À haut débit robotisé Isolation assistée sensible à la température létale Mutants en Chlamydomonas reinhardtii

L’objectif global de la procédure est d’utiliser la robotique et des tests standardisés pour rationaliser l’isolement des mutations létales sensibles à la température chez Chlamydomonas afin de déterminer les gènes et les voies essentiels dans cet organisme. Nous nous intéressons à la fois à la conservation et à la divergence des fonctions cellulaires essentielles chez les eucaryotes. Et la façon dont nous aimons étudier cela est avec des mutations qui perturbent les gènes essentiels dans ces processus.

Pour que cela fonctionne bien, vous avez besoin d’une collection vraiment complète de mutants et les méthodes dont vous entendrez parler sont notre façon de générer une telle collection. Nous travaillons sur l’algue verte Chlamydomonas reinhardtii en tant que représentante du règne végétal. Le principal avantage de cette technique est que des mutations létales sensibles à la température peuvent probablement être trouvées dans toutes les voies essentielles.

La méthode ne nécessite aucune connaissance préalable ni mutagénèse ciblée. La fonction moléculaire du gène muté est immédiatement suggérée à partir du phénotype létal. Cela nous aide à sélectionner des mutations intéressantes perturbant diverses voies siala au-delà du contrôle du cycle cellulaire.

Pour réaliser la mutagénèse UV, cultivez des cellules de Chlamydomonas jusqu’à une OD 750 de 0,2 à 0,5 dans 100 millilitres de Tris-Acétate-Phosphate, ou TAP, sous une lumière à 25 degrés Celsius et en secouant à 100 tr/min. La mutagenèse UV est réalisée indépendamment dans deux contextes génétiques selon le protocole textuel. Vérifier un échantillon de chaque culture au microscope pour s’assurer que les cellules sont viables et sans contamination.

Ensuite, diluez la culture à une OD 750 de 0,003, puis enveloppez la bouteille avec une feuille d’aluminium pour assurer une densité homogène car la souche est modale et nage dans le sens de la lumière en réponse à la lumière. Après avoir ajusté la densité de la suspension selon le protocole textuel, fixez une petite cassette tubulaire qui s’adapte à un distributeur de liquide et effectuez une série de lavages pour la stérilisation, selon les instructions du fabricant, pour éviter la contamination. À l’aide d’une cassette distributrice de liquide à huit seringues, distribuer quatre gouttes par 96 gouttes de deux microlitres chacune de culture sur des plaques rectangulaires sèches.

Tapotez doucement sur le bord de la plaque pour assurer la fusion de toutes les gouttes en une fine feuille de liquide et recouvrez immédiatement les plaques pour éviter l’exposition à la lumière. Une fois séchées, placez les plaques sous une lampe UV germicide pendant des périodes de temps déterminées empiriquement pour donner un rendement optimal de ces mutants parmi les survivants. Ensuite, transférez les plaques dans l’obscurité pendant huit à 24 heures à température ambiante.

Placez ensuite les plaques dans un incubateur à 21 degrés Celsius avec éclairage. Après environ 10 jours, lorsque les colonies sont cultivées mais non fusionnées, chargez les plaques dans la pile appropriée comme sources pour la cueillette robotisée des colonies. Ensuite, choisissez des colonies pour 384 réseaux sur des plaques rectangulaires et cultivez-les à 21 degrés Celsius avec un éclairage pendant environ une semaine.

À l’aide d’une réplique de robot de placage, condensez les 384 réseaux en un réseau de 1536 et laissez les plaques croître dans l’incubateur à 21 degrés Celsius pendant environ trois jours. Répliquez les 1536 réseaux sur deux plaques chacun et placez-en un dans l’incubateur à 21 degrés Celsius et l’autre dans un incubateur à 33 degrés Celsius. Après 24 heures à 33 degrés Celsius, reproduisez les plaques de l’incubateur à 33 degrés Celsius sur un nouvel ensemble de plaques préchauffées et placez-les dans l’incubateur à 33 degrés Celsius.

Après trois jours de croissance à 33 degrés Celsius et cinq jours de croissance à 21 degrés Celsius, utilisez un appareil photo numérique pour photographier une plaque de grille marquée de neuf indicateurs d’alignement. Ensuite, photographiez les plaques, en alternant des plaques de 21 degrés Celsius suivies des plaques de 33 degrés Celsius correspondantes, toutes les plaques étant placées dans un cadre fixe pour préserver l’orientation exacte. Traitez les images appariées de 21 et 33 plaques à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images de laboratoire mat personnalisé afin d’éliminer l’arrière-plan et de segmenter les images en réseau 1536.

Le programme déterminera la biomasse détectée en tant qu’intensité totale des pixels dans chaque position. Chargez la liste des colonies sélectionnées générée par le logiciel sous forme de fichier d’instructions pour la robotique de prélèvement d’une seule colonie. Préparez ensuite les plaques source et cible selon les instructions de la robotique et laissez le robot choisir les colonies sélectionnées dans un tableau.

Placez les plaques cibles dans l’incubateur à 21 degrés Celsius pendant environ cinq jours pour faire pousser une plaque stock. Après avoir effectué un deuxième test d’accumulation de biomasse et répliqué 100 plaques de blocs selon le protocole de texte, répliquez la nouvelle copie des 100 plaques de blocs en trois copies. Après la mise en place de la troisième plaque dans le robot et le repérage des colonies, prenez des photomicrographies d’une région de chaque point des plaques de criblage à des fois zéro et placez les plaques à 33 degrés Celsius pour l’incubation.

À différents moments après avoir retiré les plaques de criblage de l’incubateur à 33 degrés Celsius, prenez rapidement des photos-micrographies, en vous assurant que le support de plaque et le contrôleur de platine sont calibrés avec précision pour obtenir des images des mêmes cellules à chaque point temporel. Analysez des images microscopiques et sélectionnez-les pour les mutants en fonction des critères souhaités. Repérez l’ensemble final sélectionné dans une plaque de gélose disposée à 96 unités, en vous assurant que chaque plaque contient des mutants du même type d’accouplement et de résistance aux médicaments.

Transférez de grandes quantités de colonies disposées dans un milieu d’induction de gamètes sans azote sur des microplaques de 96 puits. Incuber les plaques sous la lumière pendant environ cinq heures pour permettre la gamétogenèse. Suspendez les requêtes avec les types d’accouplement opposés hébergeant les cassettes de résistance alternatives dans des tubes avec un milieu d’induction de gamètes sans azote pour la gamétogenèse.

Mélangez les échantillons d’une plaque cible dans un volume de mélange d’accouplement de 20 microlitres. Après environ 10 minutes sous la lumière, repérez deux fois cinq microlitres de chaque puits. Une fois sur une plaque TAP pour un essai de liaison et une fois sur un TAP plus un paro de cinq micromoles plus un hygro de neuf micromoles pour un essai de complémentation.

Après avoir incubé les plaques d’essai de complémentation, répliquez les plaques en deux copies pour l’identification du phénotype. Testez les colonies pour le phénotype ts selon le protocole de texte. Après l’éradiation de cellules uniques de Chlamydomonas, les cellules sont laissées se développer pendant dix jours à une température permissive, puis cueillies dans un format en rangée, comme on le voit ici.

Les plaques résultantes au format 384 sont fusionnées dans un tableau 1536. Trois durées d’exposition aux UV ont été testées pour générer des mutants de Chlamydomonas. Empiriquement, le temps d’exposition de 1,5 minute a donné le plus de mutants.

Cependant, de loin, le temps d’exposition d’une minute a donné la plupart des candidats du cycle cellulaire. Dans cette expérience, deux tests séquentiels de phénotype ts ont été effectués et environ 3000 mutants ts ont été isolés et caractérisés phénotypiquement par microscopie à intervalle de temps. Comme on l’a vu ici, pour éliminer les gènes hautement récurrents du pipeline en aval, des tests de complémentation et de liaison avec des gènes déjà caractérisés avec plus de deux allèles ont été effectués sur des candidats nouvellement collectés.

Ces colonies ne montrent aucune complémentarité avec la requête et sont donc un nouvel allèle ts pour le gène interrogé. Ceux-ci sont généralement exclus de toute caractérisation ultérieure. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en haut débit.

Des milliers de mutants ts peuvent être isolés en seulement deux ou trois cycles de mutagénèse. Une étape clé après l’isolement des mutants ts est de sélectionner un sous-ensemble pour une étude plus approfondie et il est très intéressant de voir la gamme de phénotypes mortels. Le phénotypage fournit des indices sur la fonction moléculaire et nous aide également à hiérarchiser les mutants pour une étude plus approfondie.

Gardez à l’esprit que les mutants peuvent avoir des centaines ou des milliers de mutations dans leurs génomes. Habituellement, une seule est causale, bien que parfois deux mutations soient nécessaires pour le phénotype ts, ce qui peut être déterminé par l’analyse tétra. À la suite de cette procédure, les mutations causales peuvent être identifiées par l’analyse de séquençage de nouvelle génération des gènes regroupés. Les gènes identifiés auront parfois des mutations suggérant une fonction ou ils peuvent être de nouvelles séquences inconnues, ce qui est intéressant et excitant.

Chlamydomonas a été un formidable système modèle pour l’étude de la biologie cellulaire dans le règne végétal. Les procédures dont vous avez entendu parler devraient ouvrir l’étude de cet organisme pour des processus essentiels qui ont été relativement peu étudiés et nous espérons que les résultats seront également pertinents pour le règne végétal plus large.