Измерение Т-клетки с помощью визуализации аллореактивности проточной цитометрии

Общая цель этой процедуры заключается в измерении аллореактивности Т-клеток с помощью визуализационной проточной цитометрии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы трансплантационной иммунологии, например, какая доля Т-клеток реципиента реагирует на донорские аллоантигены. Этот метод сочетает в себе многопараметрические кванититативные возможности проточной цитометрии с возможностями визуализации флуоресцентной микроскопии, что позволяет проводить высокопроизводительное исследование отдельных синапсов клеток, представляющих антиген Т-клеток.

Демонстрировать процедуру будет Саджад Мошкельгоша, постдок из моей лаборатории. Начните с посева нуля целых пять десятых по 10 до шестой дендритной клетки. в каждую лунку 96-луночного планшета для культивирования клеток, за которым следует один раз от 10 до шестой Т-клеток, и конечный объем до 50 микролитров питательной среды в общей сложности на лунку.

Инкубируйте холодные культуры в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия и пяти процентах углекислого газа. Затем добавьте в каждую лунку в три раза больше объема культуры в одну целую пять процентов формальдегида в PBS на 30 минут при комнатной температуре. По окончании фиксации переложите клетки из каждой лунки в соответствующую пятимиллилитровую полистирольную трубку.

Окрашивайте клетки соответствующими флюорохромовыми конъюгированными антителами в 100 микролитрах промывочного буфера на 30 минут при комнатной температуре, защищенной от света. Затем промойте клетки в одном миллилитре буфера для промывки и повторно суспендируйте гранулы в буфере для завивки/промывки, содержащем фаллоидин ФИТК. Еще через 30 минут при комнатной температуре, защищенной от света, промойте клетки в одном миллилитре свежего буфера для химической завивки/промывки.

Ресуспендируйте гранулы в представляющем интерес ядерном красителе в буфере для химической завивки/промывки для окончательной 30-минутной инкубации при комнатной температуре, защищенной от света. Промойте ячейки в одном миллиметре буфера для химической завивки/промывки, а затем одну промывку только в буфере для промывки. Затем повторно суспендируйте клетки в 50-100 микролитрах свежего буфера для мытья.

Переложите ячейки в микроцентрифужные пробирки с маленькими крышками. Чтобы проанализировать межклеточные взаимодействия, сначала зарезервировайте один канал для получения изображений в светлом поле и загрузите первую контрольную трубку. Если канал светлого поля выключен, в окне рабочей области создайте новую диаграмму рассеяния для каждого используемого канала с соотношением сторон по области.

Добавьте синглеты, где соотношение сторон близко к единице. Для каждого флуорохрома проверьте положительное количество и при необходимости отрегулируйте напряжение лазера в коробке подсветки. В поле каналов выберите подходящие каналы для флуорохромов, используемых при окрашивании.

Затем нажмите кнопку «Запись». Когда количество событий достигнет заданного порога, сбор данных будет автоматически остановлен. После того, как все контрольные показатели одиночного окрашивания будут получены, загрузите первую пробирку для экспериментального образца и получите несколько десятков тысяч событий по соответствующим каналам анализа, включая канал светлого поля.

Чтобы создать матрицу компенсации, загрузите файлы данных для контроля одиночных пятен в мастер компенсации и выберите подходящие флуоресцентные каналы для эксперимента. Убедившись, что выбраны правильные положительные популяции, дважды щелкните значение в матрице и добавьте график в область анализа для каждого канала. Нажмите кнопку «Готово», чтобы сохранить матрицу компенсации в виде файла CTM.

Загрузите файл RIF в соответствующее программное обеспечение для анализа. Преобразуйте файл RIF в файл DAF для анализа данных. Откройте первый файл с примером.

Построение графика среднеквадратичного значения скорости изменения интенсивности изображения в светлопольном канале. Затем построите график зависимости соотношения сторон от площади антигенпрезентирующего клеточного маркера. Проглотите дублеты, содержащие одну антигенпрезентирующую клетку.

Постройте график соотношения сторон относительно площади маркера Т-клеток. Нанесите на дублеты, содержащие одну Т-клетку. Чтобы идентифицировать клетки, соприкасающиеся друг с другом, в меню анализа используйте опцию masks, чтобы открыть менеджер масок, и назовите новую маску Маска объекта Т-клетки.

Нажмите функциональную кнопку и в диалоговом окне выберите объект. Выберите канал, в котором обнаружен маркер Т-клеток, и нажмите OK. Таким же образом создают маску для антигенпрезентирующего клеточного маркера в соответствующем канале. Построить график интенсивности флуоресценции маркеров Т-клеток в маске антигенпрезентирующего объекта клетки в зависимости от интенсивности флуоресценции антигенпрезентирующих клеток в маске объекта Т-клетки.

Затем нарисуйте ворота, которые включают в себя только клетки, соприкасающиеся друг с другом. Наконец, вручную просмотрите изображения фаллоидина FITC событий внутри этих ворот, чтобы отличить зрелые иммунные синапсы от простых межклеточных контактов, используя функцию меток изображений для маркировки этих изображений. Здесь показан мембранный контактный гейт для CD4-положительных Т-клеток селезенки, полученных от переносимых и непереносимых реципиентов сердечных аллотрансплантатов B6 через семь дней после трансплантации и коинкубированных с дендритными клетками B6, полученных из костного мозга B6, как показано.

С синаптическими и несинаптическими событиями, обозначенными зеленым перекрестием. Бригфилд и анализ флуоресцентных каналов также позволяют визуализировать отдельные синаптические и несинаптические события. Действительно, синапсы как непереносимых, так и переносимых реципиентов CDA сердца B6 легко отличить от несинаптических контактов по наличию плотных FITC-положительных гребней на границе антигенпрезентирующих клеток Т-клеток.

После дальнейшего развития этот метод может быть применен в клинических условиях, таких как снижение или отмена иммуносупрессии или прогнозирование исхода трансплантата у реципиентов транспантов у человека.