Une plate-forme robotique pour haut débit protoplastes Isolement et Transformation

L’objectif global de ce protocole est de développer une méthode de criblage rapide, automatisé et à haut débit de protoplastes végétaux, en particulier pour résoudre le goulot d’étranglement actuel dans le criblage précoce d’un grand nombre de cibles d’édition du génome et de silençage génique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biotechnologie végétale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la production et la transformation automatisées de protoplastes à haut débit pour un criblage parallèle rapide de la fonction promotrice dans l’expression génique.

Cette procédure sera démontrée à l’aide de la culture en suspension jaune vif à deux, ou BY-2, largement utilisée. Commencez par cultiver une culture BY-2 dans un erlenmeyer, comme décrit dans le texte du protocole. Le jour de l’isolement du protoplaste, mélangez soigneusement la culture car les cellules se déposeront rapidement, et transférez six millilitres de la culture dans un tube à centrifuger à fond conique de 15 millilitres.

Laissez les cellules se stabiliser pendant au moins 10 minutes. Ajustez le volume de la cellule garnie à 50 % du volume total en retirant le volume approprié de surnageant. Secouez le tube en le retournant, puis utilisez des pipettes de gros calibre pour pipeter 500 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque à six puits pour la digestion.

La première étape de cette procédure consiste à activer tous les composants du système robotique, à savoir le déménageur de microplaques, le manipulateur de liquides, le lecteur de plaques multimode, le distributeur multimode, le réchauffeur de plaques ou le refroidisseur et les ordinateurs. Ensuite, ouvrez le logiciel de planification des tâches du déménageur de plaques qui intègre le déménageur de microplaques aux autres équipements pour permettre le transfert de plaques entre chaque pièce d’équipement. Dans le logiciel de déplacement de plaques, définissez les spécifications techniques du matériel de laboratoire utilisé dans le protocole.

Cliquez sur Configuration dans la barre d’outils principale et sélectionnez la commande Gérer les types de conteneurs. Sélectionnez le type de conteneur approprié dans la liste des types de conteneurs existants. Définissez les spécifications techniques de tout le matériel de laboratoire que le déménageur de plaques rencontrera.

L’étape suivante consiste à définir les positions de début et de fin de chaque conteneur. Cliquez sur l’onglet Début/Fin d’un protocole spécifique. Sélectionnez la position de départ de chaque conteneur et cochez la case Couvercle, Sans couvercle aux positions de début et de fin.

Après avoir défini les positions de début et de fin pour chaque matériel de laboratoire, chargez manuellement toutes les plaques dans la position de départ pour l’ensemble du flux de travail. Chargez les plaques de criblage fluorescent à 96 puits dans l’hôtel deux, les plaques à six puits avec des cellules BY-2 dans l’hôtel trois, une plaque à 96 puits de profondeur qui sera utilisée pour la transformation sur le nid deux de l’appareil chauffant ou du refroidisseur, et un tube conique de 50 millilitres contenant la solution enzymatique sur le distributeur multimode. Pour effectuer la transformation dans le protocole, préchargez chaque puits de la plaque de puits de 96 profondeurs avec 10 microlitres d’ADN plasma contenant la construction rapporteure de protéine fluorescente orange et incubez sur la plaque chauffante ou le refroidisseur à quatre degrés Celsius.

Chargez toutes les fournitures et les plaques sur la plate-forme automatisée de manutention des liquides aux endroits désignés. Chargez une plaque de 96 puits préchargée avec 200 microlitres d’une solution de polyéthylène glycol à 40 % par puits dans la première colonne. Chargez une boîte de pointes de pipette dans le nid huit.

Pour définir l’emplacement de chaque élément dans le logiciel des plates-formes de manipulation automatisée des liquides, sélectionnez Outils dans le menu et cliquez sur Éditeur de matériel de laboratoire. Sélectionnez le type de matériel de laboratoire dans le menu déroulant. Sélectionnez l’onglet Protocole principal et cliquez sur Configurer le matériel de laboratoire pour définir la position de chaque matériel de laboratoire.

Cliquez sur Exécuter pour initialiser tous les périphériques qui seront utilisés dans le protocole. Enfin, dans la fenêtre de l’Explorateur de travail, cliquez sur Ajouter une unité de travail pour vérifier tout le matériel de laboratoire du système et commencer le protocole automatisé. La partie la plus sensible de la procédure est la transformation protoplaste.

Étant donné que la transformation est effectuée par le système robotique, il est essentiel que les protocoles automatisés soient correctement configurés. Dans le cadre de cette vidéo, seules les étapes sélectionnées dans les protocoles automatisés seront affichées. Au cours du protocole de transformation, la plate-forme automatisée de manipulation des liquides aspire 70 microlitres de la solution de protoplaste de la plaque à six puits et la distribue dans la plaque à 96 puits de profondeur dans le nid six.

Ensuite, de nouvelles pointes de pipette sont utilisées pour aspirer lentement 70 microlitres de la solution de polyéthylène glycol hautement visqueux de la plaque de puits profond préchargée et distribuer complètement la solution dans les puits applicables de la plaque de puits profonds. Ensuite, la plate-forme automatisée de manipulation des liquides déplace la plaque de puits profonds des six suivants au nid neuf, où le déménageur de plaques prend la plaque et la déplace vers la station d’agitation des plaques et la secoue à 1500 tr/min pendant 30 secondes. Après une incubation de 20 minutes sans secousse pour permettre l’équilibrage des protoplastes, le déplaiseur de plaques déplace la plaque à 96 puits de profondeur vers le distributeur multimode et déclenche le protocole de lavage.

Lorsque le protocole automatisé d’isolement et de transformation des protoplastes est terminé, retirez la plaque avec les protoplastes transformés de l’hôtel un du système robotique. Allumez le microscope inversé, l’appareil photo et la lampe fluorescente. Sélectionnez l’objectif 10X pour une mise au point initiale sur les protoplastes.

Allumez la lampe halogène et fermez l’obturateur de la lampe fluorescente. Chargez la plaque sur le système de microscope et concentrez-vous sur les protoplastes à l’aide du fond clair. Ensuite, éteignez l’ampoule halogène et ouvrez l’obturateur de la lampe fluorescente.

Sélectionnez le jeu de filtres Cy3/TRITC pour visualiser la protéine fluorescente orange exprimée par les protoplastes transgéniques. Scannez chaque puits pour déterminer le nombre de protoplastes exprimant le marqueur fluorescent. La digestion enzymatique des protoplastes dans les conditions spécifiées dans ce protocole a donné 2 820 000 protoplastes par plaque à six puits.

La perte de concentration de protoplastes après chaque étape de transfert dans le protocole a été évaluée. Après le protocole de digestion, 11 500 protoplastes ont été transférés dans chaque puits des 96 plaques de puits de profondeur. Une fois le protocole de transformation terminé, 1 230 protoplastes ont été transférés sur la plaque de criblage fluorescente à 96 puits.

Pour s’assurer que plusieurs étapes de pipetage n’endommagent pas les protoplastes, leur viabilité a été testée par coloration à l’iodure de propidium. Les résultats n’ont montré aucune différence significative de viabilité après la digestion, après le transfert sur la plaque de criblage fluorescente à 96 puits et après le protocole de transformation. Le protocole de transformation a réussi à générer des cellules transgéniques qui expriment la protéine fluorescente orange bien que l’efficacité de transformation ait été faible, seulement environ 2 %. Cela est dû au grand plasmique binaire utilisé et au fait que le protocole n’a pas été optimisé spécifiquement pour les protoplastes BY-2.

Les mesures obtenues pour le déroulement du protocole ont montré que l’investissement majeur en temps est consacré à l’étape de digestion. La durée totale de l’isolement et de la transformation du protoplaste était de trois heures, 50 minutes et 53 secondes, sans intervention externe de la part de l’opérateur. Une fois correctement configurée, cette technique peut être réalisée par le robot en moins de quatre heures.

Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la biotechnologie végétale pour effectuer des procédures génomiques de cultures à haut débit, telles que l’édition du génome et le criblage de promoteurs.