Радиальная Мобильность и цитотоксическую функцию ретровирусных Репликация Векторный Трансдуцированные неприлипшие Alloresponsive Т-лимфоцитов

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы показать миграцию неадгезивных эффекторных Т-лимфоцитов по монослою адгезивных опухолевых клеток. Это достигается путем создания сначала монослоя адгезивных опухолевых клеток в лунках покрытых поли D лизином тефлоновых замаскированных стекол в качестве второго этапа флуоресцентно меченного эффектора, Т-лимфоциты оседают в центре монослоя с помощью клеточного седиментационного коллектора. Затем используется световая и флуоресцентная микроскопия для визуализации миграции неадгезивных клеток по монослою.

Результаты показывают, что миграционные и эффекторные функции неадгезивных Т-лимфоцитов в кокультуре с монослоем адгезивных опухолевых клеток сохраняются после того, как лимфоциты были трансдуцированы ретровирусным вектором. Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что радиальная миграция неадгезивных эффекторных Т-лимфоцитов может быть измерена в культуре угля с адгезивными опухолевыми клетками. Это имеет далеко идущие последствия для пациентов с первичными или метастатическими опухолями головного мозга, поскольку аллогенные цитотоксические Т-лимфоциты, модифицированные для экспрессии пролекарственного активатора гена, такого как цитозиндезаминаза, тестируются в качестве мультимодального подхода к устранению опухоли в головном мозге.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности с установлением адгезивных монослоев опухолевых клеток из-за гетерогенности роста опухолевых клеток в характеристиках адгезии. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы создания ровного монослоя опухоли и эффективного осаждения неадгезивных L-O-C-T-L требуют опытного понимания характеристик обоих типов клеток. Для начала места до четырех стерилизованных.

10 хорошо покрытых тефлоном стекол в стерильную чашку Петри размером 150 на 15 миллиметров. Поставьте рядом со предметными стеклами чашку Петри размером 35 на 10 миллиметров, содержащую два-три миллилитра стерильной воды, чтобы обеспечить влажность. Затем подготовьте предметные стекла, покрыв каждую лунку раствором 100 микрограммов на миллилитр либо поли Д лицина, либо поли Л лизина.

Инкубируйте предметные стекла в течение одного часа при комнатной температуре, затем отасуньте раствор и дважды промойте поверхность лунки PBS с подготовленными лунками для образцов. Соберите сливную колбу с адгезивными опухолевыми клетками. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью световой микроскопии, а затем суспензируйте клетки в концентрации от пяти до 10 до шести клеток на миллилитр.

В буферную питательную среду добавьте от пяти до 10 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку, в зависимости от типа опухолевых клеток, доведите объем лунки до 40 микролитров со средой и медленно пипеткой вверх и вниз для равномерного распределения клеток. После засеивания лунок дайте опухолевым клеткам отстояться при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем накройте чашку Петри крышкой и осторожно перенесите ее в увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и инкубируйте 5% углекислого газа не менее 24 часов.

Ежедневно меняйте питательную среду на лунках, осторожно удаляя часть среды из монослоя и заменяя ее большим объемом свежей полной Т-клеточной среды. Клетки, как правило, сливаются в течение одного-трех дней, чтобы подготовить клетки к осаждению на монослое опухолевых клеток. Соберите неадгезивные Т-клетки и пометьте их красителем для пролиферации клеток в соответствии с протоколом производителя не менее чем за час до начала анализа.

Затем поместите увлажненную камеру, содержащую предметные стекла опухолевых клеток, в шкаф биологической безопасности. Промойте лунки PBS с помощью пипетирования, а затем добавьте в лунки 45 микролитров готовой среды с 10% сывороткой. Наденьте стерилизованный коллектор для осаждения клеток на лунки до тех пор, пока крючок на конце коллектора не коснется дна предметного стекла.

Убедитесь, что среда видна в каналах коллектора. Затем подсчитайте неадгезивные клетки и подсчитайте их в одном-двух умножении на 10 к пятому. Клеток на микролитр в среде.

Аккуратно разрушайте клетки, чтобы устранить любые клеточные кластеры, которые могут препятствовать оседанию клеток. Медленно пипеткой внесите по одному микролитру клеточной суспензии в канал коллектора для каждого. Ну а затем инкубируйте аппарат при комнатной температуре в течение 20 – 30 минут, чтобы клетки в канале осядли на монослое.

После того как ячейки осядут, аккуратно поднимите коллектор прямо вверх, не касаясь предметного стекла. Убедитесь, что гранулы ячеек находятся в окружности канала коллектора. С помощью микроскопа сидящие клетки должны слегка прилегать к монослою, чтобы аккуратно перемещая предметное стекло, гранула не рассеивалась.

Убедившись, что клетки осели, перенесите предметное стекло в инвертированный микроскоп, оснащенный камерой для измерения углекислого газа и влажности. Используйте четырехкратный объектив для светлопольной и многоканальной флуоресцентной визуализации клеток. Получение изображений заданной области в светлопольных и флуоресцентных каналах, а затем добавление полос в микронах с помощью программного обеспечения для захвата изображений.

Храните предметное стекло во влажном инкубаторе между временными точками после того, как будут получены все временные точки. Перетащите файлы изображений в программу редактирования изображений и выберите опцию добавления слоя, чтобы создать файл изображения с несколькими слоями. Объедините световые и флуоресцентные изображения в один слой.

Используйте программное обеспечение для сбора данных, чтобы сделать снимки площади восемь на восемь миллиметров. Программное обеспечение должно быть настроено на автоматическое сшивание захваченных изображений с использованием канала, который лучше всего представлен во всей скважине. Если визуализируются только флуоресцентные каналы, то это должен быть канал для визуализации адгезивных клеток.

Кроме того, изображения могут быть сшиты с помощью программного обеспечения для редактирования изображений. Это делается путем выравнивания областей сохраняемых изображений из одного изображения в другое и наложения изображений друг на друга до тех пор, пока не будет создана полная картина. Сшейте изображения вместе с помощью программного обеспечения для работы с изображениями.

Используйте объединенные изображения для создания карт флуоресценции поверхностной интенсивности с помощью программного обеспечения Image J, чтобы визуализировать агрегацию флуоресцентных Т-клеток или их распределение во времени. Цитотоксические Т-лимфоциты человека, известные как Allo CTL, трансдуцированные с компетентным ретровирусным вектором, кодирующим ген экспрессии изумрудно-зеленого флуоресцентного белка, располагались в центре монослоя клеток глиомы. Через четыре часа все OCTL сформировали видимые агрегаты к 24 часам.

В монослое адгезивных клеток появились пустые участки, свидетельствующие о лизисе опухолевых клеток, и некоторое количество алло-CTL мигрировало за передний край. Флуоресцентно меченные мышиные Allo CTL располагались в центре монослоя флуоресцентно меченых клеток глиомы в течение одного часа Allo CTL, тесно связанного с клетками глиомы, через 48 часов Allo CTL мигрировал от центра поверхностной интенсивности монослоя. Флуоресцентные карты были сгенерированы на основе этих изображений с помощью программного обеспечения image J и показывают существенную миграцию от центра через 48 часов.

Для поддержания здоровых условий культивирования важно ежедневно менять питательную среду для монослоя опухолевых клеток. Кроме того, после освоения оседание неадгезивных клеток должно занять около 20 минут после этой процедуры. Другие методы, такие как отслеживание клеточного пути, могут быть использованы для ответа на вопросы о скорости, с которой алло-CTL мигрируют через монослой, или о времени, когда они находятся в контакте с опухолевыми клетками, выполняющими свои цитотоксические функции.

Этот протокол поможет исследователям в области иммуногенной терапии исследовать миграцию генно-модифицированных Т-лимфоцитов в сокультуре с опухолевыми клетками. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как препарировать неадгезивные и адгезивные клетки в сокультуре и как использовать коллектор седиментации клеток для изучения горизонтальной радиальной миграции неадгезивных клеток по монослою опухолевых клеток.