Caractérisation de calcification Events Utilisation en direct optiques et Electron Microscopy Techniques dans un tubeworm Marine

L’objectif global de cette procédure est de déterminer l’emplacement et la structure de l’événement de calcification en effectuant une combinaison de méthodes de microscopie optique et électronique. Ceci est accompli en surveillant le ver tubaire larvaire vivant pendant la métamorphose, l’étape de vie responsable de la calcification qui peut être détectée à l’aide d’indicateurs fluorescents sensibles aux signaux de pH et de calcium intracellulaires. L’imagerie du pH intracellulaire nous permet d’étudier la concentration de protons dans et hors du cytoplasme dans le processus de calcification.

Pour commencer, l’imagerie du pH intracellulaire chez les larves de vers tubicoles marins, les larves nageuses compétentes sont colorées avec le colorant indicateur de pH intracellulaire, SNARF-1 AM. Les larves sont ensuite transférées dans une boîte d’IBMX contenant de l’eau de mer avec une fine fenêtre d’observation en verre et placées sur un microscope fluorescent, où elles sont frappées par la lumière à 488 nanomètres de longueur d’onde, qui est absorbée par le colorant. Les émissions de 580 nanomètres et 640 nanomètres du colorant sont collectées. Les valeurs du pH intracellulaire peuvent être calculées à partir des rapports de ces valeurs.

La microscopie optique nous permet d’identifier le temps et la région tissulaire associés à un niveau de pH plus élevé. Il s’agit de la première étape pour déterminer les points temporels d’intérêt pour une analyse plus approfondie. Dans un deuxième temps, conservez le ver tubulaire avec des fixateurs aux points temporels pertinents pour la microscopie électronique.

Un stade de vie nouvellement minéralisant est identifié à l’aide de la cartographie MEB-EDS pour le signal calcique. Ensuite, les régions avec un signal calcique élevé sont criblées à l’aide de MEB/EBSD, identifiant la présence de minéraux cristallins. Enfin, à l’aide d’un faisceau d’ions focalisés, le minéral est découpé, une section mince est préparée pour l’observation TEM.

Cette section est utilisée pour obtenir un motif de diffraction de zone sélectif. Le principal avantage de cette technique ou d’une méthode de test conventionnelle comme la spectroscopie de diffraction des rayons X en vrac est qu’elle permet d’observer directement des structures spécifiques qui ont été observées par des méthodes de microscopie optique et électronique, par conséquent, les événements de calcification discrets peuvent être étudiés directement aux niveaux temporel et spatial. Lorsque la calcification est étudiée à l’aide d’indicateurs de calcium et de pH intracellulaires, nous pouvons identifier l’échelle de temps de ces événements physiologiques pertinents.

Il est essentiel de conserver l’échantillon au bon moment pour une analyse MEB fructueuse. Lors de la recherche du premier événement de calcification biologique, le MEB/EDX peut être utilisé pour dépister la distribution élémentaire du calcium. Un emplacement qui a plus de calcium peut indiquer la présence de carbonate de calcium, cependant, seule la présence d’un motif de diffraction des rayons X peut confirmer qu’il existe une structure cristalline.

Cette information peut être obtenue à l’aide de la DESC et de la TEM. La diffraction par rétrodiffusion d’électrons est une technique de caractérisation cristallographique permettant d’identifier un matériau cristallin ou polycristallin, à condition que la microstructure et l’angle REM des électrons satisfassent à la condition de diffraction de Bragg. En règle générale, les électrons rétrodiffusés sont collectés à un angle d’inclinaison de 70 degrés sur un échantillon poli avec des cartes d’orientation de grain ou de cristal.

Pour un échantillon non poli, il est difficile de générer une telle carte à partir de ces surfaces inégales, car toutes les séries de services ne satisfont pas aux exigences d’angle EBSD. Cependant, sous la forme d’un point IG, un motif de diffraction de Cacucci peut toujours être collecté à partir de ces surfaces inégales tant que l’exigence d’angle EBSD est satisfaite. Le motif de diffraction de Cacucci fournit une confirmation sans ambiguïté que le minéral cristallin est présent.

Notre méthode est directe et rapide, et peut être impliquée à d’autres tissus minéralisants. Ici, un faisceau d’ions focalisés est utilisé pour fabriquer un microéchantillon, ce qui est également une méthode très directe de préparation d’une section MET. Pour examiner le processus de métamorphose, des vers tubicoles ont été cultivés en laboratoire pendant environ cinq jours.

Les larves compétentes nageront vers l’avant au lieu d’un mouvement circulaire. Cela signifie qu’ils sont prêts pour la métamorphose. Incuber les larves compétentes dans la solution fluorescente dans l’eau de mer, couvrir les récipients d’une feuille d’aluminium pour éviter le photoblanchiment et incuber les animaux pendant la nuit.

Les larves de vers tubicoles sont lavées contre le treillis de nylon qui retiendra les larves mais permettra à la solution de passer à travers. Lavez les larves avec de l’eau de mer filtrée deux fois pour éliminer l’excès de solution colorante. Appuyez la passoire sur la boîte de Pétri pour créer un joint étanche avant de relâcher le joint pour jeter la solution de lavage.

Veillez à ne pas dessécher les larves. Placez ensuite chacune des 10 à 20 larves dans un plat mince à fond de verre avec de l’IBMX et couvrez le plat jusqu’à l’imagerie. Ensuite, insérez les cubes de filtre appropriés avec les miroirs dichroïques appropriés pour détecter les signaux fluorescents.

Optimisez le temps d’obturation pour être suffisamment rapide pour capturer des images pour un organisme vivant. Ensuite, sélectionnez les paramètres de coupe optique sur l’option Z-Stack, déplacez la platine microscopique vers le haut et vers le bas pour définir la position de début et de fin de l’acquisition de l’image. Définissez une distance d’un micromètre entre les couches.

Après l’imagerie, exportez toutes les données sous forme de fichiers TIF en niveaux de gris. Pour ce faire, sélectionnez Fichier, Exporter. Assurez-vous que les types de fichiers s’affichent sous forme d’images TIF, puis cliquez sur Démarrer.

L’image en niveaux de gris dans chaque couche, dans chaque couche de Z-Stack sera dans le même dossier d’image, prête pour l’analyse d’image. Enfin, générez une image composite pour chacun des canaux fluorescents, à l’aide d’ImageJ. Les vidéos JoVE suivantes montrent comment effectuer l’étalonnage et les mesures du pH intracellulaire.

Conserver les vers tubicoles en cours de métamorphose à l’aide d’un fixateur de réticulation, en utilisant une solution de 4 % de paraformaldéhyde dans de l’eau de mer. Il suffit de mélanger une partie de paraformaldéhyde à 16 % dans trois parties d’eau de mer et de laisser la fixation se faire pendant la nuit. Jetez le fixateur primaire et refixez l’échantillon pendant 30 minutes dans une solution aqueuse de tétraoxyde d’osmium à 1 % pour stabiliser davantage les structures tissulaires.

Assurez-vous de travailler dans une hotte et d’avoir des bouteilles de déchets séparées qui sont clairement étiquetées, préparez des formaldéhydes et du tétraoxyde d’osmium. Ensuite, déshydratez les échantillons à l’aide d’une série d’éthanol gradué, en laissant cinq minutes entre les changements. L’étape suivante consiste à déshydrater les échantillons avec une solution 1:1 d’éthanol et de HMDS, juste assez pour couvrir l’échantillon.

Attendez que l’échantillon s’évapore à sec dans la hotte, puis répétez la procédure avec des HMDS purs. Pour créer une fracture contrôlée de l’échantillon, passez la lame diamantée contre la boîte, en enfermant quelques individus pour faire une coupe triangulaire. Avec la boîte de Pétri couverte, placez la boîte de culture contre un bout d’aluminium, appuyez doucement pour faire une fracture contrôlée.

Observez à l’aide d’un microscope de dissection et prélevez soigneusement un morceau de fracture qui contient quelques vers tubulaires intacts. Avec de la peinture argentée, collez l’échantillon sur le porte-échantillon MEB, peignez les bords avec de la peinture argentée pour réduire la charge. L’échantillon est maintenant prêt à être imagé pour l’analyse MEB-EDS.

Insérez l’échantillon dans le support dans le microscope. Orientez l’échantillon et placez-le sous la colonne d’électrons. Analysez l’échantillon en mode VP SEM.

Optimisez la concentration et l’astigmatisme si nécessaire. Sélectionnez le grossissement de sorte qu’un seul organisme remplisse tout le champ de vision. Analysez la distribution élémentaire du calcium sur l’échantillon en acquérant une carte de l’ensemble du champ de vision, faites fonctionner la carte pendant 15 minutes ou plus ou jusqu’à ce que les données montrent une localisation distincte du calcium dans l’organisme.

Pour obtenir la quantification ponctuelle d’une région d’intérêt, sélectionnez l’option ID de point à l’aide de l’outil Point unique. Cliquez sur la zone d’intérêt pour effectuer une analyse. Enregistrez soigneusement l’emplacement en capturant une série d’images avec des grossissements décroissants.

Pour préparer les échantillons pour l’EBSD, retirez l’échantillon du support MEB plat et collez-le sur un talon pré-incliné à 45 degrés à l’aide de peinture argentée. À l’aide du MEB de référence, les images localisent l’animal d’intérêt et la région exacte de l’animal à examiner. Inclinez la platine de 25 degrés de sorte que la surface de l’échantillon soit maintenant à environ 70 degrés par rapport au faisceau d’électrons.

Élevez la scène. Sélectionnez le mode EBSD dans le logiciel AZtec. Choisissez l’aragonite comme phases d’intérêt.

Insérez la caméra EBSD, réglez les conditions de la caméra pour obtenir un signal d’environ 90 %À l’aide d’un raster de faisceau rapide, acquérez un arrière-plan, puis capturez une image en aztèque. À l’aide de l’outil d’analyse ponctuelle, cliquez sur l’emplacement de l’échantillon qui a montré un signal calcique plus élevé. Scannez pour voir si les motifs Cacucci sont détectés.

Si des motifs sont présents et correspondent à l’une des phases sélectionnées dans la base de données, ils seront automatiquement indexés. Protégez l’échantillon MEB préparé avec une couche de platine par pulvérisation cathodique avant de procéder à la préparation du microéchantillon à l’aide d’un faisceau d’ions focalisés. Insérez l’échantillon dans la chambre MEB FIB, positionnez-le et acquérez une image électronique secondaire en direct, induite par des ions.

Localisez la zone d’intérêt à partir des images référencées comme précédemment déterminé par la cartographie EDS dans EBSD. Tournez la platine si nécessaire pour aligner les éléments d’intérêt avec le cadre de la fenêtre, ajustez le grossissement pour afficher la zone afin d’accueillir les éléments d’intérêt, puis définissez une boîte pour déposer du carbone et du tungstène. Capturez un instantané FIB, puis tracez un motif de quatre cases autour du capuchon en tungstène pour définir l’emplacement du micro-échantillonnage.

Ensuite, inclinez la platine à 58 degrés et coupez le bas du microéchantillon. Inclinez la platine à zéro, insérez la sonde de micro-échantillonnage en tungstène, puis abaissez-la jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec l’échantillon. Connectez la sonde en tungstène et l’échantillon en déposant du tungstène entre la pointe de la sonde et le revêtement en tungstène, puis effectuez la coupe finale, détachez le microéchantillon du reste de l’îlot et soulevez la sonde avec le microéchantillon attaché.

Placez une demi-grille en cuivre TEM dans un support d’entrée latéral, abaissez la sonde en tungstène jusqu’à ce que le microéchantillon entre en contact avec la grille TEM. Le microéchantillon est ensuite broyé jusqu’à ce qu’il devienne transparent aux électrons. Avant l’analyse TEM, remplissez les deux dewars avec de l’azote liquide et réglez la tension d’accélération à 300 kilovolts.

Placez la demi-grille avec les lamelles attachées dans le support TEM standard. Centrez le faisceau sur l’écran au phosphore, contractez et élargissez le faisceau et assurez-vous que tout mouvement du faisceau est concentrique. Utilisez les boutons de mouvement de la platine pour naviguer et localiser l’échantillon, augmenter le grossissement de l’échantillon et ajuster la hauteur Z jusqu’à ce que l’échantillon soit net.

Utilisez les oculaires optiques si nécessaire. Insérez l’appareil photo et retirez l’écran au phosphore. Élargissez le faisceau si nécessaire pour éviter de sursaturer l’appareil photo.

Ajustez la mise au point et les paramètres de l’appareil photo pour capturer une image. Pour acquérir un motif de diffraction, centrez l’élément d’intérêt, supprimez l’ouverture de l’objectif et insérez l’ouverture de diffraction. Passez en mode Objectif de diffraction.

Insérez l’obturateur pour éviter que le centre du motif de diffraction ne brûle l’appareil photo ou l’écran au phosphore. Capturez une image du motif pour l’analyse cristallographique. Voici quelques observations du processus de calcification au cours de la métamorphose du ver tubulaire.

Les valeurs de pH des vers tubicoles ont augmenté après que la stimulation IBMX de la métamorphose et le pH intracellulaire a commencé à augmenter au-delà de huit après 31 heures. Le tissu pertinent pour la calcification est la région du collier. Une carte sur les signaux MEB-EDS montre que le premier jour du ver tubicole avait une distribution homogène du calcium, indiquant que le processus de calcification n’avait pas encore commencé.

Deux jours après la stimulation de la métamorphose, certains vers tubicoles s’étaient déjà trop calcifiés et ne sont plus adaptés à l’observation des matériaux nouvellement calcifiés. Dans un spécimen de ver tubicole, comme celui utilisé dans cet exemple, la calcification en est encore à ses débuts, de sorte que la quantification du calcium a permis de déterminer l’emplacement d’intérêt pour caractériser la présence de minéraux. Lorsqu’elle a été examinée à l’aide de SEM-EBSD, la zone localisée avec le fort signal calcique présentait également une structure cristalline d’aragonite.

À l’aide d’un faisceau d’ions focalisés, l’échantillon a été préparé pour le TEM et le motif de diffraction du minéral d’aragonite a été analysé avec plus de détails cristallographiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de localiser un événement de minéralisation dans un organisme multicellulaire. Lorsque la microscopie optique et la microscopie électronique sont utilisées ensemble, nous pouvons acquérir un grand niveau de compréhension physiologique et matérielle du processus de calcification.