Name: Une plate-forme robotique pour haut débit protoplastes Isolement et Transformation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Découvrez une méthode robotisée pour l'isolation et la transformation de protoplastes de tabac BY-2 en haut débit. Cette approche automatisée permet le criblage parallèle rapide de la fonction des promoteurs en biotechnologie végétale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Cette recherche a été soutenue par l’Agence des projets de recherche avancée - Énergie (ARPA-E) N° de prix DE-AR0000313.

1. Mise en place de la suspension des cultures cellulaires <ol><li> Préparer liquide par 2 supports en y ajoutant 4,43 g Linsmaier &amp; Skoog basal, 30 g de saccharose, 200 mg de KH 2 PO 4 et 200 pg d&#39;acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D) à 900 ml d&#39; eau distillée l&#39;eau et le pH à 5,8 avec 0,1 M KOH. Après ajustement du pH, ajuster le volume final à 1000 ml avec de l&#39;eau distillée et autoclave. Les médias peuvent être stockés jusqu&#39;à 2 semaines à 4 ° C. </li><li> Inoculer un flacon de 250 ml Erlenmeyer avec 100 ml de liquide BY-2 médias et une seule pièce de PAR-2 ​​cals (&gt; 1 cm de diamètre) cultivés sur milieu solide PAR-2 ​​(liquide BY-2 médias avec l&#39;ajout de 1% agar) et sceller avec du papier d&#39;aluminium. Incuber la culture à 28-30 ° C avec agitation pendant 5 jours. NOTE: PAR-2 ​​cals est maintenu sur un support solide pour le stockage à long terme, comme des cultures liquides vont rapidement proliférer. le volume de la culture peut être ajusté si nécessaire, typiquement une culture de 100 ml sera capable de charger trente-trois 6-wplaques Ell. </li><li> Transfert 2 ml de phase logarithmique BY-2 culture à 98 ml de milieu frais PAR-2 ​​et incuber pendant 5-7 jours à 28-30 ° C avec agitation. REMARQUE: Sous-culture des cultures liquides établies peut être effectuée en utilisant régulièrement 1: 100 dilutions de 5-7 jours vieilles cultures, plutôt que l&#39;inoculation avec des cals. </li><li> Mélanger la culture à fond, que les cellules vont rapidement s&#39;installer, et le transfert de 6 ml de la culture de cellules dans un tube de 15 ml fond conique de centrifugeuse et laisser les cellules se déposent pendant au moins 10 min. Réglez le volume de l&#39;hématocrite à 50% du volume total en retirant le surnageant. </li><li> Agiter le tube par inversion et pipette 500 pi dans chaque puits d&#39;une plaque à 6 puits pour la digestion. Utiliser des pipettes de large calibre pour transférer les cellules à ce stade, car ils sont denses et bouchent les embouts de pipettes standard. </li></ol> 2. protoplastes Isolation <ol><li> Allumez toutes les composantes du système robotique (figure 1A) et ouvrir la tâche plaque moteur planification soupleware. Le programme de planification de tâches intègre le moteur de microplaques avec les autres équipements pour permettre le transfert de plaques entre chaque pièce d&#39;équipement. </li><li> Avant l&#39; expérimentation, définir les spécifications techniques pour labware (par exemple, des plaques, couvercles) utilisés dans le protocole, ainsi que le démarrage et les positions de fin de chaque morceau de labware, dans le logiciel plaque de moteur, comme suit: <ol><li> Cliquez sur Configuration de la barre d&#39;outils principale dans le logiciel plaque de moteur et sélectionnez le conteneur commande Gérer les types. </li><li> Si le type de conteneur est répertorié dans la bibliothèque de type conteneur existant, puis sélectionnez le conteneur approprié. </li><li> Si le type de conteneur ne figure pas dans la bibliothèque de type conteneur existant puis cliquez sur Ajouter pour spécifier un nouveau type de conteneur. </li><li> Après l&#39; ajout d&#39; un nouveau type de conteneur, insérer les dimensions du nouveau conteneur (hauteur, largeur, les dimensions d&#39; empilage, et la pince de décalage) dans les onglets appropriés et cliquez sur Enregistrer.<ol><li> Si les dimensions correctes ne sont pas disponibles auprès du fabricant, puis de déterminer avec précision toutes les dimensions au millimètre près à l&#39;aide des étriers. Des erreurs dans la mesure des dimensions de conteneurs se traduira par un échec de l&#39;auteur de la plaque. </li></ol></li><li> Répétez les étapes 2.2.2 à 2.2.4.1 pour tous les types de conteneurs que le moteur de la plaque va rencontrer. Après l&#39;achèvement de cette étape pour tous les labware, il est nécessaire de définir le début et l&#39;emplacement de fin pour chaque conteneur (étape 2.2.6). NOTE: Pour ce protocole le labware comprend la plaque de 6 puits, la plaque de puits profonds, et la plaque de criblage 96 puits fluorescent. </li><li> Pour définir la position de début et de fin de chaque conteneur, cliquez sur l&#39;onglet Début / Fin dans un protocole spécifique. Tout d&#39;abord, sélectionnez la position de départ de chaque conteneur. Ensuite, cochez la case Lidded / Unlidded à la fois le début et la fin de course. Répétez l&#39;opération pour tous les conteneurs. NOTE: Si le conteneur sera laissé sur un autre morceau de équipment (au lieu du moteur de la plaque) l&#39;emplacement final peut être laissée en blanc. </li></ol></li><li> A ce stade, charger manuellement toutes les plaques dans la position de départ pour l&#39;ensemble du workflow. Chargez les plaques de blindage fluorescentes 96 puits dans Hôtel 2, plaques de 6 puits avec by-2 cellules dans Hôtel 3, une assiette creuse 96 puits qui sera utilisé pour la transformation sur la plaque de chauffage / refroidisseur nid 2, et 50 ml conique tube contenant la solution d&#39;enzyme (voir fichier supplémentaire, section 1.2.2) sur le distributeur multi-mode. <ol><li> Si la transformation sera effectuée dans le protocole, pré-charger la plaque à 96 puits profonds avec 10 pi d&#39;ADN plasmidique par puits (1 pg / pl, A 260/280&gt; 1,8) contenant la construction rapporteur OFP et incuber sur la plaque chauffage / refroidissement à 4 ° C. Chaque puits est utilisée pour une transformation unique, donc le nombre de puits remplis dépendra de la configuration expérimentale. </li></ol></li><li> Chargez toutes les fournitures et les plaques sur l&#39;automated plate - forme de manipulation de liquides dans les endroits désignés et définir la position de chaque élément dans le logiciel de contrôle d&#39;automatisation (figure 1B). <ol><li> Chargez une plaque de 96 puits préchargé avec 200 pi de 40% de PEG dans MMg (0,4 M mannitol, 100 mM MgCl 2, mM MES 4, pH 5,7) dans la colonne 1, 200 pi d&#39;iodure de propidium (PI, 1 pg / ml) dans la colonne 2, et 200 pi d&#39;éthanol dans la colonne 3 (nid 2), et une boîte de pointes de pipette dans le nid 8. </li><li> Pour définir l&#39;emplacement du labware dans le logiciel de l&#39;automatisé liquide manutention plate - forme, sélectionnez Outils dans le menu et cliquez sur Editeur Labware. </li><li> Sélectionnez le type de labware dans le menu déroulant ou définir un nouveau type de labware en utilisant le bouton Nouveau Labware. </li><li> Définir la position de chaque morceau de labware sélectionné en sélectionnant l&#39;onglet Protocole principal et cliquez sur Configurer Labware. Assurez-vous que chaque morceau de labware placé sur la plate-forme de traitement des liquides est automatisédéfini avant l&#39;exécution du protocole. </li><li> Pour déclencher les protocoles automatisés, cliquez sur la fenêtre de l&#39; Explorateur de profil et sélectionnez le nom du protocole à être exécuté (protoplastes Isolation, Cell Count, et la transformation médiée par PEG). </li><li> Cliquez sur Exécuter pour initialiser tous les périphériques qui seront utilisés dans le protocole. </li><li> Enfin, dans la fenêtre de travail Explorer, cliquez sur Ajouter unité de travail pour vérifier tous les conteneurs / labware dans le système et commencer le protocole automatisé. NOTE: Les descriptions complètes des protocoles automatisés sont contenus dans le fichier supplémentaire. </li></ol></li></ol> 3. Établir la courbe standard pour le nombre de cellules <ol><li> Concentrer manuellement protoplastes à une concentration de 1 x 10 6 protoplastes / ml dans un volume de 1 ml. Centrifugeuse protoplastes à 1000 xg pendant 10 min, et retirer le surnageant. </li><li> ajouter manuellement 900 ul d&#39;éthanol à 70% (conservé à 4 ° C) au culot de protoplasteset remettre en suspension le culot. Incuber pendant 10 min sur la glace pour fixer les cellules. </li><li> Ajouter 100 pi de pi (1 pg / ml) pour les protoplastes pour marquer les noyaux et permettre la détection par le lecteur de plaque. </li><li> Charge 80 pi de liquide BY-2 médias dans chaque colonne et rangée de la plaque de criblage 96 puits fluorescent à partir de la colonne 2. </li><li> Dans la colonne 1 d&#39;une plaque de criblage 96 puits fluorescent, ajouter 70 pi de protoplastes et 50 ul PAR-2 ​​médias à chaque puits dans la colonne. </li><li> Placer la plaque dans le nid 6 de la plate-forme de traitement des liquides automatisé, et exécuter une dilution en série 2 fois. <ol><li> Pour effectuer une dilution en série sur la plate - forme de traitement des liquides automatisé, cliquez sur Lancer l&#39; Assistant Dilution série et régler le volume de transfert (60 pi), le nombre de mélanges et volume (2, 70 pl), des puits initiaux (colonne 1, lignes AF), la dilution puits (colonnes 2-11, lignes AF), et aspiration et de distribution des biens (0,5 mm de fond de puits). </li><li> Après avoir réglé les paramètres, enregistrer uned exécuter le protocole. Remarque: Comme tous les protoplastes sont étiquetés avec PI (en raison de la fixation des cellules), la fluorescence est proportionnelle à la concentration de protoplastes. </li><li> Après la dilution en série est terminée, retirez la plaque du nid 9 et l&#39;insérer dans le lecteur de plaque et exécuter le protocole de courbe standard dans le logiciel de lecteur de plaque. NOTE: Une courbe standard sera alors généré en comparant la fluorescence de PI (excitation 536 nm / émission 620 nm) dans chaque puits avec la concentration de protoplastes connue. </li></ol></li><li> À la fin du protocole de lecteur de plaque, enlever la plaque et de recueillir toutes les cellules transgéniques pour l&#39;autoclavage ou d&#39;autres procédures de-vitalisation tels que définis dans les protocoles de biosécurité ». </li></ol> 4. Analyse microscopique de la transformation <ol><li> Retirer la plaque avec des protoplastes transformées (le produit du Protocole automatisé 3, fichier supplémentaire) de l&#39; Hôtel 1 du système robotique. </li><li> Toursur microscope inversé, la caméra et la lampe fluorescente. </li><li> Sélectionnez l&#39;objectif 10X pour initial se concentrant sur les protoplastes, allumer la lampe halogène, et fermer l&#39;obturateur pour la lampe fluorescente. </li><li> plaque de charge sur le système microscopique et de se concentrer sur les protoplastes utilisant fond clair. </li><li> Après s&#39;être concentrée sur protoplastes, éteindre l&#39;ampoule halogène et ouvrir l&#39;obturateur pour la lampe fluorescente. </li><li> Sélectionnez le filtre CY3 / TRITC fixé pour la visualisation de la protéine pporRFP exprimée par les protoplastes transgéniques. </li><li> Balayez chaque puits pour déterminer le nombre de protoplastes exprimant le pporRFP marqueur fluorescent. </li><li> Calculer l&#39;efficacité de transformation que le nombre total de protoplastes exprimant le marqueur fluorescent du nombre total de protoplastes. </li><li> Collecter des plaques contenant des cellules transgéniques dans des sacs de biosécurité approuvés pour autoclavage ou d&#39;autres procédures de-vitalisation tels que définis dans les protocoles de biosécurité ». </li></ol>

<ol><li>Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+transgenic+nematode+control+in+developed+and+developing+world+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops.</a> Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).</li>
<li>Duke, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+transgenic%2C+herbicide-resistant+crops+in+the+United+States+almost+20+years+after+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag.+Sci%22%5BJournal%5D)">Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction.</a> Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).</li>
<li>Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomics%2C+physiology+and+breeding+approaches+for+improving+drought+tolerance+in+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Theor.+Appl.+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops.</a> Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).</li>
<li>Hu, H., Xiong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+and+breeding+of+drought-resistant+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Bio%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops.</a> Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).</li>
<li>Marco, F., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarco%2C+F+%22Plant+Biology+and+Biotechnology%22">Plant Biology and Biotechnology</a>. , Springer. 579-609 (2015).</li>
<li>Edgerton, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+insect+resistance+traits+increase+corn+yield+and+yield+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability.</a> Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).</li>
<li>Vanhercke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+biomass+for+high+energy+density%3A+oilseed-like+triacylglycerol+yields+from+plant+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotech.+J%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves.</a> Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).</li>
<li>Baxter, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-year+field+analysis+of+reduced+recalcitrance+transgenic+switchgrass%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotech.+J%22%5BJournal%5D)">Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass.</a> Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).</li>
<li>Xing, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+toolkit+for+multiplex+genome+editing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.</a> BMC Plant Biol. 14 (1), 327(2014).</li>
<li>Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-mediated+transient+gene+expression+and+silencing+system+in+maize+mesophyll+protoplasts%3A+a+valuable+tool+for+signal+transduction+study+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physio.+Plant%22%5BJournal%5D)">PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize.</a> Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).</li>
<li>Martinho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+miRNA+pathways+using+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).</li>
<li>Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+for+gene+silencing+using+siRNAs+in+rice+leaf+and+stem-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts.</a> Plant Methods. 2 (1), 13(2006).</li>
<li>Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasts%3A+a+useful+research+system+for+plant+cell+biology%2C+especially+dedifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation.</a> Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).</li>
<li>Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+meets+plant+sciences%3A+Gold+functionalized+mesoporous+silica+nanoparticle+mediated+protein+and+DNA+codelivery+to+plant+cells+via+the+biolistic+method%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method.</a> Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).</li>
<li>Křenek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+plant+transformation+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens%3A+Principles%2C+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications.</a> Biotechnol. Adv. , (2015).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation%2C+growth+and+cryopreservation+of+plant+cell+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures.</a> Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).</li>
<li>Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+BY-2+cell+line+as+the+%26%2334%3BHeLa%26%2334%3B+cell+in+the+cell+biology+of+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Tobacco BY-2 cell line as the &#34;HeLa&#34; cell in the cell biology of higher plants.</a> Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).</li>
<li>Centomani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+DNA+methylation+in+the+control+of+cell+growth+during+heat+stress+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells.</a> Protoplasma. , 1-9 (2015).</li>
<li>Sgobba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+deficiency+stimulates+a+stress+condition+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechnologia%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells.</a> BioTechnologia. 94 (2), (2013).</li>
<li>Väisänen, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coniferyl+alcohol+hinders+the+growth+of+tobacco+BY-2+cells+and+Nicotiana+benthamiana+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings.</a> Planta. 242 (3), 747-760 (2015).</li>
<li>Ortiz-Espìn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+Trxo1+increases+the+viability+of+tobacco+BY-2+cells+under+H2O2+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Botany%22%5BJournal%5D)">Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment.</a> Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).</li>
<li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cis-Golgi+proteins+accumulate+near+the+ER+exit+sites+and+act+as+the+scaffold+for+Golgi+regeneration+after+brefeldin+A+treatment+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Bio.+Cell%22%5BJournal%5D)">cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells.</a> Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).</li>
<li>Madison, S. L., Nebenführ, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+dual-labeled+Golgi+stacks+in+tobacco+BY-2+cells+reveals+similar+behaviors+for+different+cisternae+during+movement+and+brefeldin+A+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment.</a> Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).</li>
<li>de Pinto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-nitrosylation+of+ascorbate+peroxidase+is+part+of+programmed+cell+death+signaling+in+tobacco+Bright+Yellow-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).</li>
<li>Hanamata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+monitoring+of+autophagic+flux+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signa.+Behav%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510(2013).</li>
<li>Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+Studies+on+proliferation%2C+differentiation%2C+and+death+of+BY-2+cultured+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytologia%22%5BJournal%5D)">Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells.</a> Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).</li>
<li>Yasuhara, H., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aphidicolin-induced+nuclear+elongation+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).</li>
<li>Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+coupled+cell-free+transcription-translation+system+based+on+tobacco+BY-2+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates.</a> Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).</li>
<li>Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+BY-2+cell-free+lysate%3A+an+alternative+and+highly-productive+plant-based+in+vitro+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system.</a> BMC Biotechnol. 14 (1), 37(2014).</li>
<li>Alieva, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+coral+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of coral fluorescent proteins.</a> PLoS ONE. 3 (7), 2680(2008).</li>
<li>Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+regeneration+from+leaf-derived+protoplasts+within+the+Daucus+genus%3A+effect+of+different+conditions+in+alginate+embedding+and+phytosulfokine+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Tiss.+Org%22%5BJournal%5D)">Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application.</a> Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).</li>
<li>Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+gene+expression+system+in+Populus+euphratica+Oliv.+protoplasts+prepared+from+suspension+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physio.+Plant%22%5BJournal%5D)">A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells.</a> Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).</li>
<li>Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+PEG-mediated+transient+gene+expression+system+in+grape+protoplasts+and+its+application+in+subcellular+localization+studies+of+flavonoids+biosynthesis+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Hort%22%5BJournal%5D)">An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes.</a> Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).</li>
<li>Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transformation+of+oil+palm+protoplasts+by+PEG-mediated+transfection+and+DNA+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection.</a> PLoS One. 9 (5), 96831(2014).</li>
<li>Sasamoto, H., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+nicotinic+acid%2C+nicotinamide+and+trigonelline+on+the+proliferation+of+lettuce+cells+derived+from+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts.</a> Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).</li>
<li>Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+embryo+formation+from+co-cultivated+protoplasts+of+Brassica+rapa+%26+B.+juncea%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Exp.+Ag%22%5BJournal%5D)">Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea.</a> Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).</li>
<li>Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation+system+for+production+of+fertile+transgenic+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants.</a> Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).</li>
<li>Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplast+isolation+and+transient+gene+expression+in+switchgrass%2C+Panicum+virgatum+L%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L.</a> Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).</li>
<li>Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switchgrass+%28Panicum+virgatum+L.%29+cell+suspension+cultures%3A+Establishment%2C+characterization%2C+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application.</a> Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).</li>
<li>Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+transient+transformation+in+tobacco+protoplasts+is+independent+of+plasmid+amount%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount.</a> Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).</li>
<li>Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+accumulation+of+GFP+in+a+non-acididc+vacuolar+compartment+via+a+C-terminal+propeptide-mediated+sorting+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway.</a> Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).</li>
<li>De Sutter, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+jasmonate+signalling+via+automated+and+standardized+transient+expression+assays+in+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells.</a> Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier en compétition.

Le protocole décrit ci-dessus a été validé avec succès pour l&#39;isolement de protoplastes, l&#39;énumération et la transformation du tabac en utilisant une culture de cellules en suspension BY-2; Toutefois, le protocole pourrait facilement être étendu à toute culture de suspension de la plante. À l&#39; heure actuelle, l&#39; isolement de protoplastes et la transformation ont été réalisés dans de nombreuses plantes, notamment le maïs (Zea mays) 10, la carotte (Daucus carota) 32,...

Ces dernières années , il y a eu une impulsion significative placé sur la conception des cultures transgéniques pour surmonter diverses maladies 1, conférer une résistance aux herbicides 2, confère la sécheresse 3,4 et la tolérance au sel 5, prévenir herbivory 6, augmenter le rendement de la biomasse 7, et de diminuer la paroi cellulaire récalcitrante 8. Cette tendance a été favorisée par le développement de nouveaux outils moléculaires pour générer des plantes transgéniques, y compris le génome d&#39;édition en utilisant CRISPR et TALENs 9 et silençage génique par ARNdb 10, miRNA 11 et siRNA 12. Bien que ces technologies ont simplifié la génération de plantes transgéniques, ils ont également créé un goulot d&#39;étranglement, où le grand nombre de plantes transgéniques générées ne peuvent pas être criblée en utilisant les systèmes traditionnels qui reposent sur la régénération des plantes. Associés à ce goulot d&#39;étranglement, tout en réduisant au silence et génome édition constructions peuvent être insérés rapidement dans les plantes, un grand nombre detraits ciblés ne parviennent pas à produire l&#39;effet désiré, qui est souvent découverte que les plantes sont analysées dans la serre. Dans ce travail, nous avons développé une méthode pour rapide automatisée, le dépistage, à haut débit de protoplastes végétaux, en particulier pour résoudre le goulot d&#39;étranglement dans le dépistage précoce d&#39;un grand nombre de génomes d&#39;édition et le gène silencieux cibles. L&#39;utilisation de protoplastes, par opposition à des cellules végétales intactes, présente plusieurs avantages pour le développement d&#39;une plateforme automatisée. Tout d&#39; abord, les protoplastes sont isolés après digestion de la paroi cellulaire de la plante, et cette barrière ne présentent plus, l&#39; efficacité de transformation 13 est augmentée. Dans les cellules végétales intactes il y a seulement deux méthodes bien établies pour la transformation, biolistique 14 et Agrobacterium transformation médiée 15. Aucune de ces méthodes peuvent être facilement convertis aux plates-formes de manipulation de liquides, comme biolistique nécessite un équipement spécialisé pour transformation, alors que Agrobacterium transformation médiée nécessite co-culture et l&#39; élimination ultérieure des bactéries. Ni se prêtent à des procédés à haut débit. Dans le cas de protoplastes, la transformation est habituellement effectuée en utilisant le polyéthylène glycol (PEG) de transfection médiée 16, qui ne nécessite plusieurs échanges de solutions, et est idéale pour les plates - formes de manipulation de liquides. En second lieu, les protoplastes, par définition, sont des cultures monocellulaires, et donc les problèmes associés à l&#39;agglutination et la formation chaîne dans des cultures de cellules végétales, ne sont pas observés dans les protoplastes. En termes de dépistage rapide à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre à base de plaque, l&#39;agglutination des cellules, ou des cellules dans plusieurs plans vont conduire à des difficultés dans l&#39;acquisition de mesures cohérentes. Etant donné que les protoplastes sont aussi plus denses que les milieux de culture, ils sédimentent au fond du puits, la formation d&#39;une monocouche, ce qui est favorable à la spectrophotométrie sur la base de plaque. Enfin, alors que les cultures en suspension de cellules végétales sont primarille dérivé de 17 cals, les protoplastes peuvent être récoltées à partir d&#39; un certain nombre de tissus végétaux, conduisant à la possibilité d&#39;identifier une expression spécifique d&#39; un tissu. Par exemple, la capacité d&#39;analyser root- ou une expression spécifique de feuille d&#39;un gène peut être très important pour la prédiction du phénotype. Pour ces raisons, les protocoles mis au point dans ce travail ont été validées en utilisant des protoplastes isolés du tabac largement utilisé (Nicotiana tabacum L.) 2 (PAR-2) de culture en suspension &#39;Bright Yellow&#39;. La culture en suspension BY-2 a été décrite comme étant la cellule &quot;Hela&quot; des plantes supérieures, en raison de son utilisation généralisée dans l&#39; analyse moléculaire des cellules végétales 18. Récemment, PAR-2 cellules ont été utilisées pour étudier les effets de facteurs de stress plante 19-22, protéine intracellulaire localisation 23,24, et la biologie cellulaire de base 25-27 démontrant l&#39;utilité générale de ces cultures en biologie végétale. Un avantage supplémentaire de BY-2 est la culturepossibilité de synchroniser les cultures avec aphidicoline, ce qui peut conduire à une meilleure reproductibilité pour l&#39; expression génique des études 28. En outre, des méthodes ont été mises au point pour l&#39;extraction de PAR-2 protoplastes utilisant des enzymes à faible coût 29,30, comme enzymes traditionnellement utilisées pour générer des protoplastes sont des coûts prohibitifs pour les systèmes à haut débit. En tant que tel, le protocole décrit ci-dessous a été validé en utilisant la culture en suspension BY-2, mais il devrait être amendable à une culture usine de suspension cellulaire. Les expériences de validation de concept sont effectuées en utilisant une protéine de fluorescence orange (OFP) gène rapporteur (pporRFP) des Porites de coraux durs porites 31 sous le contrôle du promoteur CAMV 35S.

<table><tbody><tr><td>Orbitor RS Déménageur de microplaques</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bravo Liquid Handler</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Lecteur multimode</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Distributeur multimode</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teleshake</td><td>Inheco</td><td>3800048</td><td></td></tr><tr><td>CPAC Ultraflat Heater/cooler</td><td>Inheco</td><td></td><td></td>7000190</tr><tr><td>Logiciel d’automatisation Vworks</td><td>Logiciel Agilent</td><td></td><td>utilisé pour contrôler et écrire des protocoles pour Agilent Bravo</td></tr><tr><td>Logiciel Momentum</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Logiciel de planification des tâches pour le contrôle Orbiter RS</td></tr><tr><td>Liquid Handling Control 2.17 Logiciel</td><td>Biotek</td><td></td><td>Logiciel utilisé pour contrôler et écrire des protocoles pour le</td></tr><tr><td>microscope inversé MultiFlo FX IX81</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyla 3-Tap Caméra microscope</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3/TRITC Filter Set</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Rohament CL</td><td>AB Enzymes flacon d’échantillon</td><td></td><td>cellulase à faible coût</td></tr><tr><td>Rohapect UF</td><td>AB Enzymes flacon d’échantillon</td><td></td><td>pectinase à faible coût</td></tr><tr><td>Rohapect 10L</td><td>AB Enzymes</td><td>flacon d’échantillon</td><td>pectinase/arabinase à bas prix</td></tr><tr><td>Linsmaier & Skoog Basal Medium</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>L689</td><td></td></tr><tr><td>Acide 2,4-dichlorophénoxyacétique</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>D295</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Poly(éthylène glycol) 4000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95904-250G-F</td><td>Anciennement Fluka PEG</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Fisher Scientific</td><td>25535-16-4</td><td>Acros Organics</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan CM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1910-250G</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 6 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>103184</td><td></td></tr><tr><td>96 puits 1,2 ml Plaque de puits profond</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0564</td><td></td></tr><tr><td>Plaque inférieure optique 96 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Finntip 1000 Pointes</td> <td>de pipette à large diamètreThermo Scientific</td><td>9405 163</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC17259-5000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr></tbody></table>

une plate-forme robotique pour haut débit protoplastes isolement et transformation

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Au cours de la dernière décennie, il y a eu une résurgence de l&#39;utilisation des protoplastes végétaux qui vont des espèces modèles pour recadrer les espèces, pour l&#39;analyse des voies de signalisation de la transduction, les réseaux de régulation transcriptionnelle, l&#39;expression des gènes, génome d&#39;édition, et la neutralisation des gènes. En outre, des progrès significatifs ont été réalisés dans la régénération des plantes à partir de protoplastes, qui a généré encore plus d&#39;intérêt dans l&#39;utilisation de ces systèmes pour la génomique végétale. Dans ce travail, un protocole a été mis au point pour l&#39;automatisation de l&#39;isolement de protoplastes et la transformation de 2 (PAR-2) la culture du tabac en suspension un «Bright Yellow» en utilisant une plate-forme robotique. Les procédures de transformation ont été validés à l&#39;aide d&#39;une protéine fluorescente orange (OFP) gène rapporteur (pporRFP) sous le contrôle du promoteur de chou-virus de la mosaïque 35S (35S). OFP expression dans des protoplastes a été confirmée par microscopie à épifluorescence. Les analyses comprenaient également des méthodes d&#39;efficacité de production protoplastes utilisant propidium iodure. Enfin, les enzymes de qualité alimentaire à faible coût ont été utilisés pour la procédure d&#39;isolement de protoplastes, de contourner la nécessité d&#39;enzymes de laboratoire de qualité qui sont un coût prohibitif en haut débit automatisé isolement et l&#39;analyse protoplastes. Basé sur le protocole mis au point dans ce travail, la procédure complète de l&#39;isolement de protoplastes à la transformation peut être réalisée en moins de 4 heures, sans aucune intervention de l&#39;opérateur. Alors que le protocole mis au point dans ce travail a été validé avec la culture cellulaire BY-2, les procédures et les méthodes doivent être traduisible à tout système de culture en suspension végétale / protoplastes, ce qui devrait permettre une accélération de la recherche en génomique des cultures.

Dans la présente étude, le taux de doublement de BY-2 a varié de 14 à 18 h dépendant de la température à laquelle les cultures ont été incubées, en accord avec les rapports précédents, d&#39;une longueur moyenne de 15 heures du cycle cellulaire. Avec ce taux de doublement, 1: 100 à partir inoculum a été utilisé pour initier des cultures, ce qui conduit à des cultures avec un volume cellulaire tassé (CVP) de 50% en 5-7 jours. Dans le protocole actuel, dans lequel les cultures ont été cult...

Une méthode à haut débit automatisée, la production de tabac en protoplastes et la transformation est décrite. Le système robotisé permet l&#39;expression du gène massivement parallèle et de découverte dans le système modèle BY-2 qui devrait être traduisible aux cultures non-modèle.

Une plate-forme robotique pour haut débit protoplastes Isolement et Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

L'objectif général de ce protocole est de développer une méthode permettant le criblage rapide et automatisé à haut débit de protoplastes végétaux, spécifiquement conçue pour surmonter l'actuel goulot d'étranglement dans le criblage précoce d'un grand nombre de cibles d'édition du génome et de silençage génique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biotechnologie végétale. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à permettre la production et la transformation automatisées de protoplastes à haut débit, permettant ainsi un criblage parallèle rapide de la fonction des promoteurs dans l'expression génique.Cette procédure sera démontrée en utilisant la culture en suspension largement utilisée du tabac Bright Yellow 2, ou BY-2. Commencez par faire croître une culture BY-2 dans un flacon Erlenmeyer, comme décrit dans le texte du protocole. Le jour de l'isolement des protoplastes, mélangez soigneusement la culture car les cellules se déposent rapidement, puis transférez six millilitres de la culture dans un tube conique de 15 millilitres.Laisser les cellules se déposer pendant au moins 10 minutes. Ajuster le volume cellulair

a-robotic-platform-for-high-throughput-protoplast-isolation

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Efficace polyéthylène glycol transformation médiée (PEG) de la mousse Physcomitrella patens</em

Nous décrivons ici un écran surexpression plasmide...

Haut débit écran surexpression plasmide de levure

Un haut-débit, plate-forme automatisée de développement des cellules de fabrication pour produire des protéines thérapeutiques est décrite. La mise en œuvre de la BD FACS Aria trieur de cellules, CloneSelect Imager et TECAN Freedom EVO système de manipulation de liquides a démontré la capacité de traitement significativement augmenté dans le développement de la lignée cellulaire avec une qualité améliorée de lignée cellulaire et la reproductibilité élevée.

Une plate-forme à haut débit automatisé pour le développement de lignées cellulaires de fabrication des protéines thérapeutiques

Cet article décrit la transformation génétique de l'algue marine...

Transformation génomique de la Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Nous décrivons une méthode pour la purification par affinité marquée de protéines recombinantes utilisant la robotique de manipulation des liquides. Cette méthode est généralement applicable à la purification à petite échelle de l'solubles dans l'His-protéines marquées dans un format à haut débit.

À haut débit Affinity Purification de protéines recombinantes-étiquette

Est présenté ici, un workflow automatisé pour effectuer le montage de « dispositif » ADN modulaire en utilisant une méthode d’assemblage des ADN clonage modulaire sur les robots de manutention liquide. Le protocole utilise un outil logiciel intuitif pour générer des listes déroulantes gestionnaire liquide pour combinatoire génération de bibliothèque dispositif ADN, qui nous montrent l’utilisation de deux plates-formes de manipulation de liquides.

Automatisé de robotique Liquid Handling assemblage de dispositifs modulaires ADN

Nous avons développé un protocole simple et efficace pour la préparation de grandes quantités de protoplastes de soja afin d’étudier les mécanismes réglementaires et signalisation complexes dans des cellules vivantes.

Une méthode Simple pour l’isolement de protoplastes de soja et Application aux Analyses d’Expression génétique transitoire

Nous décrivons ici un protocole pour exprimer les protéines dans des protoplastes à l’aide de la méthode de transformation par PEG. La méthode fournit une expression simple de protéines d’intérêt et un examen efficace de la localisation de la protéine et le processus d’importation pour diverses conditions expérimentales in vivo.

Étudier l’Import des protéines dans des chloroplastes à l’aide de protoplastes

Ici, nous présentons un protocole à haut débit pour transfecter transitoirement des millions de protoplastes de maïs afin de tester de grandes banques de plasmides dans des cellules mésophylles de maïs.

Transfection évolutive de protoplastes mésophylles de maïs

Nous décrivons l’utilisation d’une plateforme d’expression génique multiplexée à haut débit qui quantifie l’expression génique en codant à barres et en comptant les molécules dans les substrats biologiques sans avoir besoin d’amplification. Nous avons utilisé la plateforme pour quantifier l’expression des microARN (miARN) dans le sang total chez des sujets avec et sans syndrome du côlon irritable.

Perturbations de circulation miARN dans le syndrome du côlon irritable détectée en utilisant un multiplexée à haut débit Gene Expression Plate-forme

Découvrez une méthode robotisée pour l'isolation et la transformation de protoplastes de tabac BY-2 en haut débit. Cette approche automatisée permet le criblage parallèle rapide de la fonction des promoteurs en biotechnologie végétale.

Une plate-forme robotique pour haut débit protoplastes Isolement et Transformation

Explorer plus de vidéos