Observation et Quantification de Mating Comportement dans le nématode, Bursaphelenchus xylophilus

L’objectif global de cette procédure est d’observer le comportement d’accouplement du nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus. Cette méthode peut aider à faire progresser les études psychologiques du nématode. Il s’agit spécifiquement de l’observation du comportement d’accouplement du nématode du pin.

Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible d’obtenir des adultes vierges, ce qui facilite grandement l’observation du comportement d’accouplement des adultes. Les implications de cette technique s’étendent uniquement à l’étude plus large des nématodes, car ils ont des comportements similaires aux cycles de vie. Car la démonstration de cette méthode est essentielle, car l’acquisition de nématodes adultes vierges est difficile car les contraintes des nématodes en développement nécessitent de la pratique et il n’est pas facile de distinguer précisément les mâles des femelles chez les juvéniles au premier stade.

Pour cultiver des nématodes du pin, préparez d’abord des plaques de gélose au dextrose de pomme de terre. Pour inoculer une plaque, perforez un morceau de tapis fongique d’un diamètre de 10 millimètres à partir d’un tapis betritus senaria, et placez-le au milieu d’une nouvelle plaque PDA. Cultivez le tapis fongique pendant cinq jours à 25 degrés Celsius dans l’obscurité.

Après cinq jours, ajoutez les nématodes du pin dans la boîte de Pétri préparée et cultivez-les pendant trois jours à 25 degrés Celsius dans l’obscurité. Pour isoler les nématodes du champignon, préparez d’abord un outil de collecte. Placez un tube en caoutchouc serré sous un entonnoir et tenez l’entonnoir préparé dans une grille pour assembler l’appareil d’entonnoir Baermann.

Ensuite, placez deux couches de papier filtre au lieu de gaze dans l’embouchure de l’entonnoir. Maintenant, transférez les cultures fongiques dans la configuration de l’entonnoir et ajoutez de l’eau jusqu’à ce que le tapis fongique soit immergé. Au bout de deux heures, les nématodes sortiront de la culture fongique, traverseront le papier filtre et s’installeront dans la partie la plus basse de l’entonnoir Baermann.

Récupérez les nématodes en plaçant un tube de 15 millilitres sous l’entonnoir, puis en relâchant lentement la pince pour recueillir quelques gouttes d’eau, qui contiendront les nématodes. Centrifuger les collections de nématodes à 3 000 G pendant deux minutes à température ambiante. Ensuite, asparez le niveau supérieur de l’eau et remettez les vers en suspension dans un millilitre d’eau.

Transférez la suspension des nématodes dans un plat en verre de six centimètres et ajoutez trois millilitres d’eau pour aider les nématodes à nager librement. Maintenant, collectez des œufs pour faire des bouillons vierges. Transférez le plat dans un incubateur sombre et laissez les femelles enceintes pondre des œufs pendant 10 minutes.

En raison de leur surface glycoprotéique, les œufs colleront au verre. Ensuite, retirez l’eau avec les vers avec précaution pour éviter de déranger les œufs collés au plat. Ensuite, remettez rapidement 3 millilitres d’eau dans le plat pour éviter que les œufs ne se dessèchent.

Répétez ce processus de nettoyage des œufs au moins trois fois, pour éliminer toutes les larves et les adultes et obtenir les œufs purs. À la collection d’œufs purs lavés, ajoutez cinq millilitres d’eau et procédez au développement des œufs dans l’obscurité à 25 degrés Celsius. 24 heures après le début de la culture d’œufs, prélevez les larves J2 écloses.

Transférez soigneusement les larves de J2 dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez la collection à 3 000 G pendant deux minutes. Aspérez la couche supérieure d’eau et rajoutez 200 microlitres d’eau.

Ensuite, cultivez les larves J2 sur une plaque PDA préparée avec un tapis de champignons. Après 52 heures, la plupart des larves J2 se seront développées en larves J4 à un stade précoce. Assemblez un entonnoir Baermann et extrayez les nématodes des cultures fongiques pendant deux heures, comme décrit précédemment.

Pendant ce temps, préparez une aiguille pour cueillir les vers. Prélevez une pointe d’un capillaire en verre chauffé sur un brûleur à alcool. La pointe doit avoir un diamètre d’environ 50 microns, soit à peu près la largeur du corps d’un nématode adulte.

Après deux heures, transférez les larves de J4 dans une boîte de Pétri propre comme décrit précédemment. Maintenant, sexez les nématodes au microscope stéréoscopique. Environ les deux tiers des larves sont généralement des femelles.

La vulve de la femelle est évidemment différente de l’anatomie de la femelle, mais comme les vers sont très actifs, le sexage demandera de la pratique. L’étape la plus critique de ce protocole consiste à distinguer et à séparer précisément les mâles des femelles au début du premier stade. Sinon, il y aura du mélange et du mauvais, une fois qu’ils seront adultes.

Et cela rend difficile l’observation de l’accouplement. Progressivement, cueillez et transférez les vers dans une goutte d’eau sur une lame pour mâles ou femelles. Pour assurer le succès, deux personnes différentes doivent vérifier l’attribution du sexe.

Maintenant, transférez la goutte d’eau contenant les vers sexés dans la plaque de culture fongique appropriée. Ensuite, cultivez les vierges pendant encore 24 heures avant d’étudier leur comportement d’accouplement. Pour observer le comportement d’accouplement des nématodes du pin, préparez d’abord plusieurs lames concaves en ajoutant 200 microlitres d’eau dans chacun de leurs puits.

Ensuite, choisissez un seul adulte vierge préparé et transférez-le sur une lame préparée. Gardez les adultes vierges à l’intérieur du puits pendant une heure pour leur permettre de s’adapter au nouvel environnement aqueux. Au bout d’une heure, ajoutez un seul adulte vierge du sexe opposé dans le puits, à l’aide d’une pipette.

Ensuite, observez le comportement d’accouplement au microscope stéréoscopique et filmez le comportement pour une analyse quantitative. L’ensemble du processus d’accouplement se termine généralement en deux heures. Toutes les 30 minutes, ajoutez 50 microlitres d’eau pour compenser l’évaporation.

Pour étudier le choix de l’accouplement et la compétition intersexuelle, regroupez et observez des nématodes vierges de deux combinaisons différentes. Le taux de réussite de l’accouplement des adultes vierges était d’environ 87 %, ce qui était beaucoup plus élevé que celui des adultes sélectionnés au hasard. Les couples ont mis en moyenne 83 minutes pour terminer l’ensemble du processus d’accouplement, qui contient quatre phases différentes.

Chercher, contacter, copuler et s’attarder. Au cours de ces phases, de nombreux modèles de comportement spécifiques peuvent être observés. Lorsqu’une femelle rencontrait plusieurs mâles, le choix de l’accouplement était évident.

La femelle utilise généralement sa tête pour entrer en contact avec un mâle, généralement au niveau de la tête, du corps, de la queue et de la région génitale. La femelle s’est ensuite accouplée avec le mâle, ou l’a quitté rapidement, et a nagé vers un autre mâle. Les taux de réussite de l’accouplement ont été mesurés après le premier contact pour les différentes combinaisons de nématodes.

Il y avait aussi de la compétition intersexuelle. Lorsqu’une femelle vierge a été mélangée à trois mâles vierges, les mâles ont essayé d’approcher et de contacter la femelle autant que possible, pour avoir la chance de s’accoupler avec elle. Lorsque la vulve était occupée, les autres mâles essayaient de perturber le processus d’accouplement en utilisant de violents mouvements corporels ou en les traînant pour les séparer.

La compétition intersexuée féminine était plus ou moins similaire à la compétition intersexuée masculine. En raison de la compétition intersexuelle, les fréquences de copulation avec les différentes combinaisons étaient significativement différentes. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à l’exploration de l’écologie comportementale chez les nématodes.

Une fois maîtrisée, cette procédure peut être complétée en 12 jours, si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de séparer précisément les mâles des femelles, les juvéniles au premier stade pour obtenir des adultes vierges.