Élaboration d’un protocole raffiné pour Trans-sclérale Transplantation sous-rétinienne des cellules épithéliales humaines pigmentaire dans les yeux de Rat

Injection sous-rétinienne a été largement appliquée dans les études précliniques de thérapie de remplacement de cellules souches pour la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Dans cet article visualisé, nous décrivons une technique d’injection sous-rétinienne moins risqués, reproductibles et précisément modifiés via l’approche trans-sclérale pour livrer des cellules dans les yeux de rat.

L’objectif général de cette vidéo est de présenter une technique d’injection sous-rétinienne transsclérale reproductible pour administrer des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines, ou cellules EPR, dans l’espace sous-rétinien des yeux de rongeurs avec un risque minimal de lésions de la rétine. Ceci est accompli en faisant d’abord une petite incision dans la conjonctive temporale postérieure au limbe pour exposer la sclère sous-jacente. Ensuite, une aiguille à insuline biseautée de calibre 31 est utilisée pour pénétrer le complexe du noyau de la sclérotique en insérant l’aiguille à 500 microns ou environ la moitié de la pointe dans le tissu avec le côté biseauté vers le haut pour créer un trou pilote.

Ensuite, une aiguille d’injection biseautée de calibre 33 attachée à une seringue est guidée dans le trou pilote et insérée à un angle et à une profondeur spécifiques, le trou d’injection se scelle automatiquement après que l’aiguille est rétractée et aucun point de couture ou colle tissulaire n’est nécessaire. Les rétinopathies dégénératives consistent en un large éventail de maladies impliquant différents types de cellules rétiniennes. Dans le monde entier, la maladie la plus courante, la dégénérescence maculaire liée à l’âge, ou DMLA, survient chez les personnes âgées et conduit à une cécité permanente.

Les changements pathologiques qui se produisent dans la DMLA impliquent une dégénérescence initiale des cellules épithéliales pigmentées rétiniennes, ou EPR. La perte d’EPR entraîne un dysfonctionnement ou la mort des récepteurs fluorés rétiniens. Les traitements pharmacologiques actuels de la DMLA à un stade précoce se limitent à ralentir la progression ou à soulager les symptômes.

Ceci, associé à un potentiel de régénération limité de la rétine, signifie qu’il n’existe aucun traitement efficace pour restaurer la vision. Le Neural Stem Cell Institute a récemment identifié une population de cellules souches adultes dans la population de cellules RPE. Ces cellules peuvent être utilisées comme source pour la thérapie de remplacement des cellules souches.

Actuellement, notre institut mène des études précliniques pour étudier l’efficacité et l’innocuité de la thérapie de transplantation de cellules souches EPR dans un modèle animal de rat dégénératif EPR. Dans cette étude, nous utilisons une technique d’injection transsclérale sous-rétinienne pour délivrer des cellules souches EPR dans les yeux de rat, entre les couches rétinienne et EPR. Notre méthode est un moyen facile et fiable d’administrer avec succès des cellules dans l’espace sous-rétinien.

Vous aurez besoin des réactifs et de l’équipement suivants. 1 % de tropicamide et 2,5 % de phényléphrine, fraîchement fabriqués à partir de 10 % de phényléphrine, en le diluant dans une solution saline stérile à 0,9 % le jour de l’opération, sont utilisés pour dilater la pupille. Le lavage oculaire est utilisé pour rincer l’œil et garder l’œil non opéré humide.

Un lubrifiant pour les yeux est utilisé pour garder l’œil droit non opéré humide pendant la chirurgie. 0,5 % de proparacaïne est utilisé comme anesthésique local. Un lubrifiant oculaire est utilisé sur l’œil gauche opéré lors de l’examen OCT.

Une quantité minimale de matériel et d’équipement est nécessaire pour cette technique. Des informations détaillées sur l’équipement et les réactifs utilisés dans cette technique sont décrites dans le protocole. Une seringue de 10 microlitres est utilisée pour injecter les cellules.

Avant l’injection, nous assemblons d’abord l’injecteur et le stérilisons à l’éthanol. Insérez une aiguille biseautée stérile de calibre 33 dans la seringue et vissez fermement pour assembler l’injecteur. Rincez l’injecteur avec de l’éthanol à 100 %, puis de l’éthanol à 70 %, puis de l’eau distillée déminéralisée, séquentiellement cinq à six fois chacune.

Marquez l’aiguille de l’injecteur avec un marqueur noir stérile à une position à 600 microns de la pointe de l’aiguille. Placez l’injecteur sur un micromanipulateur pour l’injection. Les cellules humaines de l’EPR sont préparées le jour de l’opération et conservées dans un mélange d’eau glacée.

Triturez doucement la suspension cellulaire et chargez l’injecteur avec 1,2 microlitre, le 0,2 microlitre supplémentaire est utilisé pour compenser le reflux d’injection, pour garantir un volume d’injection d’un microlitre. Remplacez l’injecteur rempli de la suspension cellulaire sur le micromanipulateur, ou demandez à un assistant de le tenir verticalement, car les cellules EPR ont tendance à s’enfoncer facilement dans les solutions. Préparez la zone chirurgicale stérile en plaçant un tampon chirurgical stérile avec un coussin chauffant en dessous sur la platine du microscope de dissection.

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de New York à Albany. Pesez l’animal et anesthésiez-le à l’aide du système de distribution de vapeur d’isoflurane comme illustré ici. Transférez le rat dans la zone chirurgicale une fois qu’il est anesthésié et placez-le dans un cône nasal relié au système isoflurane pour maintenir l’anesthésie.

Couvrez le corps du rat avec de la gaze et pincez l’orteil du rat pour confirmer l’anesthésie complète. Appliquez une goutte de lubrifiant pour les yeux sur l’œil droit du rat, positionnez le rat sur son côté droit, avec son œil gauche tourné vers le plafond pour l’injection, sa tête vers la main droite du chirurgien et son dos vers le chirurgien. Coupez les moustaches qui couvrent l’œil.

Versez une petite quantité de douche oculaire pour la face temporale de l’œil gauche et récupérez l’excédent du côté nasal avec un applicateur en coton pour rincer l’œil. Dilater la pupille avec 1 % de tropicamide, 2,5 % de phényléphrine, pour une tomographie par cohérence optique post-injection, ou examen OCT, en appliquant une goutte de chaque. Appliquez une goutte de douche oculaire pour garder l’œil humide.

Appliquez une goutte de Proparacaïne sur l’œil et retirez l’excédent à l’aide d’un applicateur en coton. Massez doucement la peau entourant l’œil quatre à six fois pour ouvrir la paupière, de sorte que l’œil sorte temporairement et légèrement de son orbite pour permettre un accès facile à l’aiguille de l’injecteur. Utilisez des forces pour saisir la conjonctive postérieure au limbe et tournez l’œil pour trouver un meilleur endroit pour la chirurgie sans endommager les muscles oculaires.

Soulevez doucement la conjonctive pour faire une tente et tournez l’œil nasalement. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper le haut de la tente, pour faire une petite ouverture dans la conjonctive et exposer la sclérotique. Ensuite, utilisez une pince pour saisir le bord de l’ouverture de la conjonctive à côté du limbe et faites pivoter l’œil nasalement, de sorte que l’axe pupillaire soit à un angle d’environ 30 degrés par rapport au sol.

Une aiguille à insuline stérile biseautée de calibre 31 est utilisée pour pénétrer le complexe du noyau de la sclérotique avec un biseau pointant vers le haut et la moitié de la pointe, soit environ 500 microns en s’insérant dans le tissu, pour créer un trou pilote pour l’injection. Retirez soigneusement l’aiguille d’insuline et un petit épanchement de sang peut être observé. Une lance à œil peut être appliquée pour dégager le trou et arrêter le saignement si nécessaire.

Guidez l’aiguille d’injection chargée de cellules RPE dans le trou pilote à un angle d’environ 10 à 15 degrés par rapport à la surface locale de la sclérotique pour atteindre l’espace sous-rétinien en insérant complètement l’aiguille d’une longueur de 500 microns dans le tissu et en laissant une distance de 100 micro entre le point de l’aiguille qui est recouvert par le tissu et la pointe du marqueur noir sur l’aiguille. Dites à l’assistant d’appuyer sur le piston de la seringue, pour injecter le volume approprié de cellules. Maintenez l’injecteur en place pendant 25 à 30 secondes après l’injection, puis rétractez lentement l’injecteur.

Le trou d’injection se ferme automatiquement, et une petite quantité d’environ 0,2 microlitre de refoulement est couramment observée. Rincez trois fois le site d’injection avec un collyre stérile et récupérez l’excédent avec un applicateur en coton. Appliquez une goutte de lubrifiant sur l’œil opéré et transférez le rat à la station OCT, pour examiner l’emplacement des cellules transplantées et la taille de la bulle sous-rétinienne.

Remettez le rat dans la cage de récupération sous une lampe chauffante pour maintenir sa température corporelle une fois l’OCT terminé. Observez le rat pour vous assurer qu’il sort de l’anesthésie et surveillez quotidiennement tout signe de détresse. Informez immédiatement le vétérinaire s’il y a des préoccupations.

En utilisant notre technique, nous avons systématiquement et avec succès introduit des cellules RPE humaines dans l’espace sous-rétinien. Immédiatement après la transplantation, nous avons effectué un examen OCT pour observer le site d’injection et la bulle sous-rétinienne créée par les cellules transplantées. Il s’agit d’un bon outil de dépistage pour évaluer la qualité des injections et le degré de lésion rétinienne, ou hémorragie.

Une réflexion lumineuse brillante autour du site d’injection et une bulle sous-rétinienne remplie de suspension cellulaire ont pu être observées lors de la scintigraphie OCT. Il n’y a pas de saignement, de fuite de liquide interoculaire ou de décollement de la rétine, observé autour du site d’injection ou de l’espace intravitréen lors d’une injection réussie, ce qui démontre le traumatisme minime causé par l’injection. Les yeux de rat opérés ont été nucléés, fixés et sectionnés pour une analyse immunohistologique sept jours après la transplantation.

Le marqueur nucléaire humain, Hunu, et le marqueur de cellules RPE, OTX2, ont été utilisés pour détecter les cellules transplantées. Une déclaration positive des deux marqueurs a montré que les cellules RPE humaines transplantées étaient situées dans l’espace sous-rétinien des yeux de rat. Cette technique d’injection sous-rétinienne trans-sclérale est simple et facile à apprendre.

Il cause moins de traumatismes chirurgicaux et laisse la rétine intacte en faisant passer l’aiguille d’injection à travers les couches externes de la paroi de l’œil, sans briser la rétine neurale. Les gouttes quantifiées pour l’aiguille pilote et l’aiguille d’injection à pénétrer dans le tissu et l’angle utilisé lors de l’injection permettent d’administrer des cellules de manière fiable dans l’espace sous-rétinien avec une précision et un taux de réussite beaucoup plus élevés. Grâce à cette méthode d’injection, nous avons systématiquement et avec succès administré des cellules souches humaines dérivées de cellules souches EPR dans l’espace sous-rétinien de rats RCS.

Cette procédure peut être facilement répétée par toute personne qui regarde la vidéo.