des mutants ts consiste à sélectionner un sous-ensemble pour une étude approfondie, et il est très intéressant d'observer la variété des phénotypes létaux. Le phénotypage fournit des indices sur la fonction moléculaire et nous aide également à hiérarchiser les mutants pour des études ultérieures.

Gardez à l'esprit que les mutants peuvent présenter des centaines ou des milliers de mutations dans leur génome. Habituellement, une seule est causale, bien que parfois deux mutations soient nécessaires pour le phénotype ts, ce qui peut être déterminé par une analyse tétrade. Suite à cette procédure, les mutations causales peuvent être identifiées par un séquençage de nouvelle génération des échantillons regroupés. Les gènes identifiés présenteront parfois des mutations suggérant une fonction, ou peuvent correspondre à des séquences nouvelles et inconnues, ce qui est intéressant et passionnant.

Chlamydomonas a constitué un excellent système modèle pour l'étude de la biologie cellulaire dans le règne végétal. Les protocoles dont vous avez entendu parler devraient permettre d'explorer cet organisme pour des processus essentiels qui ont été relativement peu étudiés, et nous espérons que les résultats seront également pertinents pour l'ensemble du règne végétal.