Dosage Comportements Alimentation prédatrices dans Pristionchus Et d'autres nematodes

L’objectif global de ces procédures est d’analyser de manière fiable les comportements alimentaires complexes des nématodes prédateurs en utilisant plusieurs nouveaux essais. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie comportementale, telles que la régulation de nouveaux comportements complexes et, en fait, l’évolution. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles fournissent des méthodes rapides et facilement répétées, afin d’observer et de quantifier les comportements alimentaires prédateurs chez les nématodes, y compris l’organisme modèle satellite, Pristionchus pacificus.

Afin de visualiser les morphologies buccales des nématodes, immobilisez d’abord les vers avec un traitement anesthésique doux sur un tampon d’agarose à 2 % fraîchement préparé. Pour faire un tampon, ajoutez soigneusement 10 microlitres d’une solution d’azoture de sodium à 10 % à trois millilitres d’agarose fondue et mélangez soigneusement. L’azoture de sodium est réactif et toxique, alors prenez les précautions appropriées.

Ensuite, déposez au moins 300 microlitres du mélange au milieu d’une lame de microscope en verre standard et utilisez une autre lame pour aplatir l’agarose. Laissez la glissière supérieure en position jusqu’à ce que le tampon soit sur le point d’être utilisé. Pour préparer le tampon à l’utilisation, retirez la glissière supérieure et ajoutez une goutte de M9. Ensuite, choisissez deux ou trois vers, placez-les dans la goutte et appliquez soigneusement une lamelle.

Observez les vers avec des optiques Nomarski 63x pour catégoriser leurs identités de morphe. Une dent dorsale élargie, une dent sous-ventrale supplémentaire ou une large ouverture buccale élargie sont toutes des caractéristiques d’un animal eurystomateux. Alors qu’une seule dent dorsale et une ouverture buccale plus étroite indiquent un animal sténostomateux.

Dans les cinq minutes, retirez les nématodes du tampon anesthésique. Faites glisser doucement la lamelle et transférez-les sur une assiette MGM neuve. Attendez qu’ils montrent un comportement mobile avant toute analyse plus approfondie.

Avec plus d’expérience, le morph peut être testé sans traitement anesthésique. Transférez 10 à 20 nématodes d’une plaque de culture standard sur une plaque fraîche ensemencée d’une pelouse bactérienne d’OP50 pour un phénotypage rapide de la forme buccale à l’aide d’un stéréomicroscope à fort grossissement. Détectez ensuite les différences de taille et de largeur de la bouche.

À ce grossissement, aucune structure semblable à une dent n’est observable, alors identifiez les morphes buccaux en fonction de leur largeur. Distinguez ainsi les bouches larges des bouches étroites. Préparez les plaques d’essai en cultivant une grande quantité de larves de nématodes de proie sélectionnées, telles que le stade larvaire C. elegans, ou une proie appropriée et pertinente sur le plan écologique.

Affamez quatre plaques ou plus de l’espèce de proie pour recueillir les larves L1. Plus tard, lavez les plaques avec du M9 et passez la collection à travers deux filtres de 20 microns. Seules les petites larves doivent rester dans la solution.

Granulez les larves à 377 g pendant une minute. Retirer le surnageant M9 dans un bécher à déchets et prélever une aliquote de trois microlitres de granulés de vers de terre purs. Déposez les vers au centre d’une plaque MGM de six centimètres sans E.coli et laissez-les s’étaler pendant environ une demi-heure.

Plus tard, utilisez les larves pour le test de morsure. Transférez les prédateurs sur la plaque de test avec le moins de bactéries OP50 possible. Pour P. pacificus, ajoutez cinq prédateurs à l’assiette.

Attendez 15 minutes pour permettre aux animaux transférés de se remettre du stress. Après 15 minutes, les vers devraient se déplacer normalement ou ils ont peut-être été endommagés. Observez et enregistrez maintenant les événements distincts de l’un des prédateurs pendant 10 minutes.

La morsure se caractérise par le fait que le prédateur limite le mouvement de la proie. La mise à mort se produit lorsque la cuticule de la proie est ouverte. L’alimentation se caractérise par une consommation observable des entrailles des proies.

Observez au moins 10 nématodes prédateurs individuels pour assurer la précision. Le pompage pharyngé et le mouvement des dents peuvent être observés sous l’optique Nomarski à un grossissement de 40 à 63x et enregistrés avec une caméra à grande vitesse à 50 hertz. Après avoir enregistré des clips de 15 secondes d’au moins 20 animaux, les vidéos peuvent être analysées de manière fiable.

Le pompage est observé dans le corpus, situé au milieu du pharynx. Le mouvement des dents est détectable dans l’ouverture de la bouche et n’est observé qu’à partir de la dent dorsale. Après deux heures de prédation, examinez la plaque pour détecter les cadavres vides.

Identifiez les cadavres par leur absence de motilité et des défauts morphologiques évidents, notamment des entrailles qui fuient ou des fragments de vers manquants. Après l’identification réussie de la forme buccale appropriée chez P. pacificus, des différences claires entre les animaux eurystomateux et sténostomateux ont été observées. Seuls les animaux eurystomateux se livraient à un comportement de mise à mort.

De plus, les différences dans l’activité dentaire et le pompage pharyngé des animaux eurystamateux sur les bactéries et les proies sont également évidentes. Lors de l’alimentation des prédateurs, le taux de pompage est réduit en dessous de celui observé lors de l’alimentation bactérienne et le mouvement des dents est égal avec le pompage du pharynx. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de combiner ces différents tests afin de caractériser des comportements alimentaires prédateurs complexes chez les nématodes, y compris dans l’organisme modèle satellite Pristionchus pacificus.