Name: Protocole rapide pour la préparation de électrocompétentes Escherichia coli Et Vibrio cholerae (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-08T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Découvrez une méthode rapide pour préparer des bactéries électrocompétentes d'Escherichia coli et Vibrio cholerae en 5 à 6 heures. Cette technique simplifiée offre des efficacités de transformation comparables aux protocoles traditionnels.

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Les auteurs tiennent à remercier leurs collègues et le personnel des laboratoires présents et passés qui ont soutenu le développement de cette technique. Le laboratoire de SP est soutenu par l&#39;Institut canadien de recherche en santé Subvention de fonctionnement MOP-84473 et Alberta Innovates-Health Solutions (financés par l&#39;Alberta Heritage Foundation for Medical Research Fonds de dotation). PDD a été soutenue par les Instituts nationaux de la santé accorde MD001091-01 et GM068855-02.

Une. Préparation de cultures bactériennes, Outils et réactifs (JOUR 1, après-midi) <ol><li> En fin d&#39;après midi, inoculer 1-5 ml de bouillon LB autoclave dans stérile (par exemple, 100 x 13 mm) des tubes à essai en verre borosilicate avec une petite aliquote de bactéries (E. coli ou V. cholerae). </li><li> Définissez les tubes à essai inoculés dans un tambour de rouleau logé à 37 ° C la température (ambiante ou chaude incubateur), tourner sur le tambour de rouleau à grande vitesse, et incuber O / N. </li><li> Préparer un épandeur de cellule sous la forme d&#39;un &quot;crosse de hockey&quot; à partir d&#39;une tige de verre en chauffant le milieu de la tige dans la flamme d&#39;un brûleur Bunsen jusqu&#39;à ce que le verre se ramollit et ensuite diriger le pli en douceur avec des ciseaux ou des pinces dans un angle de 135 ° . Chauffer la tige une fois de plus dans le point milieu entre l&#39;extrémité et la première courbure et la plier à un angle de 45 ° vers l&#39;intérieur (dans le sens inverse de la première courbure). </li><li> Préparer LB-agar sans antibiotiques et verser dans des boîtes de Pétri dans la préparation de laprotocole electrocompetence, et LB-agar plaques contenant l&#39;antibiotique approprié (selon le marqueur de résistance du vecteur à une électroporation), et conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer un filtre stérilisé 2 mM de CaCl2 solution de V. cholerae, ou autoclave trou DDH 2 O pour E. coli, et conserver à 4 ° C. </li></ol> 2. La croissance de bactéries électrocompétentes (JOUR 2 Matin) <ol><li> Livrer 100 pi de la culture bactérienne O / N sur chaque plaque de gélose LB, les stocks de glycérol congelés peuvent également être utilisés et livrés directement sur la plaque. </li><li> Trempez hockey en forme de bâton cellule épandeur dans EtOH à 100%, les égoutter brièvement et brûler la EtOH restant à stériliser avant utilisation et la diffusion. Diffuser la culture bactérienne 100 pi O / N uniformément avec l&#39;épandeur de cellules de verre stérile veillant à ne pas perturber (pause) la surface de la gélose. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C pendant 4-6 heures, ou jusqu&#39;à ce que une pelouse fine de la croissance bactérienne soitvient distinguer. Les cellules sont les plus compétents lors de la croissance active. </li></ol> 3. Préparation des cellules électrocompétentes bactériennes (JOUR 2, après-midi) <ol><li> Récolter les bactéries avec une anse stérile veillant à ne pas percer ou couper la surface de l&#39;agar-agar. Une masse bactérienne de 2 mm de diamètre est suffisant pour une seule transformation. Typiquement, cela nécessite de raclage de la surface de la pelouse mince avec la boucle d&#39;inoculation deux ou trois fois. Plusieurs échantillons (typiquement entre 4-6) peuvent être collectées à partir de la même plaque. </li><li> Reprendre la masse bactérienne dans 1 ml de glace-froid CaCl2 2 mM (pour V. cholerae) ou le trou DDH 2 O stérile (pour E. coli) et bien mélanger jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y touffes sont visibles, garder sur la glace. </li><li> Centrifugeuse de chaque suspension bactérienne pendant 5 min à 5000 xg dans une microcentrifugeuse réfrigérée réglé à 4 ° C, ou dans une micro stockés dans une chambre froide réglé à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant, resuspterminer le culot bactérien dans le même volume de glacé 2 mM de CaCl2 ou le trou DDH 2 O stérile, et répéter l&#39;étape de centrifugation fait avant que deux fois supplémentaires pour un total de trois lavages. </li><li> Retirer le surnageant, remettre en suspension, puis desserrer le culot bactérien en détail dans 40 ul glacée CaCl2 2 mM stérile ou le trou DDH 2 O et garder sur la glace. </li></ol> 4. Transformation des bactéries électrocompétentes (JOUR 2, après-midi) <ol><li> Ajouter jusqu&#39;à 1 pg d&#39;ADN plasmidique (jusqu&#39;à 1 ul d&#39;eau ou de tampon Tris-EDTA) à la suspension bactérienne 40 pi et le transfert de ce mélange dans un pré-réfrigérés, stérile 0,2 cm d&#39;écart cuvette. La concentration en sel dans l&#39;échantillon d&#39;ADN doit être un peu, car elle contribue à arc électrique de l&#39;impulsion dans l&#39;étape suivante. </li><li> Insérer la cuve dans la chambre d&#39;électroporation du module de commande d&#39;impulsion, et l&#39;électroporation à 1,8 kV, 25 uF. La constante de temps doit être ~ 5,0 msec, et ne doit se produire un arc électrique. </li><li> Récupérer rapidement la suspension cellulaire par remise en suspension dans 1 ml de bouillon LB et transférer dans un tube à essai en verre borosilicate préalablement autoclave. </li><li> Laisser les cellules se rétablir en incubant dans des conditions de croissance gazeuses (dans un rouleau tambour) à 37 ° C pendant 30 min sans sélection par antibiotique. </li><li> Plaquer les bactéries sur les plaques de gélose LB préalablement préparés en présence de l&#39;agent sélectif approprié (antibiotique), et incuber à 37 ° CO / N. Si les bactéries sont transformées avec une concentration élevée de vecteur purifié (0,1 à 1 ug de plasmide superenroulé), délivrer 10 pi de culture bactérienne sur le bord de la plaque de gélose LB et avec une anse d&#39;inoculation strie stérile pour obtenir des colonies isolées en utilisant la méthode de la série de quadrant. Si le mélange de ligation a été transformé, livrer 100 ul de la culture bactérienne sur chaque plaque d&#39;agar et uniformément réparties avec le répartiteur de cellule en verre stérilisée. </li></ol> a Si la constante de temps est court (êtrefaible 3,5 ms), ou pulsation conduit à arc, puis re-précipiter l&#39;échantillon d&#39;ADN, laver avec de l&#39;EtOH à 70% deux fois pour éliminer les sels avant le séchage et la remise en suspension dans du tampon TE.

<ol><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1 (7), 841-845 (1982).</li>
<li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li>
<li>Taketo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transfection+of+Escherichia+coli+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">DNA transfection of Escherichia coli by electroporation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).</li>
<li>Fiedler, S., Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+bacteria+with+plasmid+DNA+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation.</a> Anal. Biochem. 170 (1), 38-44 (1988).</li>
<li>O'Callaghan, D., Charbit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Salmonella+typhimurium+and+Salmonella+typhi+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation.</a> Mol. Gen. Genet. 223 (1), 156-158 (1990).</li>
<li>Hamashima, H., Nakano, T., Tamura, S., Arai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Vibrio+parahaemolyticus%2C+Vibrio+alginolyticus%2C+and+Vibrio+cholerae+non+O-1+with+plasmid+DNA+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, and Vibrio cholerae non O-1 with plasmid DNA by electroporation.</a> Microbiol. Immunol. 34 (8), 703-708 (1990).</li>
<li>Grones, J., Turna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+microorganisms+with+the+plasmid+vector+with+the+replicon+from+pAC1+from+Acetobacter+pasteurianus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Transformation of microorganisms with the plasmid vector with the replicon from pAC1 from Acetobacter pasteurianus.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 (3), 942-947 (1995).</li>
<li>Allen, S. P., Blaschek, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-induced+transformation+of+intact+cells+of+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electroporation-induced transformation of intact cells of Clostridium perfringens.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2322-2324 (1988).</li>
<li>Belliveau, B. H., Trevors, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Bacillus+cereus+vegetative+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55, 1649-1652 (1989).</li>
<li>Chassy, B. M., Flickinger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Lactobacillus+casei+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Transformation of Lactobacillus casei by electroporation.</a> FEMS Microbiol. Lett. 44, 173-177 (1987).</li>
<li>Dunny, G. M., Lee, L. N., LeBlanc, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+electroporation+and+cloning+vector+system+for+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).</li>
<li>Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+coenzyme+M-auxotrophic+mutant+and+transformation+by+electroporation+in+Methanococcus+voltae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae.</a> J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).</li>
<li>Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+particle+SSV1+from+the+extremely+thermophilic+archaeon+Sulfolobus+is+a+virus%3A+demonstration+of+infectivity+and+of+transfection+with+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).</li>
<li>Aune, T. E., Aachmann, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+to+increase+the+transformation+efficiencies+and+the+range+of+bacteria+that+can+be+transformed%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557(1983).</li>
<li>Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+Type+VI+Secretion+System+Expression+Gives+Vibrio+cholerae+Intra-+and+Interspecific+Competitive+Advantages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages.</a> PLoS One. 7 (10), e48320(2012).</li>
</ol>

Aucune déclaration sont applicables.

L&#39;efficacité de transformation est soumise à une variété de facteurs, quelle que soit la méthode employée pour préparer des cellules compétentes. Les variables analogues s&#39;appliquent à cette méthode, un grand soin doit être pris une fois que les cellules sont récoltées à partir de la plaque de gélose telle sorte qu&#39;elles sont maintenues à la température froide constante (pas supérieure à 4 ° C). La pelouse bactérienne doit être en croissance active au moment de la collecte, les cellules doivent être en phase mi-logarithmique de croissance. La qualité de l&#39;ADN (c&#39;est à dire la contamination des sels) influe sur l&#39;efficacité de transformation. Plus précisément, lorsque l&#39;on utilise cette méthode, l&#39;agar-agar ne doit pas être décomposé sous forme de fragments de gélose dans la cuvette se produire un arc électrique de l&#39;impulsion. La plupart des problèmes rencontrés avec cette technique sont associés à deux questions; collecter les bactéries au cours de la fenêtre de temps voulue de la plaque de gélose quand elles sont en croissance active. Collecte trop tôt donnera le nombre de cellules insuffisants et rendra laracler la plaque de gélose LB frustrant parce que la &quot;pellicule&quot; qu&#39;ils forment est difficile à décoller de la surface de la plaque. Collecte des bactéries trop tard diminueront considérablement leur compétence. La fenêtre de temps va naturellement varier en fonction de la densité de l&#39;inoculum plaquées sur des plaques de gélose LB. La deuxième étape est critique pour maintenir la bactérie à froid (4 ° C) à partir du moment où elles sont soulevées hors de la plaque d&#39;agar et remises en suspension dans du CaCl2 ou le trou DDH 2 O jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient étalées sur de la gélose LB transformation suivante. Les tubes à centrifuger contenant les bactéries, les cuvettes et le tampon doivent être pré-refroidi et conservé dans la glace en tout temps jusqu&#39;à ce que les bactéries sont étalées. Toutefois, d&#39;autres problèmes peuvent survenir lorsque le trou DDH 2 O stérile ou CaCl2 contiennent précipité ou sont contaminés. Pour cette raison, nous recommandons de préparer ce réactif frais. transformation de dépannage est facilitée par y compris les contrôles lors de la transformation bacteria rendue compétente par toute méthode. Un contrôle négatif constitué d&#39;un lot de bactéries compétentes non transformées étalées sur une plaque de gélose LB contenant le marqueur sélectif va rapidement aider à déterminer si l&#39;antibiotique sur la plaque est efficace. Une transformation de contrôle positif avec une préparation de plasmide connu de bonne qualité et la quantité hébergeant le même marqueur sélectif que l&#39;échantillon expérimental sera utile pour déterminer si les bactéries sont compétents, mais aussi si l&#39;ADN transformé expérimental était en quantité suffisante ou de qualité. Les avantages de cette technique sont multiples, le procédé peut être effectué dans la même journée que la transformation est prévue pour. Nous avons constaté que le glycérol congelés bactérienne actions peut être plaqué directement sur la gélose LB sans aucune perte de electrocompetence, nous l&#39;avons fait dans des situations «d&#39;urgence» (après avoir oublié de commencer la culture de la nuit la veille). Bien que nous n&#39;avons pas pu tester etrès souche connue, tout E. coli ou de V. souche cholerae qui peut être transformée par électroporation a été prête à ce protocole dans nos mains. La technique est rapide, efficace, et les rendements de transformation efficacité comparables à ceux obtenus à partir de la préparation de bactéries électrocompétentes employant des méthodes traditionnelles. La méthode élimine la nécessité pour centrifugeuse à grande vitesse et rotors associés, un agitateur incubateur orbital et seaux à centrifuger stériles (conteneurs), et de grands volumes de tampon autoclave. Bien que le tableau des réactifs et des équipements spécifiques est assez complet, la plupart des laboratoires qui effectuent électroporation auront la plupart, sinon la totalité, de ces matériaux déjà disponibles. Peut-être plus important encore, la technique peut être facilement appliquée à générer des souches electrocompétentes spécifiques du laboratoire avec les milieux mutants rapidement. Nous ne sommes pas conscients des limitations de cette technique car elle a remplacé la méthode traditionnelle de préparation des électrocompetent bactéries dans nos laboratoires. Les résultats de nos expériences montrées ici ont été réalisées avec des cellules électro-compétentes fraîches produites avec la méthode traditionnelle qui avaient été stockés à -80 ° C pendant une durée de 1 semaine. Toutefois, les stocks de cellules électrocompétentes congelées perdent la compétence et la viabilité ou sur de longues périodes de stockage. Notre protocole abrégée permet la préparation de cellules électro frais le jour même de la transformation est prévue sans préoccupations au sujet de l&#39;âge du stock qui peut entraîner un rendement transformant diminué. Nous n&#39;avons pas essayé le stockage des cellules électrocompétentes produites en utilisant la méthode rapide pour une utilisation sur un autre jour que cela n&#39;a pas été nécessaire. Bien que non représenté ici, l&#39;efficacité des cellules électrocompétentes préparés en utilisant notre méthode rapide est suffisante pour les mélanges de ligature. Les transformations signalés pour non-O1 V. cholerae dans un article récent de Unterweger et al.17 ont été réalisées en utilisant des bactéries électrocompétentes préparés par le procédé décrit ici (sauf ceux effectués par conjugaison). Cette technique permet aux chercheurs de transformer des souches mutantes ayant des antécédents rapidement et efficacement sans avoir à préparer de grands lots de cellules. Cette préparation rapide de la méthode de bactéries électrocompétentes pourrait être adapté à d&#39;autres procaryotes qui ont été montrés à se prêter à l&#39;électroporation que le principe de préparation et les paramètres d&#39;électroporation vont être les mêmes que celles des protocoles traditionnels.

Depuis sa &quot;création au début des années 1980 1, l&#39;électroporation est devenue une technique de biologie moléculaire intégrante, probablement la méthode la plus couramment utilisée pour transformer / transfecter des cellules vivantes avec des acides nucléiques circulaires ou linéaires. Développé à l&#39;origine pour la transfection de cellules eucaryotes 1, électroporation a été ensuite adapté pour la transformation de E. coli 2, 3. En bactériologie, l&#39;électroporation est devenu le standard de laboratoire et a été modifié pour transformer un large éventail de bactéries, y compris Pseudomonas Gram négatif 4, salmonelles 5, vibrions 6, Serratiae, et Shigella 7; Clostridium Gram positif 8, bacilles 9, lactobacilles 10 et entérocoques 11. Même certains Archaebacteria ont été influencées par la transformation par électroporation, y compris Methanococci </em&gt; 12 et de l&#39;espèce Sulfolobus 13. Pour un examen complet s&#39;il vous plaît se référer à Aune et Aachmann 14. L&#39;efficacité de la transformation par électroporation est censément 10-20 fois plus élevée que la compétence chimique ou choc thermique 2. Cependant, tout comme la préparation de bactéries de la compétence chimique optimisée par Douglas Hanahan dans les années 1980 15, les cellules doivent également être prêts à être électrocompétent. L&#39;électroporation est un moyen rapide et efficace pour la transformation bactérienne, ce qui nécessite des bactéries électrocompétentes, de l&#39;ADN purifié, un module de commande d&#39;impulsions qui délivre l&#39;impulsion électrique, et une chambre qui reçoit les petites cuvettes jetables qui fonctionnent comme une électrode. En bref, le froid, les bactéries compétentes sont mélangés avec de l&#39;ADN plasmidique, soumises à une impulsion de haute tension dans une cuvette, remis en suspension dans un milieu de croissance, on incube à 30-37 ° C pendant 30-45 min, puis étalées sur milieu semi-solide (gélose nutritive plaques) avec l&#39;appropriate antibiotique sélectif. A la différence de l&#39;étape de pulsation, la préparation de électrocompétentes E. coli reste une procédure en plusieurs qui est traditionnellement réalisée dans des volumes importants. En bref, une culture d&#39;une nuit de bactéries est inoculée dans une fiole d&#39;Erlenmeyer de 100 ml à 1 litre de bouillon de Luria (LB), cultivées jusqu&#39;à la phase mi-logarithmique de croissance (DO600 &lt;1,0), et soumis à des lavages en série avec un non stérile ionique tampon ou de l&#39;eau distillée deux fois (le trou DDH 2 O) dans la diminution des volumes à 4 ° C. Un grand soin doit être pris pour maintenir les cellules à froid tout au long de la procédure entière, et d&#39;éviter toute contamination. Cela nécessite l&#39;utilisation de godets de centrifugation de l&#39;autoclave et des tampons non-ioniques ou des trou DDH 2 O, un agitateur incubateur orbital, un volume important à grande vitesse centrifugeuse réfrigérée et un ensemble de rotors. Les bactéries sont finalement remises en suspension dans un petit volume de tampon additionné de 10% de glycerol et aliquotes dans des volumes de 40 ~ ul, which sont stockés à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. Stockage à basse température se traduit souvent par des efficacités de transformation a diminué en raison de la perte de viabilité dans le temps. Électrocompétentes cellules bactériennes sont également disponibles à partir d&#39;une variété de sources commerciales, mais seulement pour un nombre limité d&#39;(souvent recombinaison déficient) E. coli souches couramment utilisées comme hôtes pour propager une large gamme de plasmides. En conséquence les chercheurs s&#39;appuient sur des méthodes internes pour préparer leurs propres souches / mutants pour la transformation. Une alternative, le protocole rapide et efficace pour la préparation d&#39;électrocompétentes E. coli a été utilisé par quelques laboratoires de bactériologie moléculaire depuis un certain temps et a été étendu à des bactéries à Gram négatif supplémentaires, dans notre cas V. cholerae. L&#39;initiateur de protocole ne peut pas être identifié comme il a été optimisée par d&#39;autres chercheurs dans le temps. La méthode présentée ici a été utilisé dans notre laborators pour près de deux décennies, et notre objectif est de partager ce protocole utile avec nos pairs.

<table><tbody><tr><td>Module d’impulsion génétique</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2668</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de cuvette d’impulsion génétique</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2669</td><td></td></tr><tr><td>Électrocuvettes (espace de 0,2 cm)</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2082</td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm Tubes de culture sans rebord en pyrex </td><td>Corning</td><td>70820-13</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons de tubes de culture de 13 mm </td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04500-00</td><td></td></tr><tr><td>6 x Tige de verre de 250 mm</td><td>Source</td><td>11381D</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri jetables</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble de moteur de tambour à rouleaux</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1053-4004</td><td></td></tr><tr><td>Tambour à rouleaux pour tubes de culture de 13 x 100 mm</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1053-0306</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma Chemicals</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol anhydre/dénaturé</td><td>Sigma Chemicals</td><td>227649</td><td></td></tr><tr><td>boucle d’inoculation</td><td>Decon Labs</td><td>MP182-5</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse réfrigérée 5451 R</td><td>Eppendorf</td><td>22621425</td><td></td></tr><tr><td>bec Bunsen</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon MILLER</td><td>EMD</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Gélose bactériologique</td><td>Fisher Scientifique</td><td>S25127</td><td></td></tr></tbody></table>

protocole rapide pour la préparation de électrocompétentes<em&gt; escherichia coli</em&gt; et<em&gt; vibrio cholerae</em

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

L&#39;électroporation est devenue une méthode largement utilisée rapidement et efficacement pour introduire un ADN étranger dans une large gamme de cellules. Électrotransformation est devenue la méthode de choix pour l&#39;introduction d&#39;ADN dans des procaryotes qui ne sont pas naturellement compétentes. L&#39;électroporation est un procédé de transformation rapide, efficace et simplifié qui, en plus de l&#39;ADN purifié et des bactéries compétentes, nécessite de commande disponible dans le commerce et des cuvettes d&#39;impulsions gène. A la différence de l&#39;étape de pulsation, à la préparation de cellules électro-compétentes prend du temps et de main-d&#39;oeuvre impliquant des cycles répétés de centrifugation et lavages en diminuant le volume de l&#39;eau froide stérile, ou des tampons non-ioniques de grands volumes de cultures cultivées jusqu&#39;à la phase semi-logarithmique de croissance. Temps et d&#39;efforts peuvent être enregistrés par l&#39;achat de cellules électrocompétentes de sources commerciales, mais le choix est limité à couramment employé E. des souches de laboratoire coli. Nous diffusons présente un rapide etméthode efficace pour préparer électrocompétent E. coli, qui a été utilisé par les laboratoires de bactériologie pendant un certain temps, peut être adapté à V. cholerae et autres procaryotes. Bien que nous ne pouvons pas déterminer qui au crédit pour le développement de la technique originale, nous présente le rendre accessible à la communauté scientifique.

Nous avons effectué une série de transformations avec E. coli et V. cholerae transformation pour comparer l&#39;efficacité de notre méthode rapide avec une adaptation de la méthode (traditionnelle) décrit à l&#39;origine par Dower et al. 2 pour la préparation de bactéries électro-compétentes. Pour effectuer la préparation traditionnelle de cellules compétentes, 500 ml de LB dans un flacon d&#39;Erlenmeyer de L-2 ont été inoculées avec 500 ul de culture d&#39;une nuit de E. coli DH5a ou V. cholerae O395, incubés dans un agitateur orbital (215 rpm à 37 ° C) et récoltées à une DO 600 de 0,5 à 1,0 entre. Le ballon a été refroidi sur de la glace et les cultures centrifugé dans un rotor pré-réfrigéré à 4000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Les culots cellulaires ont été remis en suspension soigneusement dans 500 ml refroidi à la glace de 2 mM de CaCl2 pour V. cholerae et le trou DDH 2 O pour E. coli, et on centrifuge de nouveau dans les mêmes conditions. Les rondes subséquentes de la remise en suspension uned centrifugation ont été réalisés dans la diminution des volumes de 200 ml et 100 volumes en s&#39;assurant que la culture est restée réfrigérée à 4 ° C. Enfin, une remise en suspension et centrifugation dans un volume de 10 ml a été réalisé avec 10% de glycerol. Le culot final a été remis en suspension dans 2 ml de glycerol à 10% et 40 uL d&#39;aliquotes ont été congelées à -80 ° C et stocké non plus d&#39;une semaine avant l&#39;électroporation. conditions d&#39;électroporation incluant des paramètres d&#39;impulsion et la taille de la cuve étaient identiques pour les deux espèces de bactéries dans tous les électroporations quelle que soit la méthode de préparation de cellules compétentes. La seule différence, c&#39;est que nous avons effectué les lavages dans le trou DDH 2 O froid pour E. coli et froide 2 mM de CaCl 2 pour V. cholerae. Tableau 1 montre les résultats de bactéries transformées par électroporation à l&#39;identique mais rendues compétentes, soit avec le protocole rapide ou avec la méthode traditionnelle. Nous avons utilisé la souche O395 et DH5a comme communement utilisés, des souches représentatives de V. cholerae et E. coli, respectivement, des résultats similaires peuvent être obtenus avec d&#39;autres souches de la même espèce (mais pas tous souche unique a été testée) et probablement adaptées à d&#39;autres bactéries à Gram négatif et probablement au-delà. Pour vous assurer que le nombre de cellules égales étaient présents dans chaque lot pulsé, bactéries électrocompétentes générés en utilisant la méthode rapide ont été réunies lors de la collecte, mixte tenue homogène suspendus, et aliquotées en 40 volumes ul peu de temps avant l&#39;électroporation. Bactéries électrocompétentes générés en utilisant la méthode traditionnelle ont été traités de la même avant la congélation en 40 aliquotes. Après la livraison de l&#39;impulsion, chaque lot de 40 ul de bactéries par électroporation a été mis en suspension dans 400 ul de LB et dilué en série 01:10. Cent microlitres de chaque dilution ont été étalées sur de la gélose LB en présence de 100 ug / ml d&#39;ampicilline et réparties au moyen d&#39;un épandeur de cellule en verre stérileet on incube à 37 ° C pendant une nuit. Pour quantifier le nombre total de bactéries utilisées dans chaque transformation, volumes 40 ul de bactéries électrocompétentes de chaque lot préparé ont été dilués en série et étalées sur de la gélose LB sans antibiotique identique en parallèle. Une aliquote de bactéries aussi traités de chaque lot a été électroporation avec 1 pi de Tris-EDTA (TE) tampon mais sans ADN (transformation maquette), dilué en série et étalées sur gélose LB sans antibiotiques pour estimer le nombre de cellules perdues par la livraison de la impulsion électrique. Enfin, une variante supplémentaire de l&#39;expérience a été réalisée pour déterminer si les 30 min d&#39;incubation à 37 ° C dans 1 ml de LB après l&#39;électroporation, mais avant l&#39;étalement sur LB-agar affecteraient la récupération des cellules transformées. unités formant colonies (UFC) ont été dénombrées sur le jour suivant. Pour cette expérience, nous avons employé pUC18, un plasmide de laboratoire commun, et les lots de bactéries compétentes consistant en unnviron 10 8 UFC de cellules préparées en utilisant la méthode traditionnelle et 10 7 UFC pour cellules préparées en utilisant le protocole rapide. L&#39;électroporation seul (sans ADN) a réduit de 10 à 100 CFU viables par pli quelle que soit la méthode utilisée pour préparer les cellules électro-compétentes. Comme le montre le tableau 1, le rendement était transformant à l&#39;intérieur de la 10 6 -10 7 CFU / pg de plage de l&#39;ADN dans les trois expériences répétées (écarts-types indiqués entre parenthèses) pour E. coli (DH5a) et V. cholerae (O395) en utilisant respectivement la méthode longue traditionnelle pour la préparation de cellules électrocompétentes. Rendement transformant apparu diminué de 10 fois 10 5 -10 6 UFC / pg d&#39;ADN dans trois expériences répétées (écart-type entre parenthèses) pour E. coli et V. cholerae respectivement selon la méthode rapide. Pour cette raison, nous avons déterminé le pourcentage de bactéries transformées en divisant UFC transforméespar le nombre d&#39;UFC récupéré à partir de transformations &quot;simulées&quot; (sans plasmide) à partir de lots identiques par ailleurs des cellules compétentes. Le pourcentage de bactéries transformées était dans un journal (2.5-9.4%) indépendamment de la méthode de préparation et les espèces transformées (Tableau 1 nombres entre parenthèses). Ces résultats suggèrent que l&#39;efficacité de la méthode rapide est comparable à celle de la longue procédure traditionnelle de préparation de cellules compétentes et que les souches représentatives de Vibrio cholerae et Escherichia coli sont également ouvertes à la procédure rapide. Nous avons constaté que l&#39;efficacité de transformation, telles que pour les plasmides pUC18 hébergeant cassettes β-lactamase, n&#39;est pas affecté par le temps de récupération de 30 min dans du bouillon LB. Le même nombre de transformants a été récupéré si les cellules ont été étalées à la gélose LB en présence d&#39;ampicilline directement, après l&#39;électroporation, ou si elles ont été autorisées un temps de récupération de 30 à 45 mindans du bouillon LB à 37 ° C avant le placage. Nos résultats que résistance à l&#39;ampicilline ne nécessite pas de prolongement dans des conditions non sélectifs suggère que l&#39;expression β-lactamase se produit suffisamment rapide lors de la transformation. Toutefois, il convient de noter que nous avons effectué des dilutions en série de bactéries dans un bouillon LB pulsés, qui peuvent avoir contribué à la récupération à partir de la décharge électrique et de déclencher l&#39;expression du gène. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation graphique de la méthodologie pour la préparation rapide de bactéries électrocompétentes. Après 4-6 heures (en fonction de la densité de l&#39;inoculum) un nombre suffisant de bactéries peuvent être collectées pour effectuer quatre à six transformations à partir d&#39;une seule plaque de gélose LB. Pour assurer un nombre égal de cellules compétentes pour chaque volume final à une électroporation, les bactéries collectées à partir de la plaque de gélose LB ont d&#39;abord été mis en commun et ensuite lavés ensemble aliquoted dans 40 volumes de pi en fonction de la taille de la pastille (grandes pastilles ont été dilués dans des volumes plus importants divisible par 40 pi). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Nombre d&#39;ADN transformants / ug d&#39;ampicilline-résistant (transformants résistants à l&#39;ampicilline récupérés [%]) </td></tr><tr><td> Strain </td><td> Méthode traditionnelle </td><td> Méthode rapide </td></tr><tr><td> E. coli (DH5a) </td><td> 2,3 x 10 6 (± 7,3 x 10 5) [9,4%] </td><td> 3 x 10 6 (± 7,1 x 10 5) [2,5%] </td></tr><tr><td> V. cholerae (O395) </td><td> 4 x 10 7 (± 1,7 x 10 7) [5%] </td><td> 6,7 x 10 5 (± 2,1 x 10 5) [3,3%] </td></tr></tbody></table> Tableau 1. L&#39;efficacité de transformation par microgramme d&#39;ADN (pUC18) de électrocompétent bacteria préparé par le procédé traditionnel par rapport à la méthode rapide. Toutes les transformations ont été réalisées avec 500 ng d&#39;ADN pUC18 (~ 80% d&#39;ADN surenroulé telle que visualisée par électrophorèse sur 1% de gel d&#39;agarose) et les cellules électroporées ont été dilués 10 fois dans du bouillon LB avant le plaquage de CFU sur LB-agar avec des antibiotiques. Contrôles de bactéries non-électroporation et de bactéries électroporées sans plasmide, dilués en série et étalées sur de la gélose LB sans antibiotique ont été effectuées pour chaque série de transformations afin de déterminer le nombre total de bactéries viables avant et après la pulsation. Les contrôles électroporation représentaient la ligne de base pour le pour cent des bactéries viables transformées avec succès.

L&#39;électroporation est un procédé couramment utilisé pour l&#39;introduction d&#39;ADN dans des bactéries dans un processus connu sous le nom de transformation. Les protocoles traditionnels pour la préparation de cellules électrocompétentes beaucoup de temps et de main-d&#39;œuvre. Cet article décrit une autre, rapide, et efficace méthode pour la préparation de cellules électrocompétentes actuellement employés par certains laboratoires.

Protocole rapide pour la préparation de électrocompétentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Et<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

L'objectif général de cette procédure est de produire rapidement et commodément des bactéries compétentes le même jour. Ces bactéries sont nécessaires pour la transformation. Cette opération s'effectue en semant d'abord les bactéries sur un milieu gélosé LB et en les incubant pendant quatre à six heures.Ensuite, la pellicule bactérienne est soigneusement prélevée à la surface de l'agar et le culot est resuspendu dans de l'eau froide stérile ou dans un tampon. Puis, le culot bactérien est lavé trois fois à quatre degrés Celsius et resuspendu dans 40 microlitres. Enfin, les cellules compétentes sont électroporées en présence d'ADN.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent des niveaux de transformation bactérienne comparables à ceux obtenus avec la méthode traditionnelle, qui nécessite un équipement considérable, de grands volumes de cultures bactériennes et des tampons stériles. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que des bactéries compétentes fraîches peuvent être préparées pratiquement à partir de n'importe quelle souche de laboratoire le jour même où la transformation est prévue, sans avoir besoin de grandes centrifugeuses, de rotors ou de grandes quantités de tampons et de cultures stériles. Généralement, les personnes novices dans cette méthode n'auront pas beaucoup de difficultés, car il s'agit simplement d'une variante accélérée de techniques couramment utilisées dans les laboratoires de bactériologie. L'auteur original de ce protocole ne peut pas être identifié, car il a été utilisé et optimisé par de nombreux chercheurs au fil du temps.La méthode présentée ici est utilisée dans nos laboratoires depuis près de deux décennies, et notre objectif est de partager ce protocole utile avec nos collègues. La démonstration visuelle de cette méthode est importante pour une étape particulière, notamment le prélèvement des bactéries à partir de la pellicule sur la vis sans fin, car cela nécessite un œil expérimenté pour évaluer la croissance sur la boîte de Petri.Et ceci est mieux visualisé. La procédure est démontrée par Mme Theresa Brooks, assistante de recherche du laboratoire du Dr Te Koski à l'Université de l'Alberta à Edmonton, au Canada. Pour commencer la préparation de la culture bactérienne en fin d'après-midi, utiliser une petite quantité d’E. coli ou de V. coray pour ensemencer un à cinq millilitres de bouillon LB stérile autoclavé dans des tubes à essai en verre borosilicaté stériles.Placer les tubes de culture inoculés dans un rouleau tournant et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius et à grande vitesse. Préparer un répartiteur de cellules en forme de bâton de hockey à partir d'une tige en verre en chauffant le milieu de la tige à la flamme d'un bec Bunsen jusqu'à ce que le verre ramollisse. Puis utiliser des pinces ou des pinces plates pour orienter doucement le pliage selon un angle de 135 degrés.Chauffez à nouveau la tige à son milieu, entre l’extrémité et le premier coude, puis pliez-la vers l’intérieur selon un angle de 45 degrés. Préparez du milieu LB, avec et sans antibiotiques, et conservez-le à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin.Plaquez 100 microlitres de culture ensemencée la veille sur chaque boîte de gélose LB. À l’aide du repartiteur cellulaire, incubez la boîte à 37 degrés Celsius pendant quatre à six heures, ou jusqu’à l’apparition d’une pellicule mince de croissance bactérienne. À l’aide d’un anneau d’ensemencement, prélèvez une masse bactérienne d’environ deux millimètres de diamètre sur la boîte et resuspendez-la dans un millilitre d’eau glacée.Chlorure de calcium à deux millimolaire. Si l'on utilise du v coray ou de l'eau doublement distillée stérile pour les e coli, à l'aide d'une centrifugeuse réfrigérée réglée à quatre degrés Celsius, centrifuger la suspension pendant cinq minutes à 5 000 G. Éliminer le surnageant et répéter le lavage deux fois supplémentaires. Après avoir éliminé le dernier surnageant, resuspendre le culot dans 40 microlitres de chlorure de calcium ou d'eau doublement distillée et maintenir sur glace.Pour effectuer une transformation, ajoutez jusqu’à un microgramme d’ADN plasmidique à la suspension bactérienne de 40 microlitres, puis transférez le mélange dans une cuvette stérile préalablement refroidie de 0,2 centimètre d’écartement. Insérez la cuvette dans la chambre d’électroporation du module de commande d’impulsion et appliquez une impulsion de 1,8 kilovolt et 25 microsecondes. La constante de temps doit être d’environ 5,0 millisecondes et aucun arc électrique ne doit se produire.Resuspendez rapidement les cellules dans un millilitre de bouillon LB et transférez-les dans un tube en verre stérilisé au préalable par autoclavage. Laissez les cellules se recouvrer en les incubant dans des conditions de croissance aérées à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, sans sélection par antibiotique. Ensemencez les bactéries sur des géloses LB contenant un antibiotique et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius.Comme illustré ici, nous avons réalisé une série de transformations avec E. coli et V. corray afin de comparer l'efficacité de transformation de notre méthodologie rapide à une adaptation de la méthode traditionnelle initialement décrite par Döer et al. pour la préparation de bactéries électrocompétentes. Le rendement de transformants se situait entre 10⁶ et 10⁷ UFC par microgramme d'ADN au cours de trois expériences répétées pour E. coli et V. corray, en utilisant la méthode traditionnelle pour l'électrocompétence.Préparation des cellules, le rendement des transformants est apparu diminué d’un facteur dix, de 10 à la puissance cinq à 10 à la puissance six UFC par microgramme d’ADN, dans trois expériences répétées pour E. coli et V. coray, en utilisant la méthode rapide. Pour cette raison, nous avons déterminé le pourcentage de bactéries transformées en divisant le nombre d’UFC transformées par le nombre d’UFC obtenues à partir de transformations témoins réalisées à partir de lots de cellules compétentes autrement identiques. Le pourcentage de bactéries transformées était compris dans un ordre de grandeur.Indépendamment de la méthode de préparation et de l'espèce transformée. Ces résultats indiquent que l'efficacité de la méthode rapide est comparable à celle de la procédure traditionnelle plus longue de préparation de cellules compétentes, et que les souches représentatives de ieo, coray et esia coli répondent de manière équivalente à la procédure rapide. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq à six heures, si elle est exécutée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de récolter les bactéries durant leur phase de croissance logarithmique, de les laver dans une solution tamponnée stérile, fraîchement préparée et prérefroidie, et de les maintenir au froid jusqu'à leur resuspension dans du milieu LB après l'électroporation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de comprendre facilement comment générer rapidement des cellules bactériennes électrocompétentes spécifiques à une souche dans votre laboratoire, en les cultivant sur une pelouse initiale, en les récoltant durant la phase de croissance logarithmique, puis en les lavant dans un tampon froid en vue de l'électroporation.

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