Une plate-forme robotique pour haut débit protoplastes Isolement et Transformation

L'objectif général de ce protocole est de développer une méthode permettant le criblage rapide et automatisé à haut débit de protoplastes végétaux, spécifiquement conçue pour surmonter l'actuel goulot d'étranglement dans le criblage précoce d'un grand nombre de cibles d'édition du génome et de silençage génique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biotechnologie végétale. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à permettre la production et la transformation automatisées de protoplastes à haut débit, permettant ainsi un criblage parallèle rapide de la fonction des promoteurs dans l'expression génique.

Cette procédure sera démontrée en utilisant la culture en suspension largement utilisée du tabac Bright Yellow 2, ou BY-2. Commencez par faire croître une culture BY-2 dans un flacon Erlenmeyer, comme décrit dans le texte du protocole. Le jour de l'isolement des protoplastes, mélangez soigneusement la culture car les cellules se déposent rapidement, puis transférez six millilitres de la culture dans un tube conique de 15 millilitres.

Laisser les cellules se déposer pendant au moins 10 minutes. Ajuster le volume cellulaire compacté à 50 % du volume total en éliminant le volume approprié de surnageant. Agiter le tube en l'inversant, puis utiliser des pipettes à large orifice pour prélever 500 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque à six puits destinée à la digestion.

La première étape de cette procédure consiste à allumer tous les composants du système robotique, à savoir le transporteur de microplaques, le distributeur de liquides, le lecteur de plaques multimode, le distributeur multimode, le bloc chauffant ou refroidissant pour plaques, ainsi que les ordinateurs. Ensuite, ouvrez le logiciel de planification des tâches du transporteur de plaques, qui intègre le transporteur de microplaques avec les autres équipements afin de permettre le transfert des plaques entre chaque appareil. Dans le logiciel du transporteur de plaques, définissez les spécifications techniques des matérielles utilisées dans le protocole.

Cliquez sur Configuration dans la barre d'outils principale et sélectionnez la commande Gérer les types de conteneurs. Sélectionnez le type de conteneur approprié dans la liste des types de conteneurs existants. Définissez les spécifications techniques pour tout le matériel de laboratoire que le déplaceur de plaques rencontrera.

L'étape suivante consiste à définir les positions de départ et de fin pour chaque contenant. Cliquez sur l'onglet Départ/Fin dans un protocole spécifique. Sélectionnez la position de départ de chaque contenant et cochez la case pour Couvercle posé, Couvercle retiré à la fois aux positions de départ et de fin.

Après avoir défini les positions de départ et d'arrivée pour chaque élément de verrerie, charger manuellement toutes les plaques en position initiale pour l'ensemble du protocole. Charger les plaques de criblage fluorescent en 96 puits dans l'hôtel deux, les plaques de six puits contenant les cellules BY-2 dans l'hôtel trois, une plaque 96 puits profonds qui sera utilisée pour la transformation sur le deuxième emplacement de l'enceinte de chauffage ou de refroidissement, et un tube conique de 50 millilitres contenant la solution enzymatique sur le distributeur polyvalent. Pour réaliser la transformation dans le protocole, précharger chaque puits de la plaque 96 puits profonds avec 10 microlitres d'ADN plasmidique contenant le construct rapporteur de la protéine fluorescente orange et incuber sur l'enceinte de chauffage ou de refroidissement à quatre degrés Celsius.

Placer tous les fournitures et plaques sur la plateforme automatisée de manipulation des liquides aux emplacements désignés. Charger une plaque de 96 puits préremplie avec 200 microlitres d'une solution de polyéthylène glycol à 40 % par puits dans la colonne un. Placer une boîte de pointes de pipette dans le logement huit.

Pour définir l'emplacement de chaque élément dans le logiciel des plateformes automatisées de manipulation des liquides, sélectionnez Outils dans le menu et cliquez sur Éditeur de matériel. Sélectionnez le type de matériel dans le menu déroulant. Sélectionnez l'onglet Protocole principal et cliquez sur Configurer le matériel pour définir la position de chaque élément de matériel.

Cliquez sur Exécuter pour initialiser tous les dispositifs qui seront utilisés dans le protocole. Enfin, dans la fenêtre Explorateur de travail, cliquez sur Ajouter une unité de travail pour vérifier toutes les verreries présentes dans le système et démarrer le protocole automatisé. La partie la plus sensible de la procédure est la transformation des protoplastes.

Étant donné que la transformation est effectuée par le système robotique, il est essentiel que les protocoles automatisés soient configurés correctement. À des fins de démonstration dans cette vidéo, seules certaines étapes des protocoles automatisés seront montrées. Pendant le protocole de transformation, la plateforme automatisée de manipulation des liquides aspire 70 microlitres de la solution de protoplastes à partir de la plaque à six puits et les distribue dans la plaque 96 puits profonds du bloc numéro six.

Ensuite, de nouvelles pointes de pipette sont utilisées pour aspirer lentement 70 microlitres de la solution hautement visqueuse de polyéthylène glycol à partir de la plaque à puits profonds préchargée et pour dispenser complètement la solution dans les puits appropriés de la plaque à puits profonds. Ensuite, la plateforme automatisée de manipulation liquide déplace la plaque à puits profonds du logement six au logement neuf, où le transporteur de plaques saisit la plaque et l'amène à la station d'agitation, puis l'agite à 1500 tr/min pendant 30 secondes. Après une incubation de 20 minutes sans agitation afin de permettre l'équilibre des protoplastes, le transporteur de plaques déplace la plaque 96 puits profonds vers le distributeur multifonction et déclenche le protocole de lavage.

Lorsque le protocole automatisé d'isolement et de transformation des protoplastes est terminé, retirez la plaque contenant les protoplastes transformés de l'hôtel un du système robotique. Allumez le microscope inversé, la caméra et la lampe à fluorescence. Sélectionnez l'objectif 10X pour un premier ciblage des protoplastes.

Activez la lampe halogène et fermez l'obturateur de la lampe fluorescente. Placez la plaque sur le système de microscope et focalisez sur les protoplastes en utilisant le champ clair. Ensuite, éteignez l'ampoule halogène et ouvrez l'obturateur de la lampe fluorescente.

Sélectionnez le jeu de filtres Cy3/TRITC pour visualiser la protéine fluorescente orange exprimée par les protoplastes transgéniques. Analysez chaque puits pour déterminer le nombre de protoplastes exprimant le marqueur fluorescent. La digestion enzymatique des protoplastes dans les conditions spécifiées dans ce protocole a permis d'obtenir 2 820 000 protoplastes par plaque à six puits.

La perte de concentration en protoplastes après chaque étape de transfert du protocole a été évaluée. Après le protocole de digestion, 11 500 protoplastes ont été transférés dans chaque puits des plaques 96 puits profonds. Une fois le protocole de transformation terminé, 1 230 protoplastes ont été transférés dans la plaque de criblage fluorescent 96 puits.

Pour s'assurer que les multiples étapes de pipetage n'endommageaient pas les protoplastes, leur viabilité a été évaluée par coloration à l'iodure de propidium. Les résultats n'ont montré aucune différence significative de viabilité après la digestion, après le transfert dans la plaque de criblage fluorescente 96 puits, et après le protocole de transformation. Le protocole de transformation a permis d'obtenir des cellules transgéniques exprimant une protéine fluorescente orange, bien que l'efficacité de transformation soit faible, d'environ 2 %. Ceci est dû au grand plasmide binaire utilisé et au fait que le protocole n'ait pas été optimisé spécifiquement pour les protoplastes BY-2.

Les métriques obtenues pour le déroulement du protocole ont montré que l'investissement principal en temps est consacré à l'étape de digestion. La durée totale d'isolement et de transformation des protoplastes était de trois heures, 50 minutes et 53 secondes, sans intervention extérieure requise de l'opérateur. Une fois correctement configuré, ce protocole peut être réalisé par le robot en moins de quatre heures.

Depuis son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la biotechnologie végétale pour réaliser des procédures génomiques à haut débit sur les cultures, telles que l'édition du génome et le criblage de promoteurs.