Protocole rapide pour la préparation de électrocompétentes Escherichia coli Et Vibrio cholerae

L’objectif global de cette procédure est de générer rapidement et facilement des bactéries compétentes le même jour. Ils sont nécessaires à la transformation. Pour ce faire, les bactéries sont d’abord placées sur de la gélose LB et les ont incubées pendant quatre à six heures.

Ensuite, la pelouse bactérienne est soigneusement récoltée à la surface de la gélose et la pastille est remise en suspension dans de l’eau froide stérile ou un tampon. Ensuite, la pastille bactérienne est lavée trois fois à quatre degrés Celsius et remise en suspension dans 40 microlitres. Enfin, les cellules compétentes sont électroporées en présence d’ADN.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent des niveaux de transformation bactérienne comparables à ceux obtenus avec la méthode traditionnelle qui nécessite un équipement considérable, de grands volumes de cultures bactériennes et des tampons stériles. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que des bactéries fraîches et compétentes peuvent être préparées pratiquement à partir de n’importe quelle souche de laboratoire le jour même où la transformation est planifiée sans avoir besoin de grandes centrifugeuses, de rotors ou de leaders de tampons et de cultures stériles. L’auteur de ce protocole ne peut pas être identifié car il a été utilisé et optimisé par de nombreux chercheurs au fil du temps.

La méthode présentée ici est utilisée dans nos laboratoires depuis près de deux décennies, et notre objectif est de partager ce protocole utile avec nos pairs. La démonstration visuelle de cette méthode est importante pour une étape. En particulier, le prélèvement des bactéries de la pelouse sur la tarière car il faut un œil expérimenté pour évaluer la croissance sur la plaque.

Et c’est ce qui est le mieux visualisé. Mme Theresa Brooks, assistante de recherche du laboratoire du Dr Te Koski à l’Université de l’Alberta à Edmonton, au Canada, fait la démonstration de la procédure. Pour commencer la préparation de la culture bactérienne en fin d’après-midi, utilisez une petite quantité de e coli ou de v coray pour inoculer un à cinq millilitres de bouillon LB autoclave dans des tubes à essai stériles en verre de bo silicate.

Placez les tubes à essai inoculés dans un tambour à rouleaux et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius et à grande vitesse. Préparez un épandeur de cellules en forme de crosse de hockey à partir d’une tige de verre en chauffant le milieu de la tige dans la flamme d’un bec Bunsen jusqu’à ce que le verre se ramollisse. Ensuite, utilisez une pince à épiler ou une pince pour diriger doucement le pli dans un angle de 135 degrés.

Chauffez à nouveau la tige à mi-chemin entre l’extrémité et le premier pli et pliez-la à un angle de 45 degrés vers l’intérieur. Préparez des aérations de lb avec et sans antibiotiques et conservez-les à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin.

Déposer 100 microlitres de culture pendant la nuit sur chaque plaque de gélose LB. À l’aide de l’épandeur de cellules, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant quatre à six heures ou jusqu’à ce qu’une fine pelouse de croissance bactérienne devienne visible. À l’aide d’une boucle d’inoculation, prélevez une masse bactérienne d’environ deux millimètres de diamètre dans la plaque et suspendez-la dans un millilitre de glace froide.

Chlorure de calcium de deux millimolaires. Si vous utilisez du v coray ou de l’eau stérile doublement distillée pour E. coli à l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée réglée à quatre degrés Celsius, essorez la suspension pendant cinq minutes à 5 000 G.Jetez le surnageant et répétez le lavage deux fois de plus. Après avoir retiré le dernier surnageant, suspendez la pastille dans 40 microlitres de chlorure de calcium ou d’eau doublement distillée et conservez-la sur de la glace.

Pour effectuer une transformation, ajoutez jusqu’à un microgramme d’ADN plasmatique à la suspension bactérienne de 40 microlitres et transférez le mélange dans un espace stérile pré-refroidi de 0,2 centimètre. Vete, insérez le vete dans la chambre d’électroporation du module de commande d’impulsion et mangez à 1,8 kilovolts et 25 micro phs. La constante de temps doit être d’environ 5,0 millisecondes et aucun arc électrique ne doit se produire.

Remettez rapidement les cellules en suspension dans un millilitre de bouillon LB et transférez-les dans un tube à essai en verre de gril préalablement autoclave. Laissez les cellules se rétablir en les incubant dans des conditions de croissance aérée à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes sans sélection d’antibiotiques. Placez les bactéries sur des plaques LB ager avec un antibiotique et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Comme le montre ici, nous avons effectué une série de transformations avec e coli et V co array pour comparer l’efficacité de transformation de notre méthodologie rapide avec une adaptation de la méthode traditionnelle décrite à l’origine par doer et al pour la préparation de bactéries électrocompétentes. Le rendement transformant était compris entre 10 du sixième et 10 du septième UFC par microgramme d’ADN dans trois expériences répétées pour e coli et v coray. Utilisation de la méthode traditionnelle pour l’électro-compétence.

La préparation cellulaire, le rendement du transformant est apparu divisé par dix à 10, à cinquième, à 10 à 10 à sixième UFC par microgramme d’ADN dans trois expériences de réplication pour e coli et v coray en utilisant la méthode rapide. Pour cette raison, nous avons déterminé le pourcentage de bactéries transformées en divisant les UFC transformées par le nombre d’UFC récupérées à partir de transformations simulées à partir de lots par ailleurs identiques de cellules compétentes. Le pourcentage de bactéries transformées se situait à l’intérieur d’une bûche.

Peu importe la méthode de préparation et l’espèce transformée. Ces résultats suggèrent que l’efficacité de la méthode rapide est comparable à celle de la procédure traditionnelle plus longue de préparation de cellules compétentes, et que les souches représentatives d’ieo, de coray et d’esia coli se prêtent également à la procédure rapide. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq à six heures, correctement exécutée.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de récolter les bactéries pendant leur phase logarithmique de croissance, de les laver dans une solution d’eau tampon stérile, fraîchement préparée et pré-réfrigérée et de les garder froides jusqu’à ce qu’elles soient remises en suspension dans LB après l’électroporation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer rapidement des cellules spécifiques de souches bactériennes électrocompétentes dans votre laboratoire en les cultivant sur la pelouse inaugurale, en les collectant pendant la phase logarithmique de croissance, puis en les lavant dans un tampon froid en préparation de l’électroporation.