Радиальная Мобильность и цитотоксическую функцию ретровирусных Репликация Векторный Трансдуцированные неприлипшие Alloresponsive Т-лимфоцитов

Общая цель следующего эксперимента — продемонстрировать миграцию неадгезивных эффекторных Т-лимфоцитов по монослою адгезивных опухолевых клеток. Для этого сначала создается монослой адгезивных опухолевых клеток в лунках предметных стекол с тефлоновой маской, покрытых поли-D-лизином, а на втором этапе флуоресцентно меченные эффекторные Т-лимфоциты осаждаются в центре монослоя с помощью манифольда для седиментации клеток. Затем с помощью световой и флуоресцентной микроскопии визуализируется миграция неадгезивных клеток по монослою.

Результаты показывают, что миграция и эффекторные функции неадгезивных Т-лимфоцитов в кокультуре с адгезивным монослоем опухолевых клеток сохраняются после трансдукции лимфоцитов ретровирусным вектором. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами является возможность измерения радиальной миграции неадгезивных эффекторных Т-лимфоцитов в кокультуре с адгезивными опухолевыми клетками. Это имеет важное значение для пациентов с первичными или метастатическими опухолями головного мозга, поскольку аллогенные цитотоксические Т-лимфоциты, модифицированные для экспрессии гена активатора пролекарства, такого как цитозин-дезаминаза, в настоящее время тестируются в рамках мультимодального подхода по элиминации опухолей в головном мозге.

Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями при создании адгезивных монослоев опухолевых клеток из-за гетерогенности их адгезивных свойств при росте. Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, так как этапы формирования равномерного монослоя опухолевых клеток и эффективного осаждения неадгезивных L-O-C-T-L требуют глубокого понимания характеристик обоих типов клеток. Для начала возьмите до четырех стерилизованных.

10 предметных стекол с тефлоновым покрытием и лунками в стерильной чашке Петри размером 150 мм на 15 мм. Рядом с предметными стеклами поместите чашку Петри размером 35 мм на 10 мм, содержащую от 2 до 3 мл стерильной воды, для обеспечения влажности. Затем подготовьте стекла, покрыв каждую лунку раствором поли-D-лизина или поли-L-лизина в концентрации 100 µg/mL.

Инкубируйте предметные стекла в течение одного часа при комнатной температуре, затем аспирируйте раствор и дважды промойте поверхность лунки PBS, подготовив лунки для образцов. Соберите конфлюэнтную культуру адгезивных опухолевых клеток из флакона. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью световой микроскопии, а затем суспендируйте клетки до концентрации 5 × 10⁶ клеток на мл.

В буферизированную ростовую среду добавьте от 5 до 10 µL клеточной суспензии в каждую лунку, в зависимости от типа опухолевых клеток, доведите объем в лунке до 40 µL средой и медленно пропипетируйте содержимое вверх-вниз для равномерного распределения клеток. После посева лунок дайте опухолевым клеткам осесть при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем закройте чашку Петри крышкой и осторожно перенесите ее в увлажненный инкубатор при 37 °C с 5% carbon dioxide; инкубируйте не менее 24 часов.

Ежедневно меняйте культуральную среду в лунках, осторожно удаляя часть среды из монослоя и заменяя ее большим объемом свежей полной среды для Т-клеток. Обычно клетки достигают конфлюэнтности в течение одного-трех дней, после чего они готовы к седиментации на монослой опухолевых клеток. Соберите неадгезивные Т-клетки и окрасьте их красителем для определения пролиферации клеток согласно протоколу производителя как минимум за один час до начала анализа.

Затем поместите увлажненную камеру с предметными стеклами, содержащими опухолевые клетки, в шкаф с биологической безопасностью. Промойте лунки с помощью PBS путем пипетирования, затем добавьте в лунки 45 µL полной среды с 10% сыворотки. Установите стерильный манифольд для седиментации клеток над лунками так, чтобы крючок на конце манифольда касался поверхности предметного стекла.

Убедитесь, что среда видна в каналах манифольда. Затем подсчитайте количество неадгезивных клеток и суспендируйте их в среде с концентрацией от 1 до 2 × 10⁵ клеток на µL.

Осторожно диспергируйте клетки, чтобы устранить любые клеточные агрегаты, которые могут помешать седиментации клеток. Медленно внесите с помощью пипетки 1 µL клеточной суспензии в канал коллектора для каждой лунки. Затем инкубируйте аппарат при комнатной температуре в течение 20–30 минут, чтобы клетки в канале осели на монослой.

После того как клетки осядут, аккуратно поднимите коллектор строго вертикально, не касаясь предметного стекла. Убедитесь, что клеточные осадки расположились внутри окружности канала коллектора. При наблюдении под микроскопом должно быть видно, что осевшие клетки слегка прикрепились к монослою, поэтому осторожное перемещение предметного стекла не приведет к рассеиванию осадка.

После подтверждения того, что клетки осели, перенесите предметное стекло на инвертированный микроскоп, оснащенный камерой с контролем влажности и уровня углекислого газа. Используйте объектив 4x для получения изображений клеток в светлом поле и в многоканальном флуоресцентном режиме. Снимите изображения выбранной области в светлом поле и флуоресцентных каналах, затем добавьте масштабные отрезки с помощью программного обеспечения для захвата изображений.

После получения всех временных точек храните предметное стекло в увлажненном инкубаторе в промежутках между измерениями. Перетащите файлы изображений в программу для редактирования изображений и выберите опцию добавления слоя, чтобы создать многослойный файл изображения. Объедините изображения, полученные в светлом поле и при флуоресценции, в один слой.

Используйте программное обеспечение для сбора данных, чтобы сделать снимки области размером 8 мм на 8 мм. В программе должна быть настроена функция автоматического сшивания полученных изображений с использованием канала, который наилучшим образом представлен по всей лунке. Если проводится визуализация только в флуоресцентных каналах, следует выбрать канал для визуализации адгезивных клеток.

В качестве альтернативы изображения можно объединить с помощью программного обеспечения для редактирования изображений. Это выполняется путем совмещения областей изображений, которые остаются неизменными при переходе от одного кадра к другому, и наложения изображений друг на друга до получения полной картины. Сшейте изображения вместе, используя данное программное обеспечение.

Используйте совмещенные изображения для создания карт интенсивности поверхностной флуоресценции в программе Image J, чтобы визуализировать агрегацию или распространение флуоресцентных Т-клеток с течением времени. Аллореактивные цитотоксические Т-лимфоциты человека (Allo CTL), трансдуцированные репликативно-компетентным ретровирусным вектором, кодирующим ген экспрессии изумрудно-зеленого флуоресцентного белка, были размещены в центре монослоя клеток глиомы. Спустя четыре часа все Allo CTL образовали видимые агрегаты к 24 часам.

В монослое адгезивных клеток появились пустые участки, что указывало на лизис опухолевых клеток; при этом некоторые аллогенные CTL мигрировали за пределы переднего края. Флуоресцентно меченые мышиные алло-CTL поместили в центр монослоя флуоресцентно меченых клеток глиомы; через один час алло-CTL тесно ассоциировались с клетками глиомы, а к 48 часам алло-CTL мигрировали от центра монослоя. На основе этих изображений с помощью программного обеспечения ImageJ были построены карты флуоресценции интенсивности поверхности, которые демонстрируют значительную миграцию от центра через 48 часов.

Для поддержания оптимальных условий культивирования важно ежедневно менять питательную среду в монослое опухолевых клеток. Кроме того, после освоения данной методики осаждение неадгезивных клеток должно занимать около 20 минут. Для изучения скорости миграции алло-CTL через монослой или времени их контакта с опухолевыми клетками при осуществлении цитотоксических функций могут быть использованы другие методы, такие как трекинг перемещения клеток.

Данный протокол поможет исследователям в области иммуногенной терапии изучить миграцию генно-модифицированных Т-лимфоцитов в совместном культивировании с опухолевыми клетками. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготовить неадгезивные и адгезивные клетки для совместного культивирования и как использовать коллектор для седиментации клеток для изучения горизонтальной радиальной миграции неадгезивных клеток по монослою опухолевых клеток.