Name: Observation et Quantification de Mating Comportement dans le nématode, Bursaphelenchus xylophilus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Découvrez le comportement d'accouplement chez Bursaphelenchus xylophilus en utilisant un protocole d'observation de nématodes vierges. Cette méthode permet d'étudier la biologie comportementale et les cycles de vie des nématodes du pin.

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Najie Zhu Liqun et Bai ont contribué également à ce travail. Ce travail a été soutenu financièrement par le Fonds spécial pour la recherche forestière scientifique dans le bien-être public (201204501) et la National Natural Science Foundation de Chine (31170604, 31270688 et 31570638). Nous remercions le Dr Holighaus Gerrit et la Dre Danielle Hickford pour leurs suggestions utiles sur l&#39;anglais écrit.

1. Acquisition de Virgin adultes Nématodes <ol><li> Pinewood nematode isolat et des conditions de culture NOTE: Le B. xylophilus isoler Nxy61 a été extrait d&#39;un massoniana Pinus malade dans la région de Ningbo de la province du Zhejiang en Chine. <ol><li> Préparer Potato Dextrose Agar (PDA, voir le tableau des matériaux) plaques pour la culture Botrytis cinerea. </li><li> Pour l&#39; inoculation, percer un morceau de tapis fongique avec un diamètre de 10 mm à partir d&#39; un tapis B. cinerea et le mettre dans le milieu d&#39;une nouvelle plaque de PDA. Culture B. cinerea pendant 5 jours à 25 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Culture des nématode du pin dans la boîte de Pétri préparée contenant B. cinerea à 25 ° C dans l&#39;obscurité. </li></ol></li><li> Acquisition de B. xylophilus oeufs <ol><li> Placer un tube en caoutchouc serré en dessous d&#39;un entonnoir et maintenir l&#39;entonnoir disposé dans un rack pour assembler leAppareil d&#39;entonnoir Baermann. Placer deux couches de papier filtre à la place de la gaze à l&#39;embouchure de l&#39;entonnoir. </li><li> Transférer les cultures fongiques à la configuration de l&#39;entonnoir et ajouter de l&#39;eau jusqu&#39;à ce que le tapis fongique est immergé. Attendre 2 h, et les nématodes sortiront de la culture fongique, traverser le papier filtre, et s&#39;installer dans la partie la plus basse de l&#39;entonnoir Baermann. </li><li> Rassembler les deux premières gouttes d&#39;eau à partir du fond du tube dans un tube de 15 ml et recueillir les nématodes en relâchant lentement la pince sur le tube. </li><li> Centrifuger les collections ci-dessus à 3000 g pendant 2 min à température ambiante. </li><li> Retirer la couche supérieure de l&#39; eau avec une pipette et remettre en suspension avec 1 ml de stérile doublement distillée (dd) H 2 O. </li><li> Avec une pipette, transférer la remise en suspension au-dessus d&#39;une boîte de Petri nouveau en verre (diamètre 6 cm). Ajouter 3 ml de stérile dd H 2 O à la boîte de Pétri pour garantir que les nématodes sont capables de nager librement. </li><li> Gardez les nématodes dans les glass boîte de Pétri pendant 10 min à 25 ° C dans l&#39;obscurité. Les oeufs seront pondus par les femelles enceintes. En raison de leur surface de glycoprotéine, les œufs coller au fond du verre boîte de Pétri. </li><li> Retirer l&#39;eau et les vers soigneusement, sans déranger les œufs. Ajouter 3 ml de stérile dd H 2 O au verre boîte de Pétri immédiatement pour empêcher les oeufs de se dessécher. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.2.8 3x pour supprimer toutes les larves et les adultes, et d&#39;obtenir des œufs purs. Ajouter un supplément de 2 mL (5 ml au total) de stérile dd H 2 O à la boîte de Pétri. </li></ol></li><li> Acquisition des juvéniles de quatrième stade (J4 larves) <ol><li> Hatch les œufs récoltés pendant 24 h dans l&#39;obscurité à 25 ° C pour obtenir des larves de J2. </li><li> Transfert des larves de J2 avec une pipette dans un tube de 15 ml, centrifuger à 3000 g pendant 2 min, et enlever la couche supérieure de l&#39;eau. </li><li> Resuspendre les larves de J2 avec 200 pi de stérile dd H 2 O, puis les transférer àla plaque de PDA contenant B. cinerea. </li><li> Culture de la larve de J2 pendant 52 h à 25 ° C dans l&#39;obscurité. A ce point du temps, la plupart des larves J2 aura développé dans le stade précoce des larves J4. </li></ol></li><li> Acquisition de nématodes adultes vierges <ol><li> Préparer une aiguille pour prélever des nématodes en dessinant un capillaire en verre après le chauffage au-dessus d&#39;un brûleur à alcool. REMARQUE: La pointe de cette aiguille capillaire doit généralement être de 50 um de diamètre, à peu près la largeur du corps d&#39;un nematode adulte, de sorte qu&#39;il peut être utilisé comme outil pour ramasser un seul nématode. </li><li> Assembler un entonnoir Baermann et extraire les nématodes des cultures fongiques pendant 2 h, comme décrit dans les étapes 1.2.1 - 1.2.3. </li><li> Transférer le J4 avec de l&#39;eau dans une boîte de Pétri propre. </li><li> Observer les nématodes sous un stéréomicroscope et de distinguer entre les hommes et les femmes par la morphologie génitale, comme décrit par Mamiya et Kiyohara 8 (Figure 1 </strong&gt;). Ramasser un nématode du sexe désiré avec l&#39;aiguille capillaire préparé et transférer à la plaque fongique-culture appropriée pour les hommes ou les femmes. NOTE: Il y a plus de femmes que d&#39;hommes, avec le pourcentage de femmes à 60 - 70%. La vulve féminine est évidemment différent du spicule mâle. Par rapport à l&#39;adulte, la spicule ou de la vulve au J4 stade précoce est plus petit, mais ils peuvent encore être facilement vu et distingué. Le nématode est toujours en mouvement dans l&#39;eau, ce qui augmente parfois la difficulté de distinguer les mâles et les femelles. </li><li> La culture des larves J4 pendant encore 24 heures à 25 ° C dans l&#39;obscurité. REMARQUE: Tous les nématodes devraient devenir des adultes, mais comme ils sont déconnectés, ils sont considérés comme des adultes vierges. </li><li> Assembler deux Baermann entonnoirs et extraire les adultes vierges des cultures de champignons pendant 2 h, comme décrit dans les étapes 1.2.1 - 1.2.3, et transférer les mâles et les femelles adultes vierges en deux, des boîtes de Petri propres séparés. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Observation et enregistrement vidéo de Mating Comportement <ol><li> Préparer plusieurs diapositives concaves et ajouter 200 ul d&#39; eau stérile jj H 2 O à chacun de leurs puits. </li><li> Décrochez le mâle préparé vierge adulte ou et femelle avec une aiguille capillaire et de mettre un seul nématode dans l&#39;eau de chaque diapositive concave. </li><li> Gardez les adultes vierges à l&#39;intérieur du puits pendant 1 h pour permettre leur adaptation au nouvel environnement aqueux. </li><li> Associez un mâle vierge et femelle en transférant l&#39;un d&#39;entre eux d&#39;un puits à l&#39;autre en utilisant une pipette. </li><li> Observez le comportement d&#39;accouplement de la 1♀ 1♂ combinaison + dans la glissière concave sous un stéréomicroscope. </li><li> Pour analyser l&#39;efficacité d&#39;accouplement des adultes vierges, calculer leur taux de succès d&#39;accouplement (R) et le comparer à celui des couples d&#39;adultes choisis au hasard. Calculer R comme le pourcentage de réplications dans lequel copulation a été observée par rapport au nombre total de répétitions étudiées. </li><li&gt; Pour étudier le choix de l&#39;accouplement et de la concurrence intrasexuelle, groupe et observer les nématodes vierges de deux combinaisons différentes: 1♀ + 3♂ et 3♀ + 1♂. </li><li> Afin de recueillir des données pour l&#39;analyse qualitative et quantitative, filmer le comportement d&#39;accouplement en utilisant la microscopie vidéo. En règle générale, l&#39;ensemble du processus d&#39;accouplement, à partir du moment où les nématodes sont placés dans le puits de la lame concave au moment où ils se déplacent à une distance après la copulation, est achevée en 2 heures. Par conséquent, enregistrer le processus d&#39;accouplement en continu pendant au moins 2 h comme une répétition. Remplir au moins 30 répétitions au total pour chaque combinaison. NOTE: Ajouter plus stérile dd H 2 O (habituellement 50 pi) toutes les 0,5 h au puits pour compenser l&#39;évaporation pendant le processus d&#39;enregistrement. </li></ol> 3. Collecte de données <ol><li> Voir toutes les vidéos avec précaution sur un écran d&#39;ordinateur et de caractériser les sous-comportements qualitativement. </li><li> Mesurer la durée d&#39;accouplement à l&#39;aide ièmee fonction image par image de l&#39;enregistreur vidéo. Manuellement soustraire le temps à partir du point d&#39;extrémité. </li><li> Pour la combinaison 1♀ + 1♂, analyser chaque enregistrement vidéo et de mesurer la durée des événements suivants: <ol><li> Mesurer la durée de la recherche ( à savoir le moment à partir duquel la femelle et mâle sont introduits dans le puits de la lame concave pour le moment qu&#39;ils rencontrent et communiquer entre eux). </li><li> Mesurer la durée de mise en contact (ie, le temps depuis le premier contact jusqu&#39;au moment où le mâle est précisément positionné à la vulve de la femme pour la première copulation). </li><li> Mesurer la durée de copuler (ie, le temps entre le moment où le mâle est précisément positionné à la vulve de la femelle jusqu&#39;à ce qu&#39;il glisse vers le bas du corps de la femelle après l&#39; éjaculation). Remarque: Certains nématodes peuvent copuler plusieurs fois dans 2 h. Dans de tels cas, de mesurer la durée de copulation de la première copulation à la fin de la last-ci, y compris le temps entre les deux. </li><li> Mesurer la durée persistante ( par exemple, la période après l&#39; accouplement jusqu&#39;à ce que la nage mâle et femelle loin de l&#39;autre et sont séparés par une distance supérieure à la longueur du corps de nematodes ( le plus souvent 1 mm)). </li></ol></li><li> Compter la fréquence de copulation et la durée de chaque copulation et la durée moyenne de l&#39; ensemble des copulations en 2 h pour chacune des combinaisons différentes (c. -à 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ et 1♀ + 3♂). </li><li> Calculer le taux de succès d&#39;accouplement pour le premier contact (P) pour les différentes combinaisons que le taux de réussite de l&#39;accouplement après le premier contact, qui est conduit immédiatement et sans interruption. Dans la phase en contact, plusieurs contacts peuvent être observés avant la copulation réelle. <ol><li> Lorsque la distance entre deux individus est supérieure à la longueur du corps, envisager un contact pour être terminée. Pour une répétition, record P 100% lorsque la copulation is observé immédiatement après le premier contact, sans interruption, ou 0,00% si aucune copulation a été observée ou s&#39;il y avait copulation mais après deux ou plusieurs contacts. NOTE: Il y avait 30 répétitions pour chaque combinaison décrite ici. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Tokushige, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+sp.+in+the+wood+of+dead+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jap.+For.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees.</a> J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).</li>
<li>Sun, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+xylophilus+was+discovered+in+Sun+Yet-sen%27s+mausoleum+in+Nanjing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jiangsu+Fore.+Sci.+Tech.+%28in+Chinese%29%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing.</a> J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47(1982).</li>
<li>Mota, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+Portugal+and+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe.</a> Nematology. 1, 727-734 (1999).</li>
<li>Robertson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+the+pine+wood+nematode+Bursaphelenchus+xylophlius+Steiner+%26+Buhrer%2C+1934+%28Nickle%2C+1970%29+in+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain.</a> Nematology. 13, 755-757 (2011).</li>
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<li>Mamiya, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+Bursaphelenchus+lignicolus.+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Aphelenchoididae%29+from+pine+wood+and+histophathology+of+nematode-infested+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees.</a> Nematologica. 18, 120-124 (1972).</li>
<li>Liu, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+features+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+the+mating+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process.</a> Nematology. 16, 895-902 (2014).</li>
<li>Simon, J. M., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+mate+finding+cue+in+the+hermaphrodite+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).</li>
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<li>Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+attraction+and+mating+in+Bursaphelenchus+okinawaensis+and+B.+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nematol%22%5BJournal%5D)">Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus.</a> J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les tests comportementaux sont un aspect fondamental de l&#39;écologie chimique, la neurobiologie, la biologie moléculaire et la génétique. Nématodes, et en particulier C. elegans, sont largement utilisés pour des études dans ces domaines. Le comportement d&#39;accouplement de C. elegans a été étudiée précédemment 10-11. Cependant, B. xylophilus est gonochorique et différent des C. elegans hermaphrodites, et son processus d&#39;accouplement a différentes caractéristiques co...

Le nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner et Buhrer) Nickle, est l’une des espèces envahissantes les plus destructrices, causant le flétrissement et finalement la mort des pins. On pense que ce nématode pathogène est originaire des États-Unis, mais il a été transporté dans plusieurs pays, dont la Chine, le Japon, la Corée du Sud et le Portugal. Récemment, il a également été signalé en Espagne, tuant des millions de pins avec d’énormes pertes économiques et menaçant la production forestière et la stabilité écologique.
Une fois qu’un pin hôte est infecté par des nématodes du pin, des milliers de millions de descendants se propagent rapidement dans le tronc. Cela provoque un dysfonctionnement du xylème, entraînant le flétrissement et finalement la mort de l’arbre hôte6. Cependant, il n’existe actuellement aucun moyen efficace de contrôler cette maladie. Le comportement d’accouplement pourrait jouer un rôle important dans la fécondité élevée de ce nématode7. Nous avons donc étudié le comportement d’accouplement de B. xylophilus en laboratoire, en essayant de trouver un moyen efficace de perturber son accouplement et de diminuer sa fécondité. 
Ce protocole a pour but d’introduire les méthodes détaillées pour obtenir les adultes vierges de B. xylophilus et pour observer et analyser le comportement d’accouplement à l’aide d’un enregistreur vidéo et d’un stéréomicroscope. Ce protocole peut également être utilisé comme référence pour les études comportementales d’autres nématodes.

<table><tbody><tr><td>Isolat de B. xylophilus Nxy61</td><td></td><td></td><td>Extrait de Pinus massoniana dans la région de Ningbo en Chine</td></tr><tr><td>Souche</td><td></td><td></td> de moisissure grise <td>Obtenue de l’Académie forestière de Chine</td></tr><tr><td>Entonnoirs Baermann</td> Tubes de faucon <td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipette</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stérile dd H2O</td><td></td><td></td><td>Stérilisée par haute pression de vapeur à 121 &deg ; C pendant 30 min.</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDA medium</td><td>Huankai Bio.</td><td>021050</td><td></td></tr><tr><td>incubateur</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flux laminaire</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>verre capillaire</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stéréoscope</td><td>Leica</td><td>LED5000 RL</td><td></td></tr><tr><td>stéréomicroscope inversé</td><td>Zeiss</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>lames concaves</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

observation et quantification de mating comportement dans le nématode, bursaphelenchus xylophilus

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Une méthode d&#39;observation et de quantifier le comportement d&#39;accouplement du nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus, a été créé sous un stéréomicroscope. Pour améliorer l&#39;efficacité de l&#39; accouplement de B. Xylophilus et d&#39;augmenter les chances d&#39;observation de l&#39; accouplement, les adultes vierges ont été cultivées et utilisées pour l&#39;enquête. Les œufs ont été obtenus en gardant les nématodes dans l&#39;eau et en permettant aux femelles à pondre des oeufs pendant 10 min. Les juvéniles de deuxième stade (J2) ont été synchronisées par incubation des oeufs pendant 24 h à 25 ° C dans l&#39;obscurité, et le début du J4 ont été obtenus en cultivant le J2 avec de la moisissure grise, Botrytis cinerea, pour un autre 52 h. A ce point du temps, la plupart des nématodes J4 pourraient être clairement distingué comme étant un homme ou une femme en utilisant leur morphologie génitale. Le mâle et la femelle J4 ont été recueillies et cultivées séparément dans deux plats différents de Pétri pendant 24 h pour obtenir nématodes adultes vierges. Un mâle et une femelle vierge vierge ont été jumelés dans une goutte de water dans le puits d&#39;une lame concave. Le comportement d&#39;accouplement a été filmé avec un enregistreur vidéo sous un stéréomicroscope. Toute la période du processus d&#39;accouplement était de 82,8 ± 3,91 min (moyenne ± SE) et pourrait être divisé en 4 phases différentes: la recherche, contact, copuler et persistants. Les minutes moyennes de durée étaient de 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 et 7,2 ± 0,5, respectivement. sous-comportements Onze ont été décrits: croisière, approche, rencontrer, toucher, frettage, la localisation, la fixation, éjaculer, séparer, quiescence, et l&#39;itinérance. Fait intéressant, la concurrence intra-sexuelle évidente a été observée lorsque une femme a été regroupé avec 3 mâles ou d&#39;un mâle avec 3 femelles. Ce protocole est utile et précieux, non seulement dans l&#39; étude du comportement d&#39;accouplement de B. xylophilus, mais aussi en agissant comme une référence pour les études éthologiques des autres nématodes.

Le taux de succès d'accouplement (R) des adultes vierges était 86,67% en moyenne, ce qui est nettement plus élevé que celui des adultes choisis au hasard: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, P = 0,0001) (figure 2). Cette découverte suggère qu'il est plus facile d'observer le comportement d'accouplement de B. xylophilus avec des adultes vierges que les adultes choisis au hasard. Quand...

Un protocole pour étudier le comportement d’accouplement du nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus, est présenté. Les caractéristiques comportementales de B. xylophilus sont décrites dans le processus d’accouplement.

Observation et Quantification de Mating Comportement dans le nématode, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

L’objectif global de cette procédure est d’observer le comportement d’accouplement du nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus. Cette méthode peut aider à faire progresser les études psychologiques du nématode. Il s’agit spécifiquement de l’observation du comportement d’accouplement du nématode du pin.Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible d’obtenir des adultes vierges, ce qui facilite grandement l’observation du comportement d’accouplement des adultes. Les implications de cette technique s’étendent uniquement à l’étude plus large des nématodes, car ils ont des comportements similaires aux cycles de vie. Car la démonstration de cette méthode est essentielle, car l’acquisition de nématodes adultes vierges est difficile car les contraintes des nématodes en développement nécessitent de la pratique et il n’est pas facile de distinguer précisément les mâles des femelles chez les juvéniles au premier stade.Pour cultiver des nématodes du pin, préparez d’abord des plaques de gélose au dextrose de pomme de terre. Pour inoculer une plaque, perforez un morceau de tapis fongique d’un diamètre de 10 millimètres à partir d’un tapis betritus senaria, et placez-le au milieu d’une nouvelle plaque PDA. Cultivez le tapis fongique pendant cinq jours à 25 degrés Celsius dans l’obscurité.Après cinq jours, ajoutez les nématodes du pin dans la boîte de Pétri préparée et cultivez-les pendant trois jours à 25 degrés Celsius dans l’obscurité. Pour isoler les nématodes du champignon, préparez d’abord un outil de collecte. Placez un tube en caoutchouc serré sous un entonnoir et tenez l’entonnoir préparé dans une grille pour assembler l’appareil d’entonnoir Baermann.Ensuite, placez deux couches de papier filtre au lieu de gaze dans l’embouchure de l’entonnoir. Maintenant, transférez les cultures fongiques dans la configuration de l’entonnoir et ajoutez de l’eau jusqu’à ce que le tapis fongique soit immergé. Au bout de deux heures, les nématodes sortiront de la culture fongique, traverseront le papier filtre et s’installeront dans la partie la plus basse de l’entonnoir Baermann.Récupérez les nématodes en plaçant un tube de 15 millilitres sous l’entonnoir, puis en relâchant lentement la pince pour recueillir quelques gouttes d’eau, qui contiendront les nématodes. Centrifuger les collections de nématodes à 3 000 G pendant deux minutes à température ambiante. Ensuite, asparez le niveau supérieur de l’eau et remettez les vers en suspension dans un millilitre d’eau.Transférez la suspension des nématodes dans un plat en verre de six centimètres et ajoutez trois millilitres d’eau pour aider les nématodes à nager librement. Maintenant, collectez des œufs pour faire des bouillons vierges. Transférez le plat dans un incubateur sombre et laissez les femelles enceintes pondre des œufs pendant 10 minutes.En raison de leur surface glycoprotéique, les œufs colleront au verre. Ensuite, retirez l’eau avec les vers avec précaution pour éviter de déranger les œufs collés au plat. Ensuite, remettez rapidement 3 millilitres d’eau dans le plat pour éviter que les œufs ne se dessèchent.Répétez ce processus de nettoyage des œufs au moins trois fois, pour éliminer toutes les larves et les adultes et obtenir les œufs purs. À la collection d’œufs purs lavés, ajoutez cinq millilitres d’eau et procédez au développement des œufs dans l’obscurité à 25 degrés Celsius. 24 heures après le début de la culture d’œufs, prélevez les larves J2 écloses.Transférez soigneusement les larves de J2 dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez la collection à 3 000 G pendant deux minutes. Aspérez la couche supérieure d’eau et rajoutez 200 microlitres d’eau.Ensuite, cultivez les larves J2 sur une plaque PDA préparée avec un tapis de champignons. Après 52 heures, la plupart des larves J2 se seront développées en larves J4 à un stade précoce. Assemblez un entonnoir Baermann et extrayez les nématodes des cultures fongiques pendant deux heures, comme décrit précédemment.Pendant ce temps, préparez une aiguille pour cueillir les vers. Prélevez une pointe d’un capillaire en verre chauffé sur un brûleur à alcool. La pointe doit avoir un diamètre d’environ 50 microns, soit à peu près la largeur du corps d’un nématode adulte.Après deux heures, transférez les larves de J4 dans une boîte de Pétri propre comme décrit précédemment. Maintenant, sexez les nématodes au microscope stéréoscopique. Environ les deux tiers des larves sont généralement des femelles.La vulve de la femelle est évidemment différente de l’anatomie de la femelle, mais comme les vers sont très actifs, le sexage demandera de la pratique. L’étape la plus critique de ce protocole consiste à distinguer et à séparer précisément les mâles des femelles au début du premier stade. Sinon, il y aura du mélange et du mauvais, une fois qu’ils seront adultes.Et cela rend difficile l’observation de l’accouplement. Progressivement, cueillez et transférez les vers dans une goutte d’eau sur une lame pour mâles ou femelles. Pour assurer le succès, deux personnes différentes doivent vérifier l’attribution du sexe.Maintenant, transférez la goutte d’eau contenant les vers sexés dans la plaque de culture fongique appropriée. Ensuite, cultivez les vierges pendant encore 24 heures avant d’étudier leur comportement d’accouplement. Pour observer le comportement d’accouplement des nématodes du pin, préparez d’abord plusieurs lames concaves en ajoutant 200 microlitres d’eau dans chacun de leurs puits.Ensuite, choisissez un seul adulte vierge préparé et transférez-le sur une lame préparée. Gardez les adultes vierges à l’intérieur du puits pendant une heure pour leur permettre de s’adapter au nouvel environnement aqueux. Au bout d’une heure, ajoutez un seul adulte vierge du sexe opposé dans le puits, à l’aide d’une pipette.Ensuite, observez le comportement d’accouplement au microscope stéréoscopique et filmez le comportement pour une analyse quantitative. L’ensemble du processus d’accouplement se termine généralement en deux heures. Toutes les 30 minutes, ajoutez 50 microlitres d’eau pour compenser l’évaporation.Pour étudier le choix de l’accouplement et la compétition intersexuelle, regroupez et observez des nématodes vierges de deux combinaisons différentes. Le taux de réussite de l’accouplement des adultes vierges était d’environ 87 %, ce qui était beaucoup plus élevé que celui des adultes sélectionnés au hasard. Les couples ont mis en moyenne 83 minutes pour terminer l’ensemble du processus d’accouplement, qui contient quatre phases différentes.Chercher, contacter, copuler et s’attarder. Au cours de ces phases, de nombreux modèles de comportement spécifiques peuvent être observés. Lorsqu’une femelle rencontrait plusieurs mâles, le choix de l’accouplement était évident.La femelle utilise généralement sa tête pour entrer en contact avec un mâle, généralement au niveau de la tête, du corps, de la queue et de la région génitale. La femelle s’est ensuite accouplée avec le mâle, ou l’a quitté rapidement, et a nagé vers un autre mâle. Les taux de réussite de l’accouplement ont été mesurés après le premier contact pour les différentes combinaisons de nématodes.Il y avait aussi de la compétition intersexuelle. Lorsqu’une femelle vierge a été mélangée à trois mâles vierges, les mâles ont essayé d’approcher et de contacter la femelle autant que possible, pour avoir la chance de s’accoupler avec elle. Lorsque la vulve était occupée, les autres mâles essayaient de perturber le processus d’accouplement en utilisant de violents mouvements corporels ou en les traînant pour les séparer.La compétition intersexuée féminine était plus ou moins similaire à la compétition intersexuée masculine. En raison de la compétition intersexuelle, les fréquences de copulation avec les différentes combinaisons étaient significativement différentes. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à l’exploration de l’écologie comportementale chez les nématodes.Une fois maîtrisée, cette procédure peut être complétée en 12 jours, si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de séparer précisément les mâles des femelles, les juvéniles au premier stade pour obtenir des adultes vierges.

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