Méthodes pour l'étude épithéliale Transport Fonction Protein et expression dans Natif Intestin et Caco-2 cellules cultivées en 3D

L’objectif global de ce protocole est de cultiver des cellules intestinales Caco-2 en trois dimensions et de démontrer l’utilisation de la chambre d’Ussing dans des études sur la régulation des transporteurs de sérotonine. Les méthodes présentées ici peuvent répondre à des questions clés dans le domaine du transport épithélial, telles que la régulation du transporteur intestinal de la sérotonine, le SERT. Le principal avantage du Caco-2 3D est qu’il reflète les interactions entre cellules et entre cellules et matrices extracellulaires avec plus de précision que les monocouches.

Et la technique de la chambre d’Ussing permet de mesurer avec précision la fonction de transport dans l’épithélium intestinal. L’implication de la 3D, les cultures Caco s’étend à la découverte de thérapies car ces modèles permettent de cribler des agents contre des maladies associées à une fonction de transport altérée. Bien que cette méthode donne un aperçu de la régulation des transporteurs de sérotonine, elle peut également être appliquée à des études sur d’autres transporteurs d’électrolytes tels que le sodium et le chlorure.

La démonstration visuelle de ces techniques est essentielle, car le décapage de la couche séromusculaire et le montage de la muqueuse intestinale dans les chambres d’Ussing sont difficiles à apprendre. Ishita Chatterjee, instructrice, et Anoop Kumar, boursier postdoctoral de notre groupe, feront la démonstration des procédures de cellules 3D Caco-2. Sangeeta Tyagi, spécialiste principale de la recherche dans mon laboratoire, démontrera l’élimination de la couche séromusculaire de l’iléon de souris.

Shubha Priyamvada et Arivarasu Natarajan, instructeurs de mon laboratoire, feront également la démonstration du montage de la muqueuse dénudée et de son insertion dans les chambres d’Ussing. Pour commencer, décongelez la solution de protéines gélatineuses à facteur de croissance réduit pendant la nuit sur de la glace dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Une fois décongelé, préparez un millilitre ou 500 microlitres d’aliquotes.

Le jour de la culture, prérefroidissez les lames chambrées sur de la glace. Ensuite, ajoutez 30 microlitres de la solution protéique gélatineuse dans chaque puits de la lame de verre à huit puits et étalez-la uniformément. Lors du placage du mélange gélatineux dans la lame ou les plaques de la chambre, il faut prendre soin d’éviter la formation de bulles car les cellules peuvent se détacher.

Placez la boîte de culture dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes pour permettre à la solution de se solidifier. Ensuite, à l’aide de trypsine, détachez les cellules confluentes Caco-2 d’une fiole de culture. Ensuite, comptez les cellules dans un hémocytomètre et centrifugez-les à 500 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Remettez en suspension la pastille cellulaire résultante dans un milieu 3D Caco-2 pour obtenir la suspension de la densité souhaitée. À l’aide de la suspension cellulaire préparée, ensemencez 4 000 cellules par puits sur les lames de la chambre en verre et laissez-les croître pendant 12 à 14 jours dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Pour colorer les cellules, aspirez d’abord le milieu et fixez les cellules avec 400 microlitres de 2 % de PFA.

Continuez à fixer les cellules pendant 20 minutes à température ambiante. Après avoir lavé les cellules deux fois dans du PBS, perméabilisez-les avec une solution de Triton à 0,5 % dans du PBS pendant 15 minutes maximum. Rincez les cellules deux fois dans un tampon de glycine PBS, puis lavez les cellules perméabilisées dans un tampon IF pendant dix minutes à température ambiante.

Bloquez les cellules à l’aide de 5 % de sérum de chèvre normal dans le tampon IF. Ensuite, incubez les cellules avec 200 microlitres d’anticorps primaires dilués dans un tampon IF complété par 1 % de sérum de chèvre pendant une à deux heures à température ambiante. Après l’incubation, laver les cellules trois fois avec un tampon IF.

Incuber des cellules lavées avec 200 microlitres d’anticorps secondaires dilués dans un tampon IF complété par 1 % de sérum de chèvre pendant une heure à température ambiante. Lavez les cellules avec un tampon IF trois fois pendant dix minutes. Pour détacher la chambre de la lame de verre, placez d’abord la diapositive dans le support de base de la diapositive, puis faites glisser le poussoir blanc à travers le support jusqu’à ce qu’il entre en contact avec le bord des puits.

Tirez doucement sur la chambre pour la retirer de la lame. Utilisez une boîte noire couverte pour protéger les diapositives de la lumière. Montez les diapositives avec un support anti-décoloration lent et couvrez-les de lamelles.

Après avoir laissé sécher les lames pendant dix minutes à température ambiante, scellez-les avec du vernis à ongles avant l’imagerie. Isolez l’iléon de souris en suivant la procédure décrite dans le protocole texte. Ensuite, à l’aide de ciseaux, ouvrez l’intestin longitudinalement.

Incuber la section de tissu résultante dans un tampon KBR gazeux glacé contenant une indométacine micromolaire pendant dix minutes. Épinglez une section intestinale d’environ un centimètre de long, côté muqueuse vers le bas, sur une plaque contenant 0,5 centimètre d’épaisseur à 7 % d’agarose ou d’élastomère de silicone durci. À l’aide d’un stéréomicroscope de dissection avec éclairage par le bas, décaper les couches séromusculaires.

Ensuite, coupez la couche séromusculaire avec une lame de scalpel en plumes. À l’aide d’une pince fine, soulevez le bord de la couche le long de l’axe longitudinal de l’intestin. Enfin, montez soigneusement la muqueuse sur les broches du curseur.

Tenez le tissu muqueux dénudé par les bords pour éviter de le déchirer. Lors du montage de la muqueuse iliale dénudée sur les broches du curseur, des précautions doivent être prises pour éviter de déchirer le tissu au niveau des têtes d’épingle et pour minimiser les dommages aux bords du tissu. Avant le traitement des tissus, préparez la solution de Krebs gazée avec 95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone.

Ensuite, versez la solution dans une chambre Ussing. Ajoutez 10 micromolaires de glucose comme substrat énergétique au bain sérosal, et 10 micromolaires de mannitol pour maintenir l’équilibre osmotique au bain muqueux. Par la suite, insérez le curseur avec la muqueuse montée dans la chambre pour exposer à la fois les côtés apical et basolatéral du tissu à la solution de Krebs.

Équilibrez le tissu iléal dans le bain pendant dix minutes. Ensuite, prétraitez le côté apical avec 10 micromolaires de fluoxétine pendant 30 minutes pour la mesure du flux muqueux à sérum. Enfin, traitez la face basolatérale du tissu avec 10 nanogrammes par millilitre de TGF bêta 1 pendant une heure, puis incubez la face apicale avec 20 nanomolaires tritiés 5-HT pendant 30 minutes.

Pour calculer les débits de flux de muqueuse à sérum, prélevez des aliquotes de 0,75 millilitre dans le réservoir sérosal, en les remplaçant par des volumes identiques du milieu de bain pour éviter les différences de pression hydrostatique à travers la muqueuse. Pour quantifier la 5-HT tritiée accumulée dans le tissu, retirez la muqueuse du curseur. Lavez-le une fois avec un tampon KRB glacé et placez-le dans un tube de culture en verre.

Incuber la muqueuse dans 0,5 millilitre de 10 % KOH pendant la nuit à 37 degrés Celsius pour lyser le tissu. Ensuite, mesurez la radioactivité en aliquotes de 150 microlitres des lysats en trois exemplaires à l’aide d’un compteur à scintillation liquide. À l’aide de la méthode Bradford, mesurez la concentration en protéines dans des aliquotes de trois à cinq microlitres de lysats.

On voit ici des kystes Caco-2 cultivés en culture 3D colorés pour l’actine et des kystes 3D Caco-2 colorés simultanément pour l’actine, les noyaux et la protéine SERT. Le SERT est visible dans la membrane luminale et dans les compartiments subapicals. Pour confirmer davantage l’avantage des sphères 3D Caco-2 par rapport aux monocouches 2D de Caco-2, une analyse par transfert Western de l’expression de la protéine SERT a été effectuée.

Les résultats ont montré l’expression accrue de la protéine SERT dans les sphères 3D Caco-2 par rapport aux cellules Caco-2 2D. Enfin, un système de chambre d’Ussing a été utilisé pour montrer que le TGF bêta augmente le flux de la muqueuse à la sérum, reflétant l’augmentation de l’absorption de 5-HT par la membrane luminale et l’augmentation de l’accumulation de 5-HT observée dans la muqueuse iléale. De tels résultats sont corroborés par la sensibilité observée de l’absorption de la 5-HT au traitement par la fluoxétine qui correspond à l’expression du SERT sur la membrane luminale.

Une fois maîtrisée, cette technique de décapage et de montage de la muqueuse iléale peut être réalisée en 15 minutes. Lors de l’adoption de cette procédure, il est important de se rappeler qu’au moment du retrait de l’animal, la préparation intestinale extravio a une viabilité limitée et peut durer jusqu’à trois heures. Les kystes 3D de Caco-2 pourraient être utilisés pour diverses études telles que les événements de trafic membranaire, l’expression génique ou l’interaction protéine-protéine des transporteurs épithéliaux.

Après son développement, la technique 3D Caco-2 ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine du transport intestinal pour explorer le mouvement des fluides et étudier la physiopathologie des maladies dariales. N’oubliez pas que travailler avec de la radioactivité peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que l’utilisation d’EPI et des procédures de décontamination appropriées, doivent toujours être prises. Après avoir regardé cette vidéo, vous serez en mesure de cultiver des cellules Caco-2 dans des cultures 3D et d’utiliser ces cultures pour étudier l’expression des transporteurs épithéliaux.

Vous pourrez également utiliser la chambre d’Ussing pour étudier la fonction de transport de la sérotonine dans l’intestin natif de la souris.